袁思敏，徐 霞，廖 燦，李 茹，張永玲，梁 錚

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510623；2.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗學(xué)院，廣東 廣州 510182；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510120)

自然流產(chǎn)是婦科的常見病之一，發(fā)生率約為15%。其中早期自然流產(chǎn)占全部自然流產(chǎn)的80%[1]。自然流產(chǎn)的病因復(fù)雜，機制尚不明確。據(jù)統(tǒng)計，50%～60%的早期自然流產(chǎn)是由于胚胎染色體異常所致[2]。目前國內(nèi)臨床上主要運用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法對流產(chǎn)胚胎的絨毛組織進(jìn)行染色體核型分析，從而反映胚胎的染色體情況。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QF-PCR)及染色體微陣列分析技術(shù)(chromosomal microarray analysis，CMA)相繼出現(xiàn)。QF-PCR的優(yōu)點在于能快速檢測染色體的非整倍體異常，CMA技術(shù)則能檢測出染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的變異。本文回顧分析了廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心335例早期自然流產(chǎn)患者的胚胎絨毛QF-PCR及CMA檢測結(jié)果，并探討不同年齡孕婦和不同胚胎性別發(fā)生胚胎染色體核型異常的差異。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月1日至2017年1月31日在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)療中心就診的經(jīng)B超檢查發(fā)現(xiàn)胚胎停止發(fā)育，明確診斷為自然流產(chǎn)的335例孕婦。孕婦年齡為22～44周歲，年齡中位數(shù)為31歲；孕周為6～12周；既往無或曾發(fā)生≥1次無顯誘因自然流產(chǎn)；本次妊娠抗磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺微粒抗體等各種自身抗體陰性，并且血清IgA水平正常。排除患有泌尿生殖系統(tǒng)感染或活動性炎癥及內(nèi)外生殖系統(tǒng)解剖異?；蚱髻|(zhì)性病變的病例。研究對象均了解本研究內(nèi)容并同意配合檢測工作，簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

收集研究對象的流產(chǎn)物組織及該孕婦的外周血樣本，提取人類基因組DNA(gDNA)。根據(jù)QF-PCR標(biāo)準(zhǔn)試驗操作流程對所有樣本的gDNA進(jìn)行檢測，鑒定流產(chǎn)胚胎的絨毛組織有無母體組織污染，并初步檢測流產(chǎn)胚胎絨毛樣本是否為13-三體、18-三體、21-三體或性染色體X單體。根據(jù)美國Affymetrix公司的CytoScan 750芯片平臺的標(biāo)準(zhǔn)實驗操作流程對合格的gDNA樣本進(jìn)行檢測，并使用相配套的CHAS軟件對掃描芯片產(chǎn)生的.CEL文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。把分析出的拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)與DGV(含正常人的CNVs)、DECIPHER(含患者的表型及致病性片段)、OMIM(含已知的致病基因)、CAGdb、ISCA(含良性與致病性的CNVs)、UCSC Genome Browser(顯示片段中基因的內(nèi)容及功能)及PubMed等數(shù)據(jù)庫及本實驗室的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，判斷檢測出的CNVs的性質(zhì)。根據(jù)CMA結(jié)果將流產(chǎn)孕婦分為未見異常組、染色體數(shù)目異常組、致病性微缺失/重復(fù)組(致病性CNVs組)、不明確微缺失/重復(fù)組(variants of unknown significance，VOUS)。分別比較各組間孕婦年齡及胚胎性別差異，并統(tǒng)計分析異常核型的種類及檢出率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例數(shù)(n)和百分?jǐn)?shù)(%)進(jìn)行描述，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流產(chǎn)胚胎絨毛QF-PCR檢測結(jié)果

在對335例自然流產(chǎn)患者的絨毛組織進(jìn)行CMA檢測中，取材不合格30例；提取gDNA后，經(jīng)過瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)DNA降解有3例。共302例進(jìn)行了QF-PCR檢測，其中，QF-PCR鑒定存在母體污染的有7例，剩余295例。在295例患者胚胎絨毛組織中QF-PCR檢出異常結(jié)果共76例，異常率為25.76%。QF-PCR檢測結(jié)果異常類型見表1。

表1 QF-PCR檢測結(jié)果異常類型Table 1 Abnormal types of QF-PCR detection results

2.2 流產(chǎn)胚胎絨毛CMA檢測結(jié)果

2.2.1異常率

經(jīng)QF-PCR鑒定gDNA后，實際進(jìn)行CMA檢測的有295例，檢測成功率為100%。在檢測成功的295例患者胚胎絨毛組織中，CMA結(jié)果未見異常CNVs的有96例，占32.54%。異常和/或存在不明確片段的有199例，占67.46%。

2.2.2染色體異常類型

在CMA檢測出異常和/或存在不明確片段的199例中，染色體數(shù)目異常共165例，占總異常的82.91%，以非整倍體異常為主，尤以性染色體單體及16-三體多見。染色體數(shù)目異常分布見圖1。CMA在13-三體、18-三體、21-三體、X單體及三倍體的檢測結(jié)果，與QF-PCR檢測結(jié)果一致。染色體數(shù)目異常類型見表2。

表2 CMA檢測染色體數(shù)目異常核型類型及例數(shù)Table 2 The types and cases of abnormal chromosome number detected by CMA

除單純?nèi)旧w數(shù)目異常外，本研究發(fā)現(xiàn)24個致病性CNVs，涉及16例孕婦，其中2例合并三體，見表3。主要分布在3、5、20、22、X染色體上，見圖1，但未見相同的CNVs重復(fù)出現(xiàn)。臨床致病性CNVs均涉及已知致病基因，在OMIM、ISCA、DECIPHER和PUBMED數(shù)據(jù)上均有與該CNV相似區(qū)域拷貝數(shù)變異的病例報道，相關(guān)臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、骨骼發(fā)育異常、智力低下等。體格或精神方面的發(fā)育遲緩在兒童或成人中具有明顯的臨床表征，而在胚胎時期則可能表現(xiàn)為胚胎停育、胎兒生長受限以致流產(chǎn)。因此，這些區(qū)域所涉及的CNV考慮與早期自然流產(chǎn)有臨床相關(guān)性，診斷為致病性CNVs。這些CNVs長度在0.301～46.870Mb之間，見表3。片段大小在5Mb以下的占58.33%(14/24)，通過比對OMIM、ISCA、DECIPHER和PubMed數(shù)據(jù)，診斷微缺失/微重復(fù)綜合征4例。片段大小在5Mb以上的占41.67%(10/24)，其中2例診斷為貓叫綜合征。

圖1 CMA檢出染色體異常類型分布圖Fig.1 Distribution of chromosomal abnormalities detected by CMA

表3 CMA檢測致病性CNVs類型Table 3 Pathogenic CNVs detected by CMA test

本研究檢出VOUS 62個，見表4。其片段長度在0.204～60.640Mb之間。涉及病例51例，僅存在VOUS的有18例。這些片段不存在于上述所檢索的數(shù)據(jù)庫中。其中6個CNVs(見表4的56～61號CNVs)未包含已知基因,臨床考慮為可能良性CNVs；1個CNVs(見表4的62號CNVs)包含了DECIPHER數(shù)據(jù)庫中患者編號：248531，攜帶的大小分別為370kb(chr10:226 083～596 534)和53kb(chr10:226 083～2 798 911)兩個片段。臨床表型分別包含了自閉癥、關(guān)節(jié)松弛、智力障礙、語言發(fā)育遲緩、小頭畸形、癲癇等，因此考慮該CNVs可能致病。同時，本研究檢出VOUS主要集中在4、5、6、10和22號染色體上，見圖1。

表4 CMA檢測意義不明確CNV類型Table 4 CNV type of variants of unknown significance detected by CMA

序號異常片段片段大小(Mb)31arr19q13.43(56920294～57370445)×30.45032arr2p15(61585880～61834624)×10.24933arr4q21.1(77803210～78182325)×30.37934arr12q22(93239925～93800927)×40.56135arr14q12(30761737～31377083)×30.61536arr17p13.3(525～585504)×30.58537arr8q24.21(128239298～128738481)×30.49938arr14q24.2(70843923～71169474)×30.32639arr4q21.1(77472643～77749161)×30.27740arr19q11q12(28271417～29214176)×30.94341arr13q12.11(20699294～20966903)×30.26842arr5q31.1(134640507～135076022)×30.43643arr8q23.1(108152832～109622398)×11.47044arr9q22.33(101339710～101678356)×30.33945arr22q13.31q13.33(48145833～50788194)×32.64046arr5p15.1(16832107～17862130)×31.03047arr19p13.3(5098335～6289297)×31.19048arr7p15.1p14.3(28618377～28838420)×30.22049arr10p14(6775897～7319819)×30.54450arr10p12.31(20880386～21139316)×30.25951arr17p13.3(525～1008154)×11.01052arr4q12q13.1q21.21(57126377～82092870)×2hmz24.97053arr4q28.3q34.1(132521696～173629849)×2hmz41.11054arr6p22.1(29458476～29777844)×30.31955arr4q27(122176769～122462118)×10.28556*arr2p22.3(34099791～34361545)×10.26257*arr13q21.1(58630720～59112251)×10.48258*arr8p23.3(1220580～1435705)×30.20459*arr16q23.3(82735122～82939477)×30.34660*arr22q12.1(27753449～28111806)×30.35861*arr9q33.1(121027204～121444084)×10.41762﹟arr10p15.3(184165～628967)×30.445

2.3 孕婦年齡與CMA結(jié)果的關(guān)系

根據(jù)CMA結(jié)果將流產(chǎn)孕婦分為未見異常組(96例)、染色體數(shù)目異常組(165例)、致病性CNVs組(16例)、VOUS組(18例)。本研究中自然流產(chǎn)孕婦的年齡中位數(shù)是31歲(22～44歲)。其中，染色體數(shù)目異常組孕婦年齡中位數(shù)是32歲(22～44歲)；致病性CNVs組孕婦年齡中位數(shù)是29歲(23～38歲)；VOUS組孕婦年齡中位數(shù)是30歲(25～36歲)；未見異常組孕婦年齡中位數(shù)是31歲(23～40歲)。染色體數(shù)目異常組孕婦與未見異常組孕婦年齡比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.638，P<0.05)。

根據(jù)孕婦年齡進(jìn)一步分為5個年齡段：<25歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲、≥40歲。<25歲、25～29歲、30～34歲孕婦流產(chǎn)胚胎絨毛染色體數(shù)目異常的發(fā)生率波動在50.00%左右；35～39歲組、≥40歲孕婦染色體數(shù)目異常的發(fā)生率明顯升高。25歲以后，隨著孕婦年齡的增高，染色體數(shù)目異常發(fā)生率增高，VOUS發(fā)生率降低，而致病性CNVs的發(fā)生率波動在5.00%左右。40歲以上孕婦流產(chǎn)胚胎絨毛CMA未檢出致病性CNVs及VOUS，見表5。

表5 不同年齡段孕婦流產(chǎn)胚胎絨毛CMA結(jié)果[n(%)]Table 5 CMA results of aborted embryo villi in pregnant women of different ages [n(%)]

2.4 胎兒性別與CMA結(jié)果的關(guān)系

CMA檢測出男性胚胎149例，女性胚胎146例。男女胚胎比例為1.02∶1。在未見異常組中，男性胚胎占57.29%，高于女性胚胎占比(42.71%)。VOUS組中，男性胚胎占77.78%，明顯高于女性胚胎(22.22%)。然而，在染色體數(shù)目異常組中，男性胚胎(43.64%)少于女性胚胎(56.36%)。染色體數(shù)目異常組與未見異常組、VOUS組胚胎性別比例差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為4.53、7.60，均P<0.05)，見表6。

表6 不同類型流產(chǎn)胚胎絨毛CMA結(jié)果胎兒性別分布[n(%)]Table 6 The gender distribution of fetuses with different abortive embryo villi CMA results[n(%)]

3 討論

3.1 應(yīng)用QF-PCR技術(shù)結(jié)合CMA技術(shù)對流產(chǎn)胚胎絨毛染色體進(jìn)行檢測有優(yōu)越性

3.1.1本研究方法能有效提高流產(chǎn)胚胎絨毛染色體檢測的成功率及準(zhǔn)確率，縮短檢測時間

目前，對流產(chǎn)胚胎絨毛染色體核型分析普遍使用傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法，需要對絨毛細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對標(biāo)本的取材及技術(shù)人員的要求比較高。據(jù)報道應(yīng)用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法對流產(chǎn)胚胎絨毛染色體進(jìn)行分析，細(xì)胞培養(yǎng)成功率在58.62%～98.30%之間[3-8]。而且檢測分辨率低，只能檢測到5～10Mb以上的染色體異常。CMA技術(shù)及QF-PCR技術(shù)是從分子水平檢測體細(xì)胞染色體的分析技術(shù)，無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通過檢測樣本的gDNA，分析樣本染色體。QF-PCR技術(shù)具有檢測快速、成本低、操作容易等優(yōu)點。CMA技術(shù)在染色體檢測上具有高通量的優(yōu)勢，能一次性檢測并分析整個基因組的拷貝數(shù)，檢測準(zhǔn)確率高。本研究中，CMA檢測成功率為100%。除染色體數(shù)目異常外，本研究檢測出片段在0.301～46.870Mb的致病性CNVs，明確診斷4例微缺失/微重復(fù)綜合征及2例診斷為貓叫綜合征。并檢測出片段在0.204～60.642Mb之間的不明確CNVs。

3.1.2本研究方法能有效避免傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測方法中母體組織污染問題

傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法由于無法鑒別貼壁生長的細(xì)胞是絨毛組織細(xì)胞還是母體的脫膜細(xì)胞，故不能排除因混入母體組織造成結(jié)果誤判風(fēng)險。本研究方法通過QF-PCR技術(shù)能對樣本否存在母體組織的污染進(jìn)行檢測。本研究通過QF-PCR技術(shù)，排除了7例存在母體組織污染的標(biāo)本。

3.1.3本研究方法分辨率高，能提高流產(chǎn)胚胎絨毛染色體異常檢出率

CMA技術(shù)檢測分辨率高，精確定位變異區(qū)段的位置[9-10]，而且，其檢測的范圍更廣，能夠鑒別雜合性缺失(LOH)、單親二倍體(UPD)，以及遺傳一致性區(qū)域(IBD)[11]。本研究總異常率為67.46%，明顯高于本實驗室使用傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)檢測流產(chǎn)胚胎絨毛染色體核型的異常率[11]。

由此可見，結(jié)合應(yīng)用CMA技術(shù)和QF-PCR技術(shù)對流產(chǎn)胚胎絨毛進(jìn)行檢測，能克服傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法的缺點，提高檢測的成功率和異常率。然而QF-PCR技術(shù)及CMA技術(shù)不能檢測染色體結(jié)構(gòu)異常，對多倍體及低比例嵌合體檢測不敏感。因此，我們也不能排除在CMA結(jié)果為未見異常CNVs的病例，存在以上情況的染色體異常。

3.2 染色體非整倍體異常是自然流產(chǎn)的主要病因

本研究中，流產(chǎn)胚胎絨毛染色體異常發(fā)生率為67.46%，以非整倍體異常為主。其中，又以常染色體三體及性染色體單體常見。與既往研究報道[12-13]相符。這種染色體數(shù)目畸變的主要發(fā)生源自雙親之一方的配子形成時或妊娠初期受精卵卵裂時出現(xiàn)了某號染色體不分離，則導(dǎo)致該染色體增多或減少一條。本研究發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)胚胎絨毛的非整倍體異常發(fā)生在除1號、3號、5號、12號、19號以外的染色體上，并且具有明顯的集中性。根據(jù)以往報道，近90%的三體型發(fā)生于13號、16號、18號、21號、22號上[14]。本研究中以上染色體占所有三體的發(fā)生率雖然僅為57.58%，但也能清晰反映這種集中性的存在。出現(xiàn)這種情況的機制目前尚不明確，尚需要得到更多的流行病學(xué)資料支持。

3.3 孕婦年齡與流產(chǎn)的關(guān)系

3.3.1隨著孕婦年齡增長，胎兒染色體非整倍體異常的幾率增高

一般認(rèn)為孕婦高齡是染色體異常胎兒發(fā)病率高的原因之一。本研究中自然流產(chǎn)孕婦的年齡中位數(shù)為31歲。從表5可以看出，年齡在25歲以下的孕婦，流產(chǎn)胚胎絨毛CMA檢出50%為染色體數(shù)目異常；年齡在25歲以上的孕婦，流產(chǎn)胚胎絨毛CMA結(jié)果提示染色體數(shù)目異常的比例隨著孕婦年齡增長明顯增高。由此可以推斷，隨著孕婦年齡增長，胎兒發(fā)生染色體數(shù)目異常的幾率增加。這是因為，隨著孕婦年齡增長,卵巢微環(huán)境發(fā)生改變,卵母細(xì)胞逐漸老化[15]。老化的卵母細(xì)胞中染色體紡錘體也隨之老化，致使分裂時染色體不分離的幾率增高。

3.3.2孕婦年齡增長對致病性CNVs的檢出影響不大

年齡在25歲以下的孕婦，流產(chǎn)胚胎絨毛CMA檢出14.29%為致病性CNVs，明顯高于其他25歲以上孕婦。盡管25歲以上孕婦，流產(chǎn)胚胎絨毛CMA結(jié)果為未見異常CNVs的比例隨著年齡的增長而減少，但檢出致病性CNV及VOUS的比例并沒有隨孕婦年齡增長出現(xiàn)明顯變化。這可能是因為本研究中該年齡段孕婦例數(shù)較少所致，需要通過樣本量更大的研究來完善并作出更準(zhǔn)確的推斷。綜合上述情況，孕婦年齡增長是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的原因之一。

3.4 胚胎性別與流產(chǎn)的關(guān)系

女性胚胎更容易發(fā)生染色體數(shù)目異常。男性胚胎，則更容易發(fā)生染色體數(shù)目異常以外的染色體異常。本研究按照CMA結(jié)果進(jìn)行分組并對各組不同胚胎性別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在CMA結(jié)果為未見異常組及VOUS組中，男性胚胎比例明顯高于女性胚胎，此現(xiàn)象在VOUS組更為突出；然而，在染色體數(shù)目異常組中，女性胚胎比例高于男性胚胎。未見異常組與染色體數(shù)目異常組性別比較差異有統(tǒng)計意義。CMA結(jié)果未見異常組的性別差異，提示在男性胚胎中還存在染色體異常之外的其他誘發(fā)自然流產(chǎn)的重要機制。此研究結(jié)果與既往研究報道的結(jié)果[16-17]不相符。我們考慮：一方面，既往研究主要采用傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法對自然流產(chǎn)胚胎絨毛進(jìn)行檢測，無法排除母體組織污染造成結(jié)果誤判導(dǎo)致的女性胚胎結(jié)果增多。而且傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法無法檢測5Mb以下的染色體異常，可能對統(tǒng)計胚胎性別造成干擾。另一方面，CMA技術(shù)的缺陷導(dǎo)致漏檢染色體結(jié)構(gòu)異常、部分多倍體及低比例嵌合等的異常，也會對胚胎性別統(tǒng)計結(jié)果造成干擾。同時，對于CMA檢測出的VOUS，其對自然流產(chǎn)的致病性尚不明確，尚需要進(jìn)一步研究。因此，應(yīng)用CMA技術(shù)對胚胎性別與自然流產(chǎn)關(guān)系進(jìn)行研究，需要結(jié)合傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法及采集更多的流行病學(xué)資料，才能得到更全面的分析結(jié)果。

綜上所述，隨著孕婦的年齡增長，胚胎發(fā)生染色體非整倍體異常幾率增多，胚胎發(fā)生染色體微缺失/微重復(fù)異常幾率則未見受到影響。自然流產(chǎn)中胚胎是否存在性別特異性淘汰現(xiàn)象在本研究中未能確定。CMA技術(shù)，作為一門新發(fā)展的技術(shù)，是傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的有益補充。其結(jié)合QF-PCR技術(shù)應(yīng)用于自然流產(chǎn)病因分析上，能突破傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的局限性，快速、準(zhǔn)確檢測出染色體的非整倍體異常，并能更精確細(xì)致地檢測出染色體微缺失/重復(fù)異常，建議作為傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法的補充。同時，我們也建議，醫(yī)師在給患者臨床咨詢意見時，對于流產(chǎn)胚胎絨毛CMA結(jié)果檢出致病性CNVs的患者，尤其是致病性CNVs片段長度在5Mb以上的，應(yīng)該結(jié)合夫婦雙方外周血染色體核型結(jié)果進(jìn)行全面分析。