陳 斐，黃天悅，張旭松，曾 鑫，郭佳強(qiáng)，陳孝平

武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢430205

菌種作為生產(chǎn)的源頭，直接關(guān)系到最終產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，其重要性不言而喻［1］。為了保證菌種的質(zhì)量，保持菌種的活力，不管是在基礎(chǔ)的科研工作，還是在微生物的應(yīng)用研究中，都需要使用正確的菌種保藏方法和技術(shù)［2］。而菌種在保藏過程中往往會(huì)因?yàn)楣庹?、溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)條件等原因?qū)е戮N的退化，從而影響其經(jīng)濟(jì)效益［3］。目前人們采用的各種菌種保藏方法都是根據(jù)不同菌種的生理生化特點(diǎn)，為其提供低溫、干燥的生活條件，使微生物處于休眠或生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，從而使其性狀及遺傳物質(zhì)保持穩(wěn)定，達(dá)到維系種系的目的［4～6］。真空冷凍干燥是通過將菌體預(yù)凍后，使其處在真空環(huán)境中進(jìn)行干燥的方法，屬于低溫升華干燥；此法尤其適用于熱敏性和易揮發(fā)物質(zhì)，而且活菌菌劑經(jīng)真空冷凍干燥后穩(wěn)定性強(qiáng)，并且容易保存，是目前制備活菌干燥制劑的主要方法［7］。但是微生物在真空冷凍干燥之后其細(xì)胞存活率很低，這是因?yàn)樘幵诘蜏馗稍锏沫h(huán)境中微生物細(xì)胞及其中某些酶及蛋白質(zhì)分子會(huì)遭到破壞，而導(dǎo)致微生物的死亡。研究表明，為了在低溫干燥過程中不損傷微生物細(xì)胞的生物活性，會(huì)加入不同的凍干保護(hù)劑，使其改變微生物所處的物理或化學(xué)環(huán)境，從而減少低溫環(huán)境對(duì)微生物的傷害［8］。

基于每種保護(hù)劑不同的保護(hù)機(jī)制，并且單一的保護(hù)劑的添加往往達(dá)不到保護(hù)菌種的需求，因此通常組合使用幾種不同種類的保護(hù)劑來提高真空凍干菌劑中活菌存活率［9］。當(dāng)不同的保護(hù)劑同時(shí)存在時(shí)，可協(xié)同強(qiáng)化保護(hù)效果，從而最大化保護(hù)菌體細(xì)胞。

本試驗(yàn)通過對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行真空冷凍干燥，對(duì)復(fù)合凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并篩選出其工藝參數(shù)，以期制備出高活性T1B菌劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

菌種：T1B菌株由實(shí)驗(yàn)室分離保存。

試劑：胰蛋白胨、酵母浸粉、明膠、L-谷氨酸鈉、NaCl、C6H5Na3O7·2H2O、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、丙三醇（甘油）、可溶性淀粉、甘露醇、海藻酸鈉、L-半胱氨酸、谷氨酸鈉，以上試劑均為分析純。脫脂奶粉購(gòu)于雀巢公司。

1.2 培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌活化培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、蔗糖1 g/L，pH調(diào)至7.0～7.2。

枯草芽孢桿菌增殖培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、L-谷氨酸鈉30 g/L、NaCl 10 g/L、C6H5Na3O7·2H2O 16.8 g/L、蔗糖20 g/L、NH4Cl 7 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L、CaCl20.15 g/L、FeCl3·6H2O 0.04 g/L，pH調(diào)至7.0～7.2。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、明膠7.5 g/L，pH調(diào)至7.0～7.2，用于枯草芽孢桿菌的計(jì)數(shù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程菌種活化→菌種富集培養(yǎng)→冷凍離心收集菌體→添加凍干保護(hù)劑→活菌計(jì)數(shù)→預(yù)凍→真空冷凍干燥→凍干菌劑→活菌計(jì)數(shù)［7］。

1.3.2 凍干劑的優(yōu)化在單因素試驗(yàn)確定對(duì)細(xì)胞凍干存活率影響顯著的保護(hù)劑因素的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 菌體離心收集工藝的優(yōu)化按照表1設(shè)定的參數(shù)將T1B菌液進(jìn)行離心，分別測(cè)定其離心損失率和離心存活率。計(jì)算不同參數(shù)下T1B菌種的存活率，確定最佳離心工藝。

離心存活率、離心損失率、離心收得率計(jì)算公式如下：

1.3.4 菌種存活率計(jì)算

1.3.5 復(fù)合凍干保護(hù)劑與菌體沉淀的配比優(yōu)化將篩選出的復(fù)合保護(hù)劑與菌體沉淀分別按照體積與質(zhì)量比為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1均勻混合制成菌懸液，將pH調(diào)至7.0～7.2，進(jìn)行真空冷凍干燥。比較不同配比下的T1B菌劑凍干存活率，確定最佳配比。

1.3.6 復(fù)合凍干保護(hù)劑pH對(duì)T1B菌劑凍干存活率的影響將實(shí)驗(yàn)1.3.2中篩選出的最佳復(fù)合凍干保護(hù)劑的pH值調(diào)整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。并與菌體沉淀混合制成菌懸液，進(jìn)行真空冷凍干燥。比較不同pH值下的T1B菌劑的凍干存活率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以確定最適值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體離心收集工藝的研究

在制備T1B活菌制劑時(shí)，濃縮收集菌體細(xì)胞是其中的重要環(huán)節(jié)，而在工業(yè)生產(chǎn)中一般通過離心來收集。低溫離心可促使菌體與其分泌的毒性代謝產(chǎn)物分離，從而提高菌體的存活率。但是在高轉(zhuǎn)速以及長(zhǎng)離心時(shí)間的環(huán)境中，微生物細(xì)胞易受到剪切力的影響，致使細(xì)胞破碎，從而降低細(xì)胞存活率［10］。按照表2設(shè)定參數(shù)進(jìn)行離心，通過檢測(cè)離心前初始活菌數(shù)、離心后上清液活菌數(shù)和沉降細(xì)胞活菌數(shù)，計(jì)算離心損失率、存活率及收得率。結(jié)果見表2。

由表2可知，離心損失率和離心存活率隨著離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間的不斷增加，兩者都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。其中在4 000 r/min離心10 min條件下離心損失率和離心存活率最高，且離心損失率相互之間差異顯著，而離心存活率相互之間差異不顯著。

在4 000 r/min離心10 min，以及7 000 r/min離心5 min條件下，離心收得率最大，離心效果最好，但最佳離心條件的選擇還需要考慮經(jīng)濟(jì)成本，盡量選取低轉(zhuǎn)速或較短的離心時(shí)間。由表2可知，選擇7 000 r/min離心5 min，所得離心收得率最高，離心效果最好，可達(dá)92%以上。

2.2 凍干保護(hù)劑單因素的篩選結(jié)果

在真空冷凍干燥過程中加入凍干保護(hù)劑可降低冷凍干燥對(duì)菌體的損害，保持菌體的生物活性及其生理生化特性，提高凍干后菌劑中目的菌種的存活率［11］。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［12-13］，選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸鈉、L-半胱氨酸、海藻酸鈉、脫脂奶粉作為菌種凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥，篩選保護(hù)效果較好的保護(hù)劑。結(jié)果見表3。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，并根據(jù)保護(hù)劑分子大小的不同將其復(fù)配使用，選擇脫脂奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%為最優(yōu)單因素，進(jìn)行下一步T1B復(fù)合凍干保護(hù)劑的優(yōu)化。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合凍干保護(hù)劑

（1）多元二次回歸模型的建立和方差分析

表2離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)T1B的影響Tab.2 Effect of centrifugal speed and time on T1B

表3凍干保護(hù)劑單因素試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of single factor test of lyophilized protective agent

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以脫脂奶粉、蔗糖、麥芽糖3種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)因素為自變量，T1B凍干存活率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

利用Design-Expert 6軟件對(duì)表的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回合擬合，獲得回歸方程：

方程式中，Y為T1B凍干存活率的預(yù)測(cè)響應(yīng)值，A，B，C，分別為脫脂奶粉、蔗糖、麥芽糖的編碼值?；貧w模型的方差分析見表5。

由表5可知，該模型P值為0.008 5，小于0.01，差異極顯著，即對(duì)T1B凍干存活率的影響極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.720 6，大于0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明模型的擬合度很好，接近實(shí)際情況，模型可靠。模型的決定系數(shù)R2=97.43%，矯正系數(shù)AdjR2=90.12%，說明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間具有一致性，故此模型可對(duì)菌體數(shù)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Tab.4 Box-Behnken design and experimental results

表5響應(yīng)面二次項(xiàng)模型方差分析Tab.5 ANOVA for response surface quadratic model

由表5可知，回歸方程中各因素影響為顯著和極顯著，說明對(duì)T1B凍干存活率的影響較大。

（2）響應(yīng)面交互作用分析及最優(yōu)點(diǎn)的尋求

為進(jìn)一步探究A、B、C的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，采用Design-Expert 6.0軟件繪制等高線圖及對(duì)應(yīng)的三維響應(yīng)面圖。具體結(jié)果見圖1。

圖1脫脂奶粉A、蔗糖B以及麥芽糖C交互作用等高線圖及相應(yīng)響應(yīng)面圖：（a）A：脫脂奶粉與B：蔗糖，（b）A：脫脂奶粉與C：麥芽糖，（c）B：蔗糖與C：麥芽糖Fig.1 Contour maps and corresponding response surface maps of interaction of skimmed milk powder A，sucrose B，and maltose C：（a）skimmed milk powder A and sucrose B，（b）skimmed milk powder A and maltose C，（c）sucrose B and Maltose C

根據(jù)圖1的結(jié)果，表明脫脂奶粉與蔗糖、脫脂奶粉與麥芽糖以及蔗糖與麥芽糖兩兩之間的交互作用較顯著。凍干存活率都是隨著濃度增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。從響應(yīng)面分析結(jié)果可知，當(dāng)A=7.39，B=9.60，C=10.71時(shí)，Y值取得最大值。即當(dāng)脫脂奶粉濃度為7.39%，蔗糖濃度為9.60%，麥芽糖濃度為10.71%時(shí)，T1B菌體的存活率的理論值最大為83.8%。

2.4 復(fù)合凍干保護(hù)劑與菌體沉淀的配比及最適pH的確定

很多研究學(xué)者認(rèn)為，凍干保護(hù)劑的羥基通過氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子表面形成一層水化膜，穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，可在低溫干燥環(huán)境下維持其完整的結(jié)構(gòu)和功能，因此凍干保護(hù)劑的濃度對(duì)菌種的凍干存活率也有很大的影響［14-15］。此外復(fù)合凍干保護(hù)劑的pH值對(duì)T1B的存活率也有一定的影響。為確定復(fù)合凍干保護(hù)劑與菌體沉淀的最佳配比以及復(fù)合凍干保護(hù)劑的最適pH值，分別測(cè)定了保護(hù)劑與菌體沉淀的體積質(zhì)量之比為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1時(shí)T1B的凍干存活率；以及復(fù)合保護(hù)劑的pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5時(shí)T1B的凍干存活率。其結(jié)果如圖2所示。

圖2影響T1B的凍干存活率的因素：（a）保護(hù)劑與菌泥混合配比，（b）保護(hù)劑pHFig.2 Factors of effect on freeze-dried survival rate of T1B：（a）mixing ratio of the protective agent to bacterial mud，（b）protective agent pH

由圖2可知，T1B的凍干存活率隨著保護(hù)劑與菌體沉淀之比的逐漸增大有明顯提升，表明在T1B菌體內(nèi)部和表面上分布足夠多的保護(hù)劑，可在最大限度上發(fā)揮對(duì)菌體的保護(hù)作用。當(dāng)保護(hù)劑與菌體沉淀之比繼續(xù)增大后，T1B的凍干存活率有少量下降，說明凍干保護(hù)劑過量反而會(huì)降低菌體的存活率，可能是由于保護(hù)劑過多導(dǎo)致細(xì)胞的通透性降低，也可能是由于單位體積內(nèi)的菌體數(shù)量較少。當(dāng)保護(hù)劑與菌體沉淀之比為2∶1時(shí)，T1B凍干存活率達(dá)到最高為83.9%。

在酸性條件下，T1B的凍干存活率隨著保護(hù)劑pH的增大而增大。但隨著pH的繼續(xù)增大，T1B的凍干存活率呈下降趨勢(shì)，表明過大的pH會(huì)對(duì)T1B的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。當(dāng)保護(hù)劑的pH值升高到7.0時(shí)，T1B的凍干存活率達(dá)到最大值為84.9%，可能是因?yàn)榇藭r(shí)的pH最適宜枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)，能夠在一定程度上提高菌體的存活率。

2.6 復(fù)合凍干保護(hù)劑效果驗(yàn)證

將配制好的復(fù)合凍干保護(hù)劑與T1B菌體沉淀以2∶1的體積與質(zhì)量比均勻混合制成菌懸液，pH值調(diào)整為7.0，進(jìn)行真空冷凍干燥。其凍干存活率達(dá)到85.3%，其凍干菌劑活菌數(shù)為1.26×1011cfu/g，最后將凍干菌劑裝入滅菌的凍存管內(nèi)密封保存。

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面法對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的一株T1B菌株的凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行了優(yōu)化，確定T1B菌株復(fù)合凍干保護(hù)劑配方為：脫脂奶粉濃度為7.39%，蔗糖濃度為9.60%，麥芽糖濃度為10.71%，優(yōu)化后的凍干保護(hù)劑在凍干過程中對(duì)于T1B菌體保護(hù)效果顯著，此時(shí)的菌體存活率理論值最大為82.7%，并確定菌體最佳離心條件為7 000 r/min 5 min，復(fù)合凍干保護(hù)劑適宜pH為7.0，與菌體沉淀的最佳配比為2∶1。經(jīng)驗(yàn)證，優(yōu)化后的凍干存活率達(dá)到85.3%。此項(xiàng)研究為枯草芽孢桿菌的復(fù)合發(fā)酵劑菌劑的實(shí)際生產(chǎn)提供了理論參考。