王藝璇，郭立華 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春130033

膀胱癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率和發(fā)病率在我國(guó)所有泌尿系統(tǒng)腫瘤中均排名第一[1, 2]，其復(fù)發(fā)率高、患者預(yù)后較差[3]。微小RNA122(miR-122)是與腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一，在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同，既是腫瘤促癌因子又是抑癌因子[4, 5]。前期研究顯示，miR-122在膀胱癌組織及細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲、體外集落形成能力和體內(nèi)血管生成能力[6]。轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)可通過(guò)磷酸化和去磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[7]，其在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，是膀胱癌患者預(yù)后不良的分子標(biāo)志物[8]。研究顯示，miR-122可通過(guò)靶向抑制CREB1而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[9]，CREB1是否作為miR-122的靶基因而參與膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲及其相關(guān)的下游通路目前均尚不明了。為此，我們于2019年1月～2020年3月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：膀胱癌J82細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，miRNA提取試劑盒購(gòu)自上海玉博生物試劑有限公司，ULtraRT 一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，雙熒光素酶基因報(bào)告試劑盒和蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物試劑有限公司，MTS試劑購(gòu)自美國(guó)Biovision公司，CREB1、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)均購(gòu)自于美國(guó)Proteintech公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Thermo公司。引物：miR-122、CREB1、內(nèi)參U6和GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。質(zhì)粒：miR-122模擬物(miR-122 mimic)、CREB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒、CREB1野生型質(zhì)粒(CREB1-wt)和CREB1突變型質(zhì)粒(CREB1-mut)均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 miR-122與CREB1的靶向調(diào)控關(guān)系分析 采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)程序顯示，miR-122與CREB1啟動(dòng)子區(qū)存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。將J82細(xì)胞以3×103/孔接種到96孔板中，接種24 h后分為四部分，采用LipofectamineTM2000分別進(jìn)行CREB1-wt、CREB1-mut與miR-122 mimic、對(duì)照質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h，采用雙熒光素酶基因報(bào)告試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

圖1 TargetScan7.1軟件預(yù)測(cè)程序顯示miR-122與CREB1之間存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染 將J82細(xì)胞置于含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，胰酶消化收集細(xì)胞。將J82細(xì)胞分為三組，共轉(zhuǎn)染組采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-122 mimic及CREB1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，miR-122 mimic組轉(zhuǎn)染miR-122 mimic，對(duì)照組轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h。

1.4 轉(zhuǎn)染效果檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集各組細(xì)胞，采用miRNA提取試劑盒獲得細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。采用ULtraRT一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)一步擴(kuò)增。miR-122上游引物5′-TATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3′、下游引物5′-GCCCGTGGAGTGTGACAATGGT-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。CREB1上游引物5′-CTTTTCTCCGGAACACAGATTTC-3′、下游引物5′-GATTTGCCAAGTGGGAGGGA-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′、下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。PCR反應(yīng)體系：2×ULtraRT一步緩沖液12.5 μL、RNA 1 μL、上下游引物各1 μL、ULtraRT一步酶混合液0.5 μL，用無(wú)RNA酶的雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)變性退火延伸循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-122、CREB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖能力觀察 ①M(fèi)TS法：胰酶消化收集1.3中的各組細(xì)胞，以2×103/孔接種至96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTS試劑與細(xì)胞共同孵育1 h。采用全波長(zhǎng)掃描儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，OD值越高表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。②平板克隆實(shí)驗(yàn)：胰酶消化收集1.3中的各組細(xì)胞，以2×102/孔接種至6孔板中，混勻后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時(shí)更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)2周左右肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆團(tuán)形成時(shí)終止培養(yǎng)，甲醇固定、吉姆薩染色后計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)?？寺⌒纬蓴?shù)越多,表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.6 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。胰酶消化收集1.3中的各組細(xì)胞，采用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，去除FBS和胰酶。將1×104個(gè)細(xì)胞重懸至100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻后加至Transwell小室的上室中，將500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基加至Transwell小室的下室中。放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，下室可見(jiàn)由上室穿過(guò)膜進(jìn)入的細(xì)胞時(shí)終止培養(yǎng)。甲醇固定、吉姆薩染色后計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞穿膜數(shù)越多表示細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。

1.7 細(xì)胞CREB1及Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。各組轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液進(jìn)行裂解。離心去除細(xì)胞碎片，獲得細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞總蛋白與上樣緩沖液混勻后，經(jīng)沸水煮沸變性。變性的蛋白上樣進(jìn)行凝膠電泳，并采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜置于8%牛奶中，室溫孵育1 h。加入CREB1、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、內(nèi)參蛋白GAPDH一抗(稀釋比例均為1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫孵育2 h。TBST沖洗3次，采用ECL顯示蛋白條帶;Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果 共轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒+CREB1-mut或miR-122 mimic+CREB1-mut的J82細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.00±0.10、0.92±0.13(P>0.05)，共轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒+CREB1-wt或miR-122 mimic+CREB1-wt的J82細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.00±0.06、0.57±0.09(P<0.01)。

2.2 各組細(xì)胞miR-122、CREB1 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞miR-122、CREB1 mRNA表達(dá)比較

2.3 各組細(xì)胞增殖、侵襲能力比較 見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞增殖OD值、克隆形成數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)比較

2.4 各組細(xì)胞CREB1及Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞CREB1及Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

3 討論

膀胱癌是最常見(jiàn)的惡性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤之一，是尿路上皮演變而來(lái)的尿路上皮癌[1]。根治性膀胱切除術(shù)和全身化療是治療膀胱癌的主要方法，但其總體治療效果有限，患者的5年生存率較低，高復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的重要原因[3]。闡明膀胱癌發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的臨床意義，有助于探索膀胱癌新的治療靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)更有效的靶向藥物。

miRNA是一類(lèi)保守的內(nèi)源性非編碼RNA分子，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后誘導(dǎo)降解或抑制靶信使RNA(mRNA)的翻譯來(lái)調(diào)控靶基因，并參與調(diào)節(jié)如細(xì)胞發(fā)育、分化和運(yùn)動(dòng)等各種細(xì)胞功能。超過(guò)50%的miRNA位于與腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來(lái)，miRNA作為抗癌藥物的靶點(diǎn)被廣泛研究[10]。盡管膀胱癌組織中已經(jīng)鑒定出許多差異表達(dá)miRNA，但尚未開(kāi)發(fā)出有效的臨床藥物。miR-122是在脊椎動(dòng)物中表達(dá)高度保守的肝臟特異性miRNA，在肝細(xì)胞肝癌中是一種新型的腫瘤抑制因子[4]。miR-122在卵巢癌和胃癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展[11, 12]；但是，在結(jié)直腸癌和腎癌等腫瘤中miR-122發(fā)揮促癌作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[5,13]。以上提示miR-122與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是發(fā)揮的作用并不一致。Wang等[6]報(bào)道，miR-122在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均降低，過(guò)表達(dá)miR-122在體內(nèi)和體外均可抑制膀胱癌細(xì)胞HT1376的惡性生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-122 mimic后，J82細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低，說(shuō)明miR-122 在膀胱癌中可發(fā)揮抑癌作用。

miRNA通常通過(guò)與3′-UTR的互補(bǔ)堿基配對(duì)來(lái)抑制mRNA翻譯，并降低mRNA穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究報(bào)道，miRNA可調(diào)節(jié)多種癌基因或抑癌基因，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。在卵巢癌中miR-122通過(guò)靶向脯氨酰-4-羥化酶亞基α-1(P4HA1)基因發(fā)揮抑癌作用[11]，在膀胱癌中miR-122通過(guò)靶向促癌基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC)的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖和侵襲[6]。每一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，CREB1是原癌基因轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)其靶基因表達(dá)，參與代謝和DNA修復(fù)[7]。研究報(bào)道，CREB1表達(dá)升高可促進(jìn)乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的進(jìn)展，為腫瘤促癌基因[14, 15]。Rao等[9]報(bào)道,在胃癌中CREB1可作為miR-122的直接作用靶點(diǎn)，參與miR-122對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制作用。本研究采用TargetScan7.1軟件預(yù)測(cè)miR-122與CREB1啟動(dòng)子區(qū)具有連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，并且雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在J82細(xì)胞中miR-122可靶向負(fù)調(diào)控CREB1。本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CREB1過(guò)表達(dá)可以減弱miR-122對(duì)J82細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制作用，表明miR-122可通過(guò)負(fù)向靶控CREB1而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

在乳腺癌中，miR-122通過(guò)靶向IGF1R調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號(hào)途徑而發(fā)揮作用[16]。Akt的激活或過(guò)度表達(dá)是腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志;mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是許多腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和其他生物學(xué)進(jìn)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[16]。在包括膀胱癌在內(nèi)的各種腫瘤進(jìn)展中,Akt/mTOR信號(hào)途徑均發(fā)揮促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，miR-122可抑制膀胱癌細(xì)胞Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，但是CREB1可以減弱miR-122的這種作用。以上結(jié)果均表明，miR-122通過(guò)作用靶點(diǎn)CREB1負(fù)向調(diào)控Akt/mTOR通路，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲。