高麗影，馬 梅，王艷梅，寇 航，申玉玉，路福平，黎 明

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

黑曲霉是一種重要的細胞工廠.自 20世紀初發(fā)現(xiàn)黑曲霉在含糖培養(yǎng)基中生長時會產(chǎn)生高濃度檸檬酸以來，黑曲霉被廣泛利用生產(chǎn)檸檬酸等有機酸、抗生素等多種次生代謝產(chǎn)物和工業(yè)用酶制劑[1].隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們開始有目的地對黑曲霉細胞工廠進行合理設(shè)計，以滿足生產(chǎn)各種目的產(chǎn)物的需要.由于啟動子在基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要作用，它不僅控制著轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的起始，也涉及整個代謝網(wǎng)絡(luò)的控制，因此啟動子的類型及其表達調(diào)節(jié)是進行細胞工廠設(shè)計的基礎(chǔ)[2].與其他真菌來源的啟動子一樣，黑曲霉啟動子包括誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子.誘導(dǎo)型啟動子有化學(xué)誘導(dǎo)型[3]和pH誘導(dǎo)型[4]等，組成型啟動子有糖化酶啟動子[5]、環(huán)氧酶啟動子[2]等.即使如此，目前關(guān)于黑曲霉啟動子的數(shù)量仍然比較少，因此需要不斷挖掘新的黑曲霉基因啟動子，這對黑曲霉細胞工廠設(shè)計、代謝調(diào)控和合成生物學(xué)都具有重要意義.

在利用黑曲霉進行甾體羥基化的研究[6]過程中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)加入沃氏氧化物(16，17-α-環(huán)氧黃體酮)時，甾體羥基化效率加強.轉(zhuǎn)錄組分析表明，一種與細胞色素 P450相似的基因轉(zhuǎn)錄水平大幅度提高，這說明該基因可能受到一個誘導(dǎo)型啟動子控制.BLAST比對表明，該基因與黑曲霉 CBS513.88的 An11c0060重疊群上 An11g01980基因高度相似，基因注釋為假定的細胞色素 P450單加氧酶，本實驗室研究表明它具有細胞色素 P450基因的功能.該基因與其他來源的細胞色素 P450基因(GenBank號為：XM_025603499、XM_025655375.1)的主要區(qū)別在于其 N端多 67個氨基酸.因此，把這個基因稱之為細胞色素P450基因.

細胞色素P450(CYP)是一類多功能氧化酶[6]，在真核細胞內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細胞器結(jié)合形成膜蛋白，是一類含有亞鐵血紅素的血紅蛋白的總稱[7].真菌擁有最多樣化的CYP家族，因其生物催化作用被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[8].在真菌中，CYPs在促進真菌代謝的多功能性方面起著關(guān)鍵作用[9]，因此 CYP基因啟動子的研究對研究真菌的代謝調(diào)節(jié)具有重要的意義.目前，已有對細胞色素P450家族 CYP51[10]、CYP6B4和 CYP6B1[11]基因的啟動子的研究，發(fā)現(xiàn)它們均為化學(xué)誘導(dǎo)型的啟動子.本研究按照黑曲霉基因組序列，克隆出細胞色素P450基因(An11g01980)的上游序列作為其啟動子P450區(qū)域進行結(jié)構(gòu)和功能分析.結(jié)果表明，P450基因啟動子是一個組成型啟動子，沃氏氧化物能增強其表達，說明該啟動子可能含有與沃氏氧化物相關(guān)的反應(yīng)元件或增強子元件，證明細胞色素 P450不僅僅是誘導(dǎo)型表達，也可以進行組成型表達.本研究旨在提供一種新的細胞色素 P450表達調(diào)節(jié)方式，為細胞色素P450的表達調(diào)節(jié)研究以及該啟動子的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL-1、黑曲 霉(Aspergillus niger)41671、質(zhì)粒 pPZP-Pepo1、pGEM-T均為本實驗室保存.

1.1.2 主要試劑與工具酶

DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 HindⅢ、AvrⅡ、連接酶，Takara公司；質(zhì)粒快速提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、切膠回收試劑盒，Omega公司；通用型柱式基因組提取試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；底物熒光素(D-Luciferin)，Abcam 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，121℃高壓蒸汽滅菌20min.

PDA培養(yǎng)基：土豆去皮，切塊，按1﹕4加水煮沸30min至土豆塊變軟，用 8層紗布過濾，濾液定容至原體積，在濾液中加入2%葡萄糖，115℃高壓蒸汽滅菌 20min.

麥芽汁培養(yǎng)基：將 130.1g麥芽汁培養(yǎng)基固體粉末溶于水中并定容至1L，121℃滅菌20min.

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)[12]：K buffer 0.8mL，MN buffer 20mL，1% CaCl2·2H2O 1mL，0.01% FeSO410mL，微量元素 5mL，20% NH4NO32.5mL，50%甘油10mL，1mol/L MES 40mL，20%葡萄糖 10mL，pH為5.5，加900.7mL無菌水定容至1L.

K buffer：用 1.25mol/L KH2PO4調(diào)節(jié) 1.25mol/L K2HPO4至pH為4.8，121℃滅菌20min.

MN buffer：溶解 3g MgSO4·7H2O 和 1.5g NaCl于去離子水并定容至100mL，121℃滅菌20min.

IM培養(yǎng)基微量元素：將100mg Na2MoO4·2H2O、100mg ZnSO4·7H2O 、100mg H3BO3、 100mg CuSO4·5H2O、100mg MnSO4·H2O 溶解于去離子水，定容至1L，121℃滅菌20min.

完全培養(yǎng)基(CM)：稱取 20g瓊脂，加水至897mL；高壓滅菌后加入 ASP+N 20mL、50%葡萄糖 20mL、1mol/L MgSO42mL、微量元素 1mL，酪蛋白氨基酸 10mL和酵母提取物 50mL，制成 1L CM培養(yǎng)基.

ASP+N：溶解 2.61g KCl(350mmol/L)、7.48g KH2PO4(550mmol/L)、29.75g NaNO3(3.5mol/L)于去離子水中，用5mol/L KOH調(diào)節(jié)pH為5.5，用去離子水定容至100mL，121℃滅菌20min.

CM 培養(yǎng)基微量元素：將 2.1g ZnSO4·7H2O、0.15g Na2MoO4·2H2O 、0.5g FeSO4·7H2O 、1.1g H3BO3、0.17g CoCl2·6H2O 、5.1g EDTA 、0.16g CuSO4·5H2O、0.5g MnCl2·4H2O 溶解于去離子水，定容至100mL，121℃滅菌20min.

1.2 方法

1.2.1 啟動子的克隆與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)黑曲霉 CBS513.88的 An11g01980基因的上游區(qū)域設(shè)計引物 EP1079F：5′-GTCTAAGCTT CAG TTGGGTCTTGGAAGGGCA-3′(下劃線部分為加入的 HindⅢ酶切位點)和 EP-1R：5′-GAGAGACCTAG GTGCTGGAGTGGGTAGCAAAAGGC-3′(下劃線部分為加入的 AvrⅡ酶切位點).提取黑曲霉基因組為模板進行 PCR擴增，擴增條件：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 1min，30個循環(huán)；72℃延伸5min.擴增出細胞色素P450基因的啟動子片段命名為 PP450，將 PP450片段連接到pGEM-T載體上構(gòu)建出 pT-PP450并進行測序；再將其在啟動子分析網(wǎng)站 GPMiner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)和 EMBOSS(https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上進行結(jié)構(gòu)和功能分析[13].

1.2.2 載體的構(gòu)建與鑒定

將 pT-PP450載體用 HindⅢ和 AvrⅡ酶切，回收啟動子片段并將其連接至經(jīng)相同酶切的表達載體pPZP-Pepo1，轉(zhuǎn)化至E. coli JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR并提質(zhì)粒酶切驗證.將驗證正確的含 PP450質(zhì)粒命名為pPZP-PP450.

1.2.3 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)黑曲霉的轉(zhuǎn)化和驗證

取 0.5μL pPZP-PP450質(zhì)粒加入根瘤農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)混勻，冰浴 20min后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，1800V電擊后立即加復(fù)蘇液，混勻吸出并在28℃搖床復(fù)蘇 3h后，涂布在含 100μg/mL的卡那霉素和20μg/mL的利福平抗性平板；28℃培養(yǎng)3d至轉(zhuǎn)化子長出后，用熒光素酶基因驗證引物(Luc-F：5′-GGAC GCCAAGAACATCAAGAAGGG-3′，Luc-R ：5′-CGA AGAAGGAGAAGAGGGTGGGGA-3′)進行菌落 PCR驗證，得到正確的根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子.

黑曲霉菌株在 PDA斜面上于 35℃孵育 3d，孢子萌發(fā)后用生理鹽水洗脫并過濾至含少量玻璃珠的錐形瓶中打散，用血球計數(shù)板測定孢子液濃度，并在IM 液體培養(yǎng)基中稀釋至每毫升 1×107個分生孢子.同時，將根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子在含有 20μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的10mL LB液體培養(yǎng)基中 28℃、200r/min搖床孵育 24h，在室溫下 2400g離心培養(yǎng)物(1.5mL)10min，再將細胞重懸于 5mL含5μL的0.2mol/L乙酰丁香酮(AS)的液體IM中，28℃、100r/min孵育 5～8h至 A600為 0.6～0.8.將100μL誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌細胞和100μL的真菌分生孢子液(1×107mL-1)混合，將混合物涂布至含 AS的 IM培養(yǎng)基平板的硝酸纖維膜上，于 24℃在黑暗中培養(yǎng)3d.之后，將硝酸纖維膜轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基(含有潮霉素抗性和 200μmol/L頭孢噻污的 CM)中，35℃黑暗培養(yǎng)5d，直到出現(xiàn)單菌落.轉(zhuǎn)接單菌落3次，用微波法提取黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組[14]，用熒光素酶基因驗證引物進行 PCR驗證篩選[15]，得到驗證正確的黑曲霉轉(zhuǎn)化子.

1.2.4 啟動子的強度檢測

按照利用熒光素酶為報告基因檢測黑曲霉啟動子特性的方案進行啟動子強度檢測[16-17]，但根據(jù)本研究的具體需要略有修改.將驗證正確的黑曲霉轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株同時在PDA斜面上活化，培養(yǎng)約3d長出黑色孢子后洗下孢子并計數(shù)至 1×107mL-1.接種100μL孢子液于48孔深孔培養(yǎng)板中，35℃振蕩培養(yǎng).轉(zhuǎn)化子菌株培養(yǎng)分為 3組，即不添加沃氏氧化物組、添加 10μg/mL的沃氏氧化物組、添加 30μg/mL的沃氏氧化物組，每組3個平行.培養(yǎng)12h后在每組培養(yǎng)孔中分別添加 10μL沃氏氧化物溶液或者其溶劑，使 3組中的沃氏氧化物的終質(zhì)量濃度分別為 0、10、30μg/mL，以誘導(dǎo) P450啟動子控制的熒光素酶基因的表達.繼續(xù)培養(yǎng) 12h后在各培養(yǎng)孔中添加100μL底物熒光素溶液(終濃度為 1.4mmol/L).以沒有轉(zhuǎn)化的黑曲霉出發(fā)菌株為對照，按照同樣培養(yǎng)方式進行，只是添加的沃氏氧化物的終質(zhì)量濃度為10μg/mL.添加沃氏氧化物底物后，將培養(yǎng)板放進SpectraMax i3X型酶標儀，用537nm波長每隔5min或 10min測定熒光強度.熒光強度越高，表明 P450啟動子控制的熒光素酶基因表達量越高，說明啟動子活性越強.由于各種影響因素控制一致，因此直接用熒光強度表示啟動子的相對強度.

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子的克隆與結(jié)構(gòu)分析

以黑曲霉基因組為模版，以引物EP1079F和EP-1R擴增目的片段PP450，結(jié)果如圖1所示.結(jié)果與理論大小(1080bp)一致，證明目的片段 PP450克隆成功.

圖1 PP450片段的擴增Fig. 1 Amplification of PP450 fragment

將 PP450片段連接到 pGEM-T載體上構(gòu)建出pT-PP450并進行測序.測序結(jié)果表明，克隆的 PP450序列長 1080bp，與報道的 An11g01980基因上游序列完全一致.用啟動子分析網(wǎng)站 GPMiner和EMBOSS對 PP450片段進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖 2所示，其中陰影部分為預(yù)測的啟動子元件，TSS為轉(zhuǎn)錄起始位點.

圖2 PP450片段的分析Fig. 2 Analysis of PP450 fragment

在翻譯起始位點上游 43bp處為可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)，在 TSS上游有兩個可能的 TATA盒，它們與 TATA盒的保守序列 TATAAAA并不完全一致但高度相似；PP450上還有6個可能的CAAT盒，其中 2個 CAAT盒與其保守序列基本一致，其余 4個 CAAT盒與其保守序列也高度相似；另外，還有 2個 GC盒在 PP450的負鏈上；PP450片段的-864～-106bp處有一段長為 759bp的 CpG區(qū)域.特別有趣的是，在PP450上還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AmyR的 1個可能的結(jié)合位點序列 CCGTATATGGTCCG，這個序列是否真的能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 AmyR并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，還需要實驗證實.PP450啟動子元件的具體信息見表1.

表1 PP450序列的啟動子元件Tab. 1 Promoter elements of PP450 sequence

2.2 pPZP-PP450載體的構(gòu)建與鑒定

將pT-PP450載體與pPZP-Pepo1載體均經(jīng)HindⅢ、AvrⅡ雙酶切和連接后構(gòu)建成所需要的目的載體pPZP-PP450，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109感受態(tài)細胞后，經(jīng)Kana抗性篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒并用HindⅢ和 SpeⅠ進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖 3所示.條帶與理論大小(10000bp和 3000bp)一致，說明目的載體pPZP-PP450構(gòu)建成功.

圖3 pPZP-PP450載體的酶切鑒定Fig. 3 Identification of pPZP-PP450 vector by digestion

2.3 黑曲霉的轉(zhuǎn)化和驗證

將 pPZP-PP450質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌感受態(tài)，將電轉(zhuǎn)液涂布于抗性平板，挑取陽性轉(zhuǎn)化子用熒光素酶驗證引物進行菌落 PCR驗證，結(jié)果如圖 4所示.條帶與理論大小(880bp)一致，證明 pPZP-PP450載體成功電轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌中.

圖4 pPZP-PP450載體電轉(zhuǎn)根瘤農(nóng)桿菌的鑒定Fig. 4 Identification of pPZP-PP450 vector electrotransformed in A. tumefaciens

將轉(zhuǎn)化成功的根瘤農(nóng)桿菌與黑曲霉共培養(yǎng)并涂布于抗性平板，挑取單克隆轉(zhuǎn)化子傳代并用驗證引物進行 PCR驗證，結(jié)果如圖 5所示.條帶與理論大小(880bp)一致，說明 pPZP-PP450載體成功轉(zhuǎn)化至黑曲霉中.

圖5 pPZP-PP450載體轉(zhuǎn)化黑曲霉的鑒定Fig. 5 Identification of pPZP-PP450 vector transformed in A. niger

2.4 啟動子熒光強度的測定

將轉(zhuǎn)化成功的黑曲霉轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株分別在48孔板中培養(yǎng)12h，在相應(yīng)的培養(yǎng)孔中添加10μL誘導(dǎo)劑沃氏氧化物溶液并使其在不同組中的終質(zhì)量濃度分別為 0、10、30μg/mL，24h后均添加 100μL 底物熒光素溶液并進行熒光檢測，結(jié)果如圖6所示.

從圖6可以看出：出發(fā)菌株中添加誘導(dǎo)劑和底物后沒有檢測到熒光信號，說明誘導(dǎo)劑和底物都不產(chǎn)生熒光信號，出發(fā)菌株中沒有熒光素酶基因表達.當(dāng)黑曲霉轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物中只添加底物不添加誘導(dǎo)劑時，檢測到非常強的熒光信號，說明 PP450啟動了熒光素酶基因的表達，表明 P450啟動子是一個組成型的啟動子.當(dāng)黑曲霉轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物中分別加入10μg/mL和 30μg/mL的誘導(dǎo)劑時，熒光信號隨著誘導(dǎo)劑濃度的增加而增強，表明 P450啟動子還受到沃氏氧化物的誘導(dǎo)調(diào)節(jié).這說明 PP450中可能含有與沃氏氧化物有關(guān)的反應(yīng)元件或增強子元件.

圖6 熒光強度檢測Fig. 6 Fluorescence intensity detection

3 結(jié) 語

根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，從黑曲霉基因組克隆出細胞色素 P450基因(An11g01980)的上游片段PP450，并進行結(jié)構(gòu)和功能分折.結(jié)構(gòu)分析表明，該片段具有RNA聚合酶Ⅱ啟動子的結(jié)構(gòu)特征：含有1個標準的起始子序列，起始子上游含有 2個可能的TATA盒、2個CAAT盒和4個與CAAT盒一致序列高度相似 CAAT盒以及 2個 GC盒等啟動子元件.PP450片段的-864～-106bp處有一段長為759bp的CpG區(qū)域.而且，在 PP450上還發(fā)現(xiàn) 1個轉(zhuǎn)錄因子AmyR的結(jié)合位點序列 CCGTATATGGTCCG.功能檢測表明，PP450啟動子是一個組成型啟動子，但添加誘導(dǎo)劑沃氏氧化物后啟動子表達強度增強，推測該啟動子區(qū)域可能含有沃氏氧化物相關(guān)的反應(yīng)元件或增強子，需要進一步實驗進行驗證.PP450啟動子功能的闡明為研究細胞色素P450基因的表達調(diào)節(jié)方式和PP450啟動子的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

致謝：感謝劉曉光教授對啟動子分析的指導(dǎo)！