時沙沙， 賈添慧， 楊明樹， 董 蕾， 李 聰， 王永杰， 喻勇新

(上海海洋大學 食品學院，上海 201306)

諾如病毒(Norovirus, NoVs)隸屬于杯狀病毒科、諾如病毒屬，是主要的食源性病毒，能夠在全世界范圍內所有年齡段人群中引起非細菌性急性腸胃炎[1]，常見癥狀包括腹瀉、嘔吐、惡心、腹部絞痛、發(fā)冷、頭痛、脫水和高燒[2]。諾如病毒分為十個基因類群(GI～GX)[3]，其中GI、GII、GIV型諾如病毒能夠感染人類，但GIV型諾如病毒很少被檢出，GI、GII型諾如病毒是引起人類非細菌性急性腸胃炎的主要病原體[4]。諾如病毒具有很強的傳染性[5-6]，主要通過糞-口途徑進入人體，直接與被污染的環(huán)境表面或感染者接觸而傳播[7]。在美國，每年約有550萬人被諾如病毒感染，感染案例在31種主要的食源性病毒引起的疫情中占比約58%[8]。雙殼貝類通過濾食作用從養(yǎng)殖的水環(huán)境中獲取食物，從而富集水環(huán)境中原有的或者人類排泄到水環(huán)境中的污染物，污染物包含許多造成人類疾病暴發(fā)的病原體[9]，濾食特性使雙殼貝類成為諾如病毒的主要載體，是引起諾如病毒疫情暴發(fā)的高風險食物[10]。我國沿海地區(qū)的居民，有生食貝類的習慣，引起諾如病毒疫情暴發(fā)與傳播在我國尤為嚴重[11]。近年來我國關于雙殼貝類中諾如病毒的檢測工作主要圍繞牡蠣、貽貝等進行[12-14]，但樣本大多來源于市場，僅少部分研究人員進行過養(yǎng)殖場內雙殼貝類的污染狀況調查[13-14]，且相關研究中也鮮有將檢測到的諾如病毒進行具體分型。因此中國沿海地區(qū)養(yǎng)殖場內貝類中諾如病毒的污染情況和基因型分布特點有待進一步研究。浙江省舟山市枸杞島貽貝養(yǎng)殖場屬于省級萬畝貽貝養(yǎng)殖示范區(qū)。為了解該養(yǎng)殖場貽貝諾如病毒的污染程度和基因型分布特點，進一步探究主要常住居民活動是否對養(yǎng)殖場貽貝中諾如病毒的污染存在一定影響，為我國貝類諾如病毒污染的防控工作和貝類養(yǎng)殖方式的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持，本研究將浙江省舟山市枸杞島后頭灣(約11.81 km2)和龍泉村(約0.92 km2)兩個主要的海上養(yǎng)殖場作為采樣地，根據(jù)距離人類活動區(qū)域的遠近，在每個養(yǎng)殖場設定近岸和遠岸采樣區(qū)域，于2019年4月和9月進行樣本采集和諾如病毒檢測，并對諾如病毒污染率與基因型多樣性進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)，采自浙江省舟山市枸杞島貽貝養(yǎng)殖場。

1.1.2 試劑與儀器 RNA酶抑制劑(南京諾維贊生物有限公司)；動物組織RNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；一步法逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction， RT-PCR)試劑盒、PCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司)；100 bp DNA Ladder(北京天根生化科技有限公司)；FastPre-24 MP組織均質器(美國MP Biomedicals公司)；超凈工作臺(ACB-4A1，新加坡ESCO公司)；生物安全柜(AC2-4S1-CN，新加坡ESCO科技有限公司)；5331 PCR儀、5382000074恒溫混勻金屬浴、5702R臺式低溫離心機(艾本德中國有限公司)；PowerPac HC電泳儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)和凝膠成像分析儀(上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 采樣點設計 根據(jù)2018年11月進行的實地考察情況，在浙江省舟山市枸杞島貽貝養(yǎng)殖場設定兩種采樣區(qū)域：后頭灣養(yǎng)殖場和龍泉村養(yǎng)殖場，將每個養(yǎng)殖場劃分近岸和遠岸采樣線，根據(jù)GPS測量儀測定的具體位置(圖1)(https://earth.google.com/web/)，在較大的后頭灣養(yǎng)殖場設定10個近岸采樣點(A1～A10)及8個遠岸采樣點(B1～B8)，同時在較小的龍泉村養(yǎng)殖場第一次采樣設置6個近岸(C1～C6)和6個遠岸采樣點(D1～D6)，第二次采樣適當增加采樣點，設置8個近岸(C1～C8)和8個遠岸采樣點(D1～D8)。

1.2.2 樣本采集 于各采樣點采集貽貝并標記采樣信息，置于冰上暫時保存，用于后續(xù)檢測。第一次采樣，在各采樣點采集11只貽貝樣本，總數(shù)為330只。第二次采樣，在各采樣點采集10只貽貝樣本，總數(shù)為340只。兩次共采集670只貽貝樣本。

1.2.3 樣本預處理 于超凈工作臺中進行貽貝解剖，取約50 mg的消化腺組織放入已加入RNA酶抑制劑的離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 樣本總RNA提取 采用MP組織破碎儀將冷凍保存的消化腺組織破碎均勻并依據(jù)動物組織RNA提取試劑盒操作說明進行總RNA的提取，將提取所得總RNA溶液置于冰上并立即進行巢式RT-PCR檢測。

1.2.5 巢式RT-PCR檢測 巢式RT-PCR使用諾如病毒GI型引物(COGIF/GISKR和 NGIOF/NGIOR)和GII型引物(COG2F/G2SKR和G2SKF/G2SKR)(見表1)[4,15-16]進行，采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測(GI: 168 bp, GII: 343 bp)。參照逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒操作說明配制體系，具體反應體系如下：取 1 μL逆轉錄酶、12.5 μL 2×RT-PCR 緩沖液、1 μL上、下游GI和GII型引物于PCR 反應管中，加入1 μL RNA 模板，RNase-free ddH2O 補足至25 μL。第一輪RT-PCR程序為50 ℃保持 30 min，在逆轉錄酶的作用下，將單鏈 RNA 反轉錄成 cDNA(complementary-DNA)，94 ℃預變性2 min，30個循環(huán)：94 ℃變性 0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min。將第一輪 RT-PCR 的產(chǎn)物稀釋10倍并取1 μL作為Nested-PCR的模板，Nested-PCR反應體系如下：取12.5 μL的2×PCR 緩沖液、1 μL上、下游GI和GII型引物(見表1)、1 μL的模板于PCR反應管中，ddH2O補足至25 μL。 Nested-PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min，40個循環(huán)：94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火保持0.5 min，72 ℃延伸0.5 min。最后在72 ℃保溫15 min加poly-A尾，以便進行后續(xù)的TA 連接和測序試驗。

圖1 各養(yǎng)殖場采樣點分布示意圖Fig.1 Sampling location of each farma：后頭灣養(yǎng)殖場； b：龍泉村養(yǎng)殖場(第一次采樣)； c: 龍泉村養(yǎng)殖場(第二次采樣)。A1～A10:后頭灣近岸采樣點； B1～B8:后頭灣遠岸采樣點；C1～C6/C1～C8:龍泉村近岸采樣點； D1～D6/D1～D8：龍泉村遠岸采樣點；采樣點下方為GPS定位信息a: Houtou Bay farm; b: Longquan Village Farm(First time); c: Longquan Village Farm(Second time). A1-A10: near-shore sampling sites at Houtou Bay; B1-B8: off-shore sampling sites at Houtou Bay; C1-C6/C1-C8: near-shore sampling sites at Longquan Village; D1-D6/D1D8: off-shore sampling sites at Longquan Village location information by GPS of each sites was shown at the bottom of the sampling sites

表1 本研究所用引物

1.2.6 測序與基因型確定 經(jīng)濃度測定和電泳檢測后，將顯示陽性條帶的PCR產(chǎn)物送至生工(上海)生物工程有限公司進行測序，測序引物為Nested-PCR。測序成功的序列導入Norovirus Genotyping Tool(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool)在線軟件中進行在線分析，初步確定該株諾如病毒的基因型。

2 結果與分析

分別在2019年4月和9月對枸杞島后頭灣養(yǎng)殖場和龍泉村養(yǎng)殖場進行兩次樣本采集，共檢測貽貝670只，其中諾如病毒陽性率約為9.9%(66/670)。

2.1 第一次采樣結果

2.1.1 后頭灣養(yǎng)殖場 ①諾如病毒檢出率：檢測貽貝198只，每個采樣點的樣本檢測情況如表2所示，其中近岸與遠岸貽貝樣本諾如病毒陽性率分別為11.6%(23/198)和3.5%(7/198)； ②諾如病毒基因型分布：共檢出諾如病毒陽性貽貝30只，覆蓋的基因型包括GI.4(43.3%)、GI.3(30%)、GII.3(13.3%)、GII.17(10%)和GII.12(3.3%)(圖2)。

圖2 后頭灣養(yǎng)殖場第一次采樣貽貝諾如病毒基因型及所占比例Fig.2 Genotypes and proportion of norovirus in mussels for the first sample at Houtou Bay

表2 后頭灣養(yǎng)殖場各采樣點第一次采樣貽貝諾如病毒檢測結果

2.1.2 龍泉村養(yǎng)殖場 ①諾如病毒檢出率：檢測貽貝132只。每個采樣點的樣本檢測結果見表3。其中近岸與遠岸樣本諾如病毒陽性率分別為9.8%(13/132)和6.1%(8/132)。②諾如病毒基因型分布：檢出諾如病毒陽性貽貝21只，覆蓋的基因型包括GII.12(52.4%)、GII.17(19%)、GII.3(14.3%)、GI.3(9.5%)和GII.2(4.8%)(圖3)。

表3 第一次采樣龍泉村養(yǎng)殖場各采樣點貽貝感染諾如病毒檢測結果

圖3 龍泉村養(yǎng)殖場第一次采樣貽貝感染諾如病毒基因型及所占比例Fig.3 Genotypes and proportion of norovirus in mussels for the first sample at Longquan Village

2.2 第二次采樣結果

2.2.1 后頭灣養(yǎng)殖場 ①諾如病毒檢出率：檢測貽貝180只。每個采樣點的樣本檢測情況見表4。其中近岸樣本諾如病毒陽性率為3.9%(7/180)，遠岸貽貝未檢出諾如病毒。②諾如病毒基因型分布：共檢出諾如病毒陽性貽貝7只，覆蓋GI.3(71.4%)和GII.17(28.6%)兩種基因型(圖4)。

圖4 后頭灣養(yǎng)殖場第二次采樣采樣貽貝感染諾如病毒基因型及所占比例Fig.4 Genotypes and proportion of norovirus in mussels for the second sample at Houtou Bay

表4 后頭灣養(yǎng)殖場第二次采樣各采樣點貽貝感染諾如病毒檢測結果

2.2.2 龍泉村養(yǎng)殖場 ①諾如病毒檢出率：檢測貽貝160只。每個采樣點的樣本檢測情況如表5所示。其中近岸與遠岸樣本諾如病毒陽性率分別為3.1%(5/160)和1.9%(3/160)。②諾如病毒基因型分布：共檢出諾如病毒陽性貽貝8只，均為GI.3(100%)型諾如病毒。

枸杞島的后頭灣和龍泉村養(yǎng)殖場的兩次檢測結果表明，四月份共檢測到51只諾如病毒陽性貽貝，九月份僅檢測到15只諾如病毒陽性貽貝。枸杞島兩個貽貝養(yǎng)殖場中檢測的諾如病毒均具有較高的基因多樣性(圖5)，涉及6種諾如病毒基因型：GI.3(36.4%)、GI.4(19.7%)、GII.12(18.2%)、GII.17(13.6%)、GII.3(10.6%)和GII.2(1.5%)。

表5 第二次采樣龍泉村養(yǎng)殖場各采樣點貽貝感染諾如病毒檢測結果

續(xù)表5

圖5 兩次采樣檢測的所有諾如病毒基因型及所占比例Fig.5 Genotypes and proportion of noroviruses detected at Gouqi Island

3 討 論

目前，我國雙殼貝類的養(yǎng)殖并未進行規(guī)范化管理，養(yǎng)殖區(qū)域水質監(jiān)控的方法仍在建設中，這導致市場上的雙殼貝類品質參差不齊，加之消費者在食用貝類時很少了解其養(yǎng)殖區(qū)域的實際污染狀況，使得雙殼貝類中因諾如病毒污染帶來的疫情問題較為嚴重。因此，對貝類養(yǎng)殖區(qū)域病原體檢測數(shù)據(jù)的補充尤為重要[17]。本研究在浙江省舟山市枸杞島后頭灣和龍泉村養(yǎng)殖場內，分別對近岸和遠岸區(qū)域的貽貝進行樣本采集和諾如病毒檢測，分析各采樣點諾如病毒的檢出率與基因型，以此反映養(yǎng)殖場內貽貝的諾如病毒污染情況和基因型分布特點，同時分析養(yǎng)殖場內距離人類活動較近區(qū)域以及較遠區(qū)域的貽貝感染諾如病毒的檢測結果，以深入探究養(yǎng)殖場內貽貝的污染受當?shù)鼐用窕顒拥挠绊懬闆r。

兩次采樣檢測的諾如病毒陽性率差別較大，經(jīng)進一步調查與分析發(fā)現(xiàn)，每年5至10月是枸杞島當?shù)芈糜瓮荆?月處于貽貝生長發(fā)育旺盛時期，此階段的絕大部分貽貝已經(jīng)在海里生長8～9個月，體內諾如病毒富集量達到較高水平，所以4月采集的貽貝感染諾如病毒檢出率較高，且4月處于當?shù)芈糜蔚?，枸杞島養(yǎng)殖場的水環(huán)境處于沒有外來游客“干擾”的時段，因此這些諾如病毒極有可能是當?shù)鼐用衽判刮锼斐傻奈廴尽６?至9月是收割貽貝、養(yǎng)殖新苗階段，枸杞島養(yǎng)殖場內大部分區(qū)域的成熟貽貝均已被收割，貽貝新苗尚未成熟，新苗對水環(huán)境中的諾如病毒富集時間較短，有的甚至還未開始富集諾如病毒，這使得9月的檢測結果與4月相差較大。因此，探究枸杞島養(yǎng)殖場貽貝感染諾如病毒污染情況以及基因型分布的最佳時段應是每年的1至7月。

整體來看，養(yǎng)殖場內的貽貝受到人類活動不同程度的影響，并且該影響與養(yǎng)殖面積具有一定關系。較大的養(yǎng)殖場，由于地理因素，人類活動所能覆蓋的養(yǎng)殖區(qū)域有限，對近岸貽貝影響較大，對遠岸貽貝影響較小，使得近岸區(qū)域貽貝的諾如病毒檢出率較高。較小的養(yǎng)殖場，人類活動區(qū)域覆蓋的養(yǎng)殖面積相對較大，影響的貽貝面積也隨之增大，使檢測到的近岸和遠岸貽貝的諾如病毒差距并不突出。另一方面，面積較大的后頭灣養(yǎng)殖場是捕撈人員進出海、游客垂釣、漁民作業(yè)的主要區(qū)域，因此推測這些人為因素是后頭灣養(yǎng)殖場貽貝感染諾如病毒檢出率高于龍泉村養(yǎng)殖場的主要原因。

除了近岸、遠岸貽貝感染諾如病毒檢出率具有“近高遠低”的趨勢以外，枸杞島貽貝養(yǎng)殖場中檢測的諾如病毒也具有較高的基因多樣性。在全部貽貝樣本中，GI.3型諾如病毒所占比例最高，其次是GI.4型，這兩類諾如病毒并不是引起人類疫情暴發(fā)的主要流行株，因此推測GI.3和GI.4型諾如病毒可能是人類的隱形攜帶株，在人類與環(huán)境之間傳播，目前并不會像主要流行株那樣具有較高的危害性。由于貽貝僅僅是諾如病毒在環(huán)境中傳播的載體，并非其真正的宿主，因此推測這兩類檢出率最高的諾如病毒基因型主要來自于當?shù)鼐用衽欧诺奈鬯蚺判刮?。由于其在養(yǎng)殖場貽貝中檢出率較高，說明GI.3和GI.4型諾如病毒可能在當?shù)鼐用耋w內攜帶量較高且長期穩(wěn)定存在。

除GI型諾如病毒外，從貽貝中檢測到的諾如病毒還有GII.12、GII.17、GII.3和GII.2型，檢出率由高到低。針對中國GI和GII型諾如病毒流行情況的研究發(fā)現(xiàn)[18]，GII.4、GII.17和GII.3型諾如病毒占我國所有諾如病毒基因型數(shù)據(jù)的70%[18]。2014至2015年和2016至2017年冬季，GII.17和GII.2在我國出現(xiàn)并導致疫情病例持續(xù)增加[19]。GII.17型諾如病毒株已成為亞洲幾個國家暴發(fā)急性胃腸炎的主要基因型[20]，我國諾如病毒檢出率從4.0%上升至79.6%[21]。2016年秋季之前，GII.2是一種罕見的基因型，在中國感染率低于1%[22]，在全球流型毒株中僅占1.5%[23]，由于缺乏群體免疫性，GII.2型諾如病毒在年幼兒童群體中更易感染[24]。對不同諾如病毒流行病學和臨床特征研究發(fā)現(xiàn)，GII.2型諾如病毒暴發(fā)主要發(fā)生在幼兒園、小學和高中，主要通過人與人接觸傳播[19]?；?999至2011年間諾如病毒基因型分析發(fā)現(xiàn)[11]，GII.12(15.1%)的檢出率僅次于GII.4(70%)。本研究中發(fā)現(xiàn)的所有GII型諾如病毒大多為導致疫情暴發(fā)的主要病毒株，這一檢測結果說明在非諾如病毒暴發(fā)季，許多諾如病毒基因型仍然在人與人或者人與環(huán)境中持續(xù)存在和傳播，當人體中諾如病毒含量較多時，排泄到環(huán)境中的諾如病毒也在增加，貽貝體內的富集量也隨之增加，因此對環(huán)境和養(yǎng)殖場的貝類定期進行諾如病毒檢測，有助于對人類諾如病毒的監(jiān)測、預警和防控。

本研究還存在不足之處，首先未充分考慮貽貝養(yǎng)殖周期的影響。不同于全年供應量充足的水產(chǎn)市場，養(yǎng)殖場的貝類養(yǎng)殖具有周期性，樣本采集需要考慮貽貝生長周期。當養(yǎng)殖場處于旅游景點內時，外來游客會干擾原有的養(yǎng)殖環(huán)境，這一影響需作為采樣的重點考慮因素。其次，雖然兩次采樣檢測已獲得初步結果，但若想更深入且更全面地探究枸杞島養(yǎng)殖場內諾如病毒的污染規(guī)律，相關采樣工作仍需重復進行，并進一步將枸杞島養(yǎng)殖場貽貝的諾如病毒污染情況更詳盡地反映出來。最后是尚未對當?shù)鼐用裢僖夯蚣S便樣本進行檢測。因此在后續(xù)的監(jiān)測工作中，需盡可能地與當?shù)卣疁贤?，嘗試對當?shù)鼐用竦臉颖具M行檢測，將檢測結果與貽貝感染諾如病毒情況進行對比，進一步確認養(yǎng)殖場內諾如病毒的來源，以期為我國貝類養(yǎng)殖和貝類中諾如病毒的防控工作提供數(shù)據(jù)支持和監(jiān)測思路。