張祚，周洪莉，周吉銀

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的常見并發(fā)癥，是成人致盲和失明的主要原因。小膠質細胞是視網膜的固有免疫細胞，對維持成人視網膜正常組織結構有重要作用。DR的誘因之一是高血糖并伴有血管滲漏。活化的小膠質細胞內炎癥信號通路激活，釋放有毒介質，增殖和遷移能力增強，導致視網膜神經元凋亡增加，神經纖維層變薄，最終導致視力喪失[1]。

1 視網膜小膠質細胞概述

在健康成人的視網膜中，小膠質細胞主要分布在視網膜的內層，如神經纖維層、神經節(jié)細胞和內、外叢狀層，而外核層幾乎找不到分枝狀的小膠質細胞。在病理條件下，小膠質細胞可見于外核層及視網膜下間隙[2]。正常情況下，靜息狀態(tài)的小膠質細胞通過不斷運動、伸展、收縮和連續(xù)掃描微環(huán)境來監(jiān)視細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。同時監(jiān)測和維持神經細胞的功能狀態(tài)和突觸穩(wěn)定性，保證視力健康[3]。

2 DR

DR 是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，視網膜毛細血管周細胞的丟失和血管通透性增加是DR的早期特征[4]。DR 分為非增生性DR（non-proliferating diabetic retinopathy，NPDR） 和 增 生 性 DR（proliferating diabetic retinopathy，PDR）。NPDR 是第一階段，表現為視網膜血管損傷、血管通透性增加、基底膜增厚、視網膜毛細血管周細胞丟失。NPDR 可進一步發(fā)展為PDR，表現為病理性新生血管生長、玻璃體出血、視網膜瘢痕和牽拉性視網膜脫離，導致不可逆的視力喪失和全盲[5]。糖尿病黃斑水腫可發(fā)生在DR 的任何階段，是由血管通透性增加和蛋白質、脂質向細胞外空間滲漏引起。視網膜血管上皮功能損傷導致細胞外液增多，Müller 細胞收集的細胞外液導致視網膜腫脹，細胞死亡增加，視力損傷和喪失[6]。在DR 的發(fā)病過程巾，小膠質細胞發(fā)生激活、增生、遷移和極化，這些變化可能在糖尿病視網膜神經變性及微循環(huán)調節(jié)障礙的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。

3 DR中的小膠質細胞

3.1 人DR中的小膠質細胞

研究發(fā)現在PDR過程中，阿米巴樣小膠質細胞首先聚集在滲出物周圍并浸潤視神經區(qū)域，隨后擴張的新血管被小膠質細胞大量包圍，表現為微血管外周炎癥。另外，小膠質細胞遷移進入視網膜外核層，與神經節(jié)細胞密切接觸。這提示，反應性小膠質細胞參與DR 的所有階段，甚至可能推動其進展到增生狀態(tài)[8]。

3.2 DR嚙齒動物模型中的小膠質細胞

通過注射鏈脲佐菌素破壞胰島β細胞可制作1型糖尿病模型。大鼠注射鏈脲佐菌素4 周后，小膠質細胞發(fā)生早期激活，在大鼠視網膜中可檢測到高水 平 的 腫 瘤 壞 死 因 子 -α（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細胞介素（interleukin，IL）-1β[9]。在新生大鼠體內注射低劑量鏈脲佐菌素，建立的新生兒高血糖誘導視網膜病變模型中，鏈脲佐菌素能誘發(fā)幼鼠快速而持續(xù)性血糖升高，小膠質激活，并伴隨TNF-α和IL-1β在短時間內上升[10]。

Goto Kakizaki大鼠是Wistar大鼠選擇性繁殖產生的自發(fā)性非胰島素依賴性糖尿病模型。高血糖12個月后，在視網膜外及感光細胞外段與視網膜色素上皮細胞之間的視網膜下間隙出現了大量小膠質細胞。小膠質細胞可能通過早期存在于視網膜色素上皮細胞層中的孔隙遷移。這些反應性小膠質細胞優(yōu)先位于視網膜色素上皮細胞空泡化區(qū)，靠近無序的光感受器外段。小膠質細胞蛋白激酶Cζ（protein kinase C ζ，PKC ζ）可能參與這個信號通路。眼內注射PKCζ抑制劑可降低誘導性一氧化氮合酶的水平，減少小膠質細胞的遷移[11]。

4 DR炎癥反應與小膠質細胞的激活

DR 是視網膜血管和神經元的進行性病變，炎癥反應與DR的發(fā)生和發(fā)展相關。代謝紊亂導致視網膜和身體其他部位的損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的釋放，先天免疫系統提供第一道防線來抵御這些DAMPs。在DR 早期，視網膜血屏障完整，視網膜小膠質細胞和補體系統發(fā)生低水平激活，這是維持內環(huán)境平衡和功能恢復的關鍵因素。但長期的DAMPs刺激會導致先天免疫系統的紊亂和失調，炎癥反應增加[12]，導致小膠質細胞長期活化，表現為小膠質細胞的增殖、遷移及形態(tài)的改變。DR 中小膠質細胞數量增加，說明小膠質細胞的增殖或遷移能力增強[8]。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型中，小膠質細胞的形態(tài)由分枝狀變?yōu)榘⒚装蜆?，并遷移至外叢狀層和光感受器層，而神經節(jié)細胞層中小膠質細胞數量減少。另一項研究發(fā)現糖尿病大鼠的小膠質細胞密度沒有增加，但活化的小膠質細胞數量增加[13]。在嚙齒動物視網膜中，小膠質細胞在藥物誘導糖尿病1 個月后開始活化，4 個月后侵入叢狀內層，14～16 個月后，遷移到外核層和光感受器層[6]。在人類視網膜中，DR的不同階段小膠質細胞都處于激活狀態(tài)，數量增多，并遷移到視網膜內層，聚集在微動脈瘤和視網膜內出血區(qū)周圍。在糖尿病黃斑水腫情況下，整個視網膜和視網膜下間隙都發(fā)現有大量的小膠質細胞[8]。在NPDR 患者的視網膜中，小膠質細胞遷移至叢狀層，數量增多，而在PDR 患者的視網膜中，小膠質細胞數量明顯增多，聚集在缺血區(qū)周圍[14]。

5 小膠質細胞與炎癥介質及信號通路

DR 中的炎癥介質和信號級聯是一個復雜的機制鏈，包括炎性細胞（如小膠質細胞和中性粒細胞等）及炎性介質（如細胞因子、趨化因子、神經毒素、生長因子和粘附分子等）。

5.1 細胞因子

活化的小膠質細胞分泌炎癥細胞因子（如IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等），引起凋亡蛋白Caspase活化，加劇視網膜神經細胞的死亡，導致DR發(fā)生。研究發(fā)現TNF-α和IL-6的升高與2型糖尿病患者胰島素抵抗的程度呈正相關。在動物模型中發(fā)現，糖尿病db/db 小鼠在第5 周齡時，促炎細胞因子TNF-α和IL-6顯著升高。而抗炎細胞因子IL-4和IL-13也出現了升高，這可能反映了一種抗炎代償反應。在第8 周齡時，促炎細胞因子TNF-α和 IL-1β及抗炎細胞因子 IL-10、IL-4 和 IL-13 在 db/db 小鼠體內升高。在20 周齡的糖尿病db/db 小鼠中，所有的促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）仍保持高水平，而抗炎細胞因子中只有IL-4 有所上升。說明在db/db 小鼠中，糖尿病早期的特征是促炎細胞因子和抗炎細胞因子在小鼠體內共存，隨著糖尿病的進展，這種平衡就會被打破，形成促炎內環(huán)境[15]。

5.2 趨化因子

臨床研究發(fā)現在PDR 患者玻璃體標本中趨化因子（如CCL-2、CCL-4、CXCL-9、CXCL-10）的水平顯著升高[16]。視網膜神經元分泌的單核趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）刺激小膠質細胞活化，并通過 p38、ERK 和NF-κB信號通路誘導小膠質細胞釋放TNF-α[17]。

CX3CL1 是一種神經元膜結合趨化因子，可被蛋白酶水解為可溶性趨化因子，并激活小膠質細胞表面的CX3CR1 受體。在缺乏CX3CR1受體的情況下，小膠質細胞反應失調會導致炎癥介導的視網膜神經元損傷。色素性視網膜炎是一種視網膜退化疾病，在CX3CR1敲除小鼠模型中，CX3CR1受體的缺失導致浸潤到感光層的小膠質細胞數量增加，并通過吞噬作用加速感光細胞凋亡[18]。在CX3CR1 敲除糖尿病小鼠模型中，CX3CR1信號缺失導致全身炎癥反應，小膠質細胞活化失調，破壞視網膜血管的完整性[19]。

5.3 神經毒性介質

谷氨酸、caspase-3、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等均為神經毒性介質，其產生可導致神經細胞功能障礙，損傷血管周細胞和內皮細胞。視網膜產生的神經保護介質和毒性介質的不平衡參與了DR 的發(fā)病過程。研究發(fā)現在脂多糖刺激后，激活的小膠質細胞上調谷氨酰胺合成酶的表達，促進谷氨酸轉化為谷氨酰胺，提示小膠質細胞具有清除谷氨酸的代謝系統[20]。阻斷谷氨酰胺合成酶活性會抑制小膠質細胞中胰島素介導的葡萄糖攝取，加劇小膠質細胞的炎癥反應，增加IL-6、ROS 和NO的生成[21]。這些發(fā)現說明激活的小膠質細胞中谷氨酰胺合成酶的上調可能抑制炎癥反應，降低谷氨酸毒性，保護神經元。

作為信號分子，ROS 參與了神經元極性的建立、生長錐延伸、突觸連接和神經網絡的形成等各種過程。但由于其過度活躍，ROS氧化蛋白質、脂質和DNA，通常被認為對細胞功能是有害的。絕大多數對ROS的防御反應被稱為氧化應激，通常與神經退行性疾病中的細胞損傷有關。Ding等[22]發(fā)現激活的小膠質細胞誘導視網膜血管周細胞產生ROS，上調NF-κB-p65 蛋白和caspase-3蛋白表達，促進視網膜微血管周細胞凋亡。

5.4 其它相關分子及信號通路

MicroRNAs 是一種類似于siRNA 內源性的非編碼蛋白質的小RNA分子，也參與了小膠質細胞的活化過程。當腦缺血損傷發(fā)生時，MicroRNA-124 表達上調，其可促進小膠質細胞由M1 型靜息態(tài)轉變?yōu)?M2 型激活態(tài)[23]。 研究發(fā)現MicroRNA-146b-3p 通過抑制糖尿病患者腺苷脫氨酶-2 來調節(jié)視網膜炎癥[24]。MicroRNA-146α也可抑制Toll樣受體-4介導的NF-κB 信號通路激活，減少炎癥因子TNF-α的釋放，從而降低TNF-α對人視網膜微血管內皮細胞的損傷作用，改善視網膜缺血損傷的微循環(huán)[25]。MicroRNA-30a-5p通過促進內皮細胞凋亡而減少病理性血管生成，還通過調節(jié)小膠質細胞的活化狀態(tài)促進組織修復和生理性血管重建[26]。

缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1是細胞對低氧脅迫的關鍵響應因子。HIF-1α亞基在缺氧條件下穩(wěn)定，它通過結合HIF-1β亞基來激活靶基因的轉錄，參與細胞增殖、血管生成和細胞存活。特別是在高度活躍的光感受器中，HIF-1 持續(xù)激活，保護視網膜免受損害。血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1是HIF-1α的靶標產物，激活HO-1信號途徑降低氧化應激可以作為治療DR的一種新的方法[27]。

胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）磷酸化也參與小膠質細胞激活。ERK可以接受不同信號的激活從而產生不同的結果。如晚期糖基化終末產物誘導ERK的磷酸化對于TNF-α的表達是非常重要的[17]，而血管內皮生長因子介導的ERK激活對內皮細胞的生存和再生是必要的[28]。

基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）是一類廣泛存在的鋅依賴性蛋白酶，在器官發(fā)育、炎癥和損傷中發(fā)揮核心作用。MMPs 對糖尿病環(huán)境中的氧化應激高度敏感，其中MMP-2 和 MMP-9 是由過多的 ROS 誘導的，在 DR 患者和動物模型的視網膜中均顯著升高[29]。

STAT3信號通路參與了細胞因子調控血管炎癥的過程。在高糖條件下，小膠質細胞分泌的IL-6 誘導視網膜內皮細胞STAT3 活化，刺激視網膜內皮細胞產生血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），下調了緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 水平，增加了內皮細胞的通透性和血管滲漏。這些結果提示IL-6/STAT3 信號在調節(jié)血管內皮通透性方面有重要作用，并為預防DR提供了治療靶點[30]。

6 小膠質細胞與其它膠質細胞

視網膜中有兩種大膠質細胞：Müller 細胞和星形膠質細胞。Müller 細胞在調節(jié)視網膜代謝、神經和血管功能方面具有重要作用，而星形膠質細胞則是提供營養(yǎng)和調節(jié)支持作用。在正常情況下，Müller細胞是細胞外ATP的一個潛在來源，介導小膠質細胞的動態(tài)變化調節(jié)。炎癥反應中，小膠質細胞可以向Müller 細胞發(fā)出信號，影響Müller 細胞的形態(tài)變化和功能反應。小膠質細胞與Müller細胞之間的雙向交流模式促進視網膜的整體損傷反應的形成。Portillo等[31]發(fā)現CD40誘導Müller細胞釋放ATP，激活小膠質細胞表面的P2X7嘌呤受體，上調炎癥因子的表達，促進糖尿病視網膜炎癥反應。另有實驗發(fā)現，在DR 發(fā)展過程中，小膠質細胞表現出明顯的形態(tài)學改變，Müller細胞通過增加趨化因子CX3CL1 的分泌，上調小膠質細胞表面CX3CR1受體的表達，促進視網膜小膠質細胞的遷移，誘導活化的小膠質細胞浸潤[32]。

在健康的視網膜中，星形膠質細胞只位于神經纖維層，包圍著血管和視網膜神經節(jié)細胞。在DR 中，星形膠質細胞被激活，形態(tài)改變，增殖、遷移并分泌IL-6、MCP-1等細胞炎癥因子。星形膠質細胞和小膠質細胞之間以層粘連蛋白依賴的方式相互作用，引起小膠質細胞的活化，進而調節(jié)視網膜血管分支和內皮細胞的增殖[33]。

7 小膠質細胞與血-視網膜屏障

在健康的視網膜中，血管內皮細胞和周細胞負責營養(yǎng)供應、廢物清除和血-視網膜屏障的形成。DR過程中，增加的毛細血管通透性和毛細血管閉塞是鑒別糖尿病患者并發(fā)癥和疾病進展狀況的主要病理特征。在DR 中可以觀察到小膠質細胞活化、細胞因子增加、血瘀和血管通透性增加[34]。血-視網膜屏障的泄漏使血清蛋白，如細胞因子、趨化因子以及晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）等進入視網膜實質，促進小膠質細胞的活化。實驗發(fā)現AGEs 刺激視網膜神經元細胞表達單核巨噬細胞的趨化因子（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1，MCP-1 通過p38、ERK、NF-κB信號途徑誘導小膠質細胞分泌TNF-α[17]。TNF-α和IL-1β都可以增加視網膜內皮細胞白細胞粘附，提高血管內皮細胞滲透性。其中TNF-α通過PKCζ/NF-κB信號通路降低緊密連接蛋白的表達，減少細胞間的緊密連接，增加視網膜血管內皮細胞通透性。實驗發(fā)現黃芩苷能通過抑制小膠質細胞ERK1/2-NF-κB炎性信號通路的激活，減少TNF-α的表達，減輕血-視網膜屏障的破壞。另外，黃芩苷進一步通過誘導核因子Nrf2 的激活，減少活性氧的產生，從而降低氧化應激損傷，進而削弱TNF-α誘導的血-視網膜屏障損傷[35]。

8 小膠質細胞與血管增生

血管生成是內皮細胞遷移、增殖、血管形成和血管系統重構的過程。在DR 過程中，新生血管的形成是由于促血管生成介質的不平衡和缺血導致新生血管的異常生長，從而干擾視網膜的正常功能。血管生成和炎癥是兩個相互作用的過程，它們共享多個介質和信號通路。因此，小膠質細胞可能通過釋放促血管生成介質（包括細胞因子、生長因子和蛋白酶）來誘導新生血管形成。VEGF 是主要的調節(jié)因子和促血管生成因子，在高血糖和缺氧后血管內皮生長因子水平升高[36]。

DR和黃斑水腫患者的玻璃體標本中促炎細胞因子IL-1β和IFN-γ表達水平顯著升高，IL-13下調，血管內皮生長因子在所有的DR患者中均上調，說明血管內皮生長因子在DR發(fā)展中有重要作用[37]。研究發(fā)現VEGF存在一個小膠質細胞來源的旁分泌途徑，該通路在PDR 的發(fā)展過程中起著至關重要的作用，而綠原酸可以通過阻斷小膠質細胞來源的旁分泌VEGF 的表達，抑制VEGF/VEGFR-2介導的視網膜血管內皮細胞生成反應，減少視網膜新生血管形成，從而控制DR的發(fā)展[38]。

9 小結與展望

小膠質細胞在DR 中扮演著重要的角色，而慢性炎癥現在已經被證實與視網膜的神經退行性病變有關。在早期階段，小膠質細胞活化并釋放炎癥因子，抑制緊密連接蛋白的表達，減少細胞間的緊密連接，增加視網膜血管通透性，導致血-視網膜屏障的破壞。血-視網膜屏障的泄漏使血清蛋白，如細胞因子、趨化因子以及AGEs 等進入視網膜實質，進一步引發(fā)更多的小膠質細胞活化并分泌大量的炎癥細胞因子、神經毒性介質、血管內皮生長因子等，加劇視網膜神經元的死亡和病理性血管增生，導致DR的發(fā)生。另外，視網膜結構復雜，小膠質細胞與其他神經細胞之間的相互作用共同導致了DR的發(fā)生。對小膠質細胞作用機制的深入研究，可以發(fā)現更多的分子介質和信號通路，為進一步通過調控小膠質細胞活化狀態(tài)來治療DR提供思路。