劉楊 ，段小潔 ,2,＊

1北京大學(xué)工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100871

2北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院，北京 100871

1 引言

神經(jīng)電極為神經(jīng)系統(tǒng)與外部設(shè)備之間進(jìn)行有效的信息傳遞提供了接口，這種電子器件不僅可用于基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)的研究，如探索認(rèn)知過程的基本機(jī)制1,2和感覺信息處理的神經(jīng)基礎(chǔ)3，也為神經(jīng)系統(tǒng)很多疾病的治療提供了解決方案。例如，神經(jīng)電極對(duì)腦活動(dòng)的記錄可以識(shí)別與癲癇活動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)放電模式4，從而用于癲癇病灶的定位5。在神經(jīng)調(diào)控方面，人工耳蝸幫助失聰患者恢復(fù)聽力6，深部腦刺激可用于減輕帕金森癥狀7以及脊髓刺激器有助于緩解神經(jīng)性疼痛8。

理想的神經(jīng)記錄和刺激電極應(yīng)當(dāng)具有良好的生物相容性，同時(shí)具有低阻抗和高電荷注入容量9，以進(jìn)行高質(zhì)量、低損傷且長(zhǎng)期穩(wěn)定的神經(jīng)記錄和調(diào)控。柔軟的神經(jīng)組織通常表現(xiàn)出各向異性的粘彈性特征，能夠承受由于血流、呼吸和自然身體運(yùn)動(dòng)而引起的應(yīng)變和位移，其力學(xué)順從性可由楊氏模量定量化描述。其中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)組織的楊氏模量在100 Pa到10 kPa之間10,11。傳統(tǒng)由金屬和半導(dǎo)體等硬質(zhì)材料構(gòu)成的神經(jīng)電極具有與神經(jīng)組織的力學(xué)不匹配性11-13，會(huì)導(dǎo)致電極周圍組織的炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)增生，形成膠質(zhì)瘢痕，這些活化的生物組織又會(huì)造成電極結(jié)構(gòu)退化、材料腐蝕、絕緣層失效及電極阻抗波動(dòng)，降低了神經(jīng)信號(hào)記錄的能力和長(zhǎng)期穩(wěn)定性14。另一方面，電極阻抗與電極的表面積有關(guān)15，增大電極的電化學(xué)有效表面積(electrochemical surface area，ESA)16可降低阻抗，產(chǎn)生較低幅值的熱噪聲。通常情況下，單神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢挥涗浭褂玫碾姌O幾何表面積(geometric surface area，GSA)不應(yīng)超過2000 μm2，并且通常小得多16，小尺寸的金屬電極可能具有較大的電化學(xué)阻抗，從而帶來低信噪比17。為解決這一問題，需要選擇多孔性的電極材料或進(jìn)行電極的表面修飾，以獲得具有較大有效表面積但幾何尺寸較小的神經(jīng)電極15,16,18。

柔性生物電子器件的發(fā)展為提高神經(jīng)界面的生物相容性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性提供了新策略10,19。電極的尺寸、形狀和電極材料的拉伸模量決定了電極在生物組織中的順從性11,12,20。例如幾何尺寸的減小和柔性材料的使用可降低電極的抗彎剛度，減少神經(jīng)電極和神經(jīng)組織之間的結(jié)構(gòu)和力學(xué)差異，因此，許多研究致力于通過優(yōu)化器件的幾何結(jié)構(gòu)21或使用柔性材料22來實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)活動(dòng)的穩(wěn)定監(jiān)測(cè)和調(diào)控。

多模態(tài)神經(jīng)界面將外部設(shè)備與神經(jīng)元之間的多種交互模式集成到一起，使得外部設(shè)備與神經(jīng)環(huán)路的雙向通信具有更高的時(shí)空精度19。多模態(tài)兼容的神經(jīng)電極對(duì)相互無干擾的多模態(tài)神經(jīng)界面的集成起關(guān)鍵作用。光遺傳調(diào)控結(jié)合多通道神經(jīng)電生理記錄和光學(xué)成像是研究神經(jīng)環(huán)路連接和功能的有利工具，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)神經(jīng)活動(dòng)探測(cè)的高空間分辨率和時(shí)間分辨率14,23。然而對(duì)于金屬電極陣列來說，其不透明性阻礙了對(duì)金屬位點(diǎn)下方神經(jīng)組織的光學(xué)成像和光遺傳刺激24；同時(shí)，在光照下，由于金屬電極-電解質(zhì)溶液界面的Becquerel效應(yīng)，記錄得到的信號(hào)中會(huì)產(chǎn)生光偽跡，這會(huì)污染真實(shí)的神經(jīng)信號(hào)，尤其是無法從偽跡中提取出低頻的局部場(chǎng)電位(Local Field Potential，LFP)信號(hào)25,26，因此尋找具有透光性且具有較小或無光偽跡的電極材料，對(duì)于發(fā)展多模態(tài)神經(jīng)電極技術(shù)極其重要。

磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)兼容的神經(jīng)電極允許對(duì)電極周圍腦組織的MRI可視化及電極位置的確定，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)高分辨的電生理測(cè)量和大腦活動(dòng)的MRI圖譜的結(jié)合。一些由貴金屬、不銹鋼或鎢絲等材料構(gòu)成的植入式神經(jīng)刺激或記錄電極，雖然具有良好的穩(wěn)定性和界面電化學(xué)特性，然而，即使是非鐵磁性的材料，也會(huì)由于其和水/組織之間的磁化率不匹配而導(dǎo)致嚴(yán)重的場(chǎng)畸變，在MRI中造成電極周圍較大的圖像偽影或盲區(qū)，使得無法看到周圍的腦組織，導(dǎo)致這些金屬電極與MRI不兼容27。因此，發(fā)展具有高生物相容性且MRI兼容的神經(jīng)電極至關(guān)重要，這對(duì)于基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)研究以及臨床評(píng)估和監(jiān)測(cè)具有重要意義。

納米技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用引起了人們極大的興趣。迄今為止，由硅和貴金屬構(gòu)成的植入式電極，雖然具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，但這些非柔性材料可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕的出現(xiàn)，降低信噪比，阻礙其神經(jīng)記錄的長(zhǎng)期應(yīng)用12。碳納米材料，主要包括石墨烯和碳納米管，由于其獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，在眾多材料中脫穎而出，成為構(gòu)筑神經(jīng)電極或修飾神經(jīng)界面的重要材料。石墨烯有多種制備方法，包括液相剝離法、微機(jī)械剝離法、氧化剝離法(通常得到還原氧化石墨烯)、化學(xué)氣相沉積法(chemical vapor deposition，CVD)和SiC外延生長(zhǎng)法28。其中化學(xué)氣相沉積法可生長(zhǎng)大面積單層石墨烯薄膜，薄膜具有柔性和高透光性，可減少晶體缺陷并實(shí)現(xiàn)高載流子遷移率，極大地易化了石墨烯在光電器件方面的應(yīng)用，奠定了石墨烯用于制備透明神經(jīng)電極陣列的基礎(chǔ)。通過剝離法可得到石墨烯片，利用石墨烯片懸浮液可制成石墨烯纖維結(jié)構(gòu)電極，石墨烯纖維具有的較高孔隙度和粗糙度，有利于實(shí)現(xiàn)電極的低阻抗和高電荷注入能力。碳納米管方面，可以通過CVD法生長(zhǎng)垂直排列的碳納米管陣列，再通過牽拉和紡絲過程得到具有高導(dǎo)電率和抗拉強(qiáng)度的碳納米管纖維29,30，從而用于制備大腦深度電極。

到目前為止，人們已經(jīng)發(fā)展了基于碳納米材料的多種神經(jīng)電極及其陣列。柔性透明神經(jīng)電極實(shí)現(xiàn)了電生理記錄、光學(xué)成像和光遺傳調(diào)控的多功能集成14,23,26?；谔技{米材料的MRI兼容神經(jīng)電極對(duì)植入電極的定位、癲癇病灶的確定以及深部腦刺激(Deep Brain Stimulation，DBS)-功能磁共振成像(functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI)聯(lián)用下對(duì)大腦神經(jīng)環(huán)路激活模式的研究有著重要意義31-33。此外，碳納米材料電極還可以進(jìn)行穩(wěn)定且高選擇性的體內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的電化學(xué)監(jiān)測(cè)。如在大腦損傷后，常發(fā)生擴(kuò)散性去極化現(xiàn)象，破壞了神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)(如N+、Ca2+、K+和谷氨酸鹽)的穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生興奮毒性蔓延，利用碳納米管包覆的碳纖維電極可監(jiān)測(cè)到與這一現(xiàn)象的發(fā)生密切相關(guān)的抗壞血酸的釋放34。

本文將主要綜述近年來基于石墨烯和碳納米管的神經(jīng)電極技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，并對(duì)未來納米碳基神經(jīng)電極的發(fā)展方向進(jìn)行展望。

2 基于碳納米材料的柔性電極

2.1 柔性石墨烯電極

石墨烯由碳原子按六邊形蜂窩狀排列而成，具有良好的電學(xué)35、力學(xué)36和化學(xué)性質(zhì)37，同時(shí)石墨烯的柔性使其與周圍組織具有較高的力學(xué)匹配性，這種匹配性可以極大地減小對(duì)神經(jīng)組織的損傷，可被用來替代傳統(tǒng)導(dǎo)電材料硅和金屬，用于發(fā)展新型神經(jīng)界面。

多孔性石墨烯電極具有較大的比表面積、低阻抗和高電荷注入能力，有利于實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的皮層記錄和刺激9,16,32。Lu等9直接在聚酰亞胺基底上，采用激光熱解聚酰亞胺制備了圖案化的三維多孔石墨烯泡沫，并以Cr/Au作為金屬引線和接觸墊，負(fù)型光刻膠SU-8作為封裝層，得到了具有多孔性和高表面粗糙度的柔性石墨烯神經(jīng)電極陣列(如圖1a所示)，其阻抗值比相同尺寸的金電極大約低兩個(gè)數(shù)量級(jí)；使用硝酸處理可得到化學(xué)摻雜的石墨烯，進(jìn)一步降低了阻抗值，同時(shí)電荷注入極限(Charge Injection Limit，CIL)由2 mC·cm-2提高到3.1 mC·cm-2。之后，將電極置于大鼠感覺皮層表面，可記錄到感覺誘發(fā)電位；并利用電極刺激運(yùn)動(dòng)皮層，可引起踝關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的屈曲。Apollo等12通過濕法紡絲制備氧化石墨烯纖維，并在220 °C下退火處理，得到液晶氧化石墨烯(Liquid Crystal Graphene Oxide，LCGO)纖維，以派瑞林C(Parylene-C)作為絕緣層，并用激光將纖維末端燒蝕成刷子樣，以增加表面粗糙度和納米孔隙度，得到了具有高電荷注入能力的神經(jīng)電極(如圖所1b示)。研究人員用此電極對(duì)剝離的大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行體外刺激，同時(shí)進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。之后，在電極表面涂覆水溶性蔗糖形成微針，輔助柔性電極植入貓視覺皮層，蔗糖隨后溶解，并記錄到神經(jīng)活動(dòng)(如圖1c所示)。

圖1 柔性石墨烯電極Fig.1 Soft graphene electrodes.

石墨烯還可與其他材料結(jié)合制備神經(jīng)電極，從而集成多種材料的優(yōu)勢(shì)。Ryu等38制備了以聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(poly(3,4-ethylenedioxythiophene，PEDOT)-Au-ZnO納米線復(fù)合材料作為記錄位點(diǎn)，Au-石墨烯作為引線的神經(jīng)探針(如圖1d所示)。其中，ZnO納米線和導(dǎo)電聚合物PEDOT涂層的結(jié)合提高了電極的有效表面積和電荷儲(chǔ)存能力，降低了阻抗。為比較Au和Au-石墨烯作為電極引線的性能差異，將電極引線部分反復(fù)折疊30次，發(fā)現(xiàn)僅有Au引線的電極阻抗明顯升高，而Au-石墨烯電極引線在反復(fù)折疊100次后阻抗變化不大，證明石墨烯的加入可以增加電極的抗彎折性，Au-石墨烯的結(jié)合保證了電極的柔性和導(dǎo)電性。同時(shí)，此電極可在胡須刺激下記錄到LFP信號(hào)。

石墨烯不僅可以用于構(gòu)筑基于平面陣列結(jié)構(gòu)和微絲結(jié)構(gòu)的電極，由于石墨烯的高載流子遷移率39-41和界面電容39，還可以作為溝道材料用于制造基于高跨導(dǎo)場(chǎng)效應(yīng)晶體管(field-effect transistors，F(xiàn)ET)的柔性器件，以實(shí)現(xiàn)對(duì)電信號(hào)的高靈敏度檢測(cè)39。Blaschke等42在柔性聚酰亞胺基底上沉積金作為源極和漏極，之后將CVD法生長(zhǎng)的石墨烯薄膜轉(zhuǎn)移至其上作為溝道，并以SU-8作為封裝層，制備了高密度集成的基于溶液柵石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管的柔性器件(如圖1e所示)。器件在反復(fù)彎曲下，跨導(dǎo)沒有明顯變化。在此器件上培養(yǎng)HL-1心肌細(xì)胞，細(xì)胞的電活動(dòng)會(huì)引起晶體管柵壓的改變，實(shí)現(xiàn)了高信噪比的細(xì)胞動(dòng)作電位記錄。之后，研究人員應(yīng)用溶液柵石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管柔性器件進(jìn)行荷包牡丹堿誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作間期的信號(hào)記錄，并將器件放置于大鼠初級(jí)視覺(primary visual，V1)皮層，記錄到了自發(fā)電活動(dòng)和視覺誘發(fā)電位。

2.2 柔性碳納米管電極

小尺寸的神經(jīng)電極有利于提高神經(jīng)信號(hào)記錄和刺激的空間分辨率，然而，對(duì)于傳統(tǒng)金屬電極來說，隨著電極尺寸減小，其阻抗會(huì)上升，繼而影響信號(hào)的記錄。碳納米管具有高比表面積43,44、良好的導(dǎo)電和力學(xué)性能，可以被用來構(gòu)筑或修飾柔性電極，以提高電極尖端的電化學(xué)表面積，并降低電極阻抗15。

資本市場(chǎng)中CPA審計(jì)尋租活動(dòng)并不產(chǎn)生新的社會(huì)經(jīng)濟(jì)利益，只是重新劃分與轉(zhuǎn)移既得的社會(huì)經(jīng)濟(jì)利益，使得其從一個(gè)主體流向其他主體。在這個(gè)過程中，不僅耗費(fèi)社會(huì)經(jīng)濟(jì)資源，而且扭曲了正常的資源配置和收入分配格局。具體表現(xiàn)為：

柔性碳納米管纖維可通過碳納米管溶液、氣凝膠和碳納米管陣列紡制而成45，且纖維直徑可控46。Durand及其合作者30,47研究了柔性碳納米管纖維電極用于外周神經(jīng)的記錄。他們將垂直排列的多壁碳納米管陣列進(jìn)行高速紡絲得到了碳納米管纖維電極(直徑10-20 μm)，用于大鼠舌咽神經(jīng)和迷走神經(jīng)的電學(xué)記錄。電極由3.5 μm厚的Parylene-C作為絕緣層，將電極一端纏繞在鎢絲上進(jìn)行輔助植入，之后移出鎢絲，電極對(duì)周圍神經(jīng)組織具有力學(xué)順從性，因而降低了神經(jīng)損傷和炎癥反應(yīng)。利用此電極可進(jìn)行長(zhǎng)期神經(jīng)記錄，在10周的時(shí)間段內(nèi)，其阻抗在1 kHz下保持在18 ± 8 kΩ，同時(shí)信噪比超過10 dB。此外，研究者將碳納米管纖維電極植入大鼠脛神經(jīng)，刺激不同腳趾，可記錄到不同幅值的復(fù)合神經(jīng)動(dòng)作電位，此電極的刺激具有對(duì)神經(jīng)纖維的空間選擇性。

當(dāng)減小神經(jīng)植入物在兩個(gè)維度上(厚度和寬度)的尺寸時(shí)，可提高其力學(xué)順從性并減少巨噬細(xì)胞的附著11,48。Zhang等11利用層層(layer-by-layer，LBL)自組裝法制備了柔性多層碳納米管：聚苯乙烯磺酸鈉(poly(sodium4-styrenesulfonate)，PSS)/聚乙烯醇(poly(vinyl alcohol)，PVA)復(fù)合物電極，其中電極位點(diǎn)大小為100 μm2(如圖2a所示)，電極厚度約3 μm。研究人員將電極植入大鼠運(yùn)動(dòng)皮層，進(jìn)行低頻信號(hào)記錄，并通過MRI和光聲成像(Photoacoustic Microscopy，PAM)，觀測(cè)電極在腦組織中的植入位置。

Vitale等49利用濕法紡絲制備的碳納米管纖維電極進(jìn)行DBS和長(zhǎng)期神經(jīng)記錄。碳納米管纖維電極與溶液界面通過形成雙電層控制著電化學(xué)過程，電極具有比相同直徑鉑銥(PtIr)絲更小的阻抗、更高的陰極電荷儲(chǔ)存容量(Cathodal Charge Storage Capacity，CSC，372 ± 56 mC·cm-2)和CIL (6.52 mC·cm-2)。電極植入大鼠6周后，PtIr電極周圍產(chǎn)生嚴(yán)重的瘢痕組織，而碳納米管纖維電極炎癥反應(yīng)較PtIr電極顯著降低。在DBS實(shí)驗(yàn)中，將碳納米管纖維雙極電極(如圖2b所示)植入帕金森大鼠模型的腳內(nèi)核(Entopenducular，EP)，之后對(duì)大鼠腹腔注射甲基苯丙胺溶液引發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，通過轉(zhuǎn)圈旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)來評(píng)估碳納米管纖維電極用于DBS治療的效果。在高頻刺激(160和175 Hz)下，大鼠旋轉(zhuǎn)速率降低，運(yùn)動(dòng)癥狀減輕(如圖2c所示)，證明碳納米管纖維可用于動(dòng)物模型的DBS治療。同時(shí)，將直徑12.6 μm的單根碳納米管纖維與三根直徑12 μm的NiCr絲組裝在一起形成四通道電極陣列(tetrodes)，其中NiCr的活性位點(diǎn)進(jìn)行鍍金處理，將電極植入大鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層，此碳納米管電極可記錄到單神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?如圖2d)和LFP，并進(jìn)行至少三周的神經(jīng)記錄。

圖2 柔性碳納米管電極Fig.2 Soft carbon nanotubes (CNTs)electrodes.

圖3 柔性碳納米管纖維電極進(jìn)行長(zhǎng)期神經(jīng)記錄33Fig.3 Chronic neural recording with soft CNT fiber electrodes 33.

Lu等33利用直徑為15和5 μm的碳納米管纖維制備了植入式神經(jīng)電極(如圖3a所示)，因?yàn)殡姌O的抗彎強(qiáng)度正比于尺寸的3次方，而且碳納米管纖維具有比很多金屬低的楊氏模量，該電極的抗彎強(qiáng)度低至1.58 × 102nN·m-1(碳納米管纖維直徑為5 μm)。此電極具有比PtIr電極更優(yōu)異的電化學(xué)界面性質(zhì)，其電化學(xué)過程由電極-電解質(zhì)所形成的雙電層控制，電極具有更大的電荷儲(chǔ)存容量和電荷注入極限。研究人員采用梭子輔助植入的方法，可將電極精確定位到目標(biāo)腦區(qū)；同時(shí)，采用CNT纖維直徑為15 μm的電極實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)神經(jīng)元4-5個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定記錄(如圖3b所示)。在電極的長(zhǎng)期植入過程中，與剛性PtIr電極相比，碳納米管纖維電極極大地降低了炎癥反應(yīng)。此柔性電極在植入后通過移動(dòng)可微調(diào)記錄位點(diǎn)位置，從而可以選擇具有特定響應(yīng)性的神經(jīng)元，這將有利于神經(jīng)記錄和刺激。實(shí)驗(yàn)過程中，隨著電極植入深度的變化(從-2160到-6838 μm)，可以記錄到不同腦區(qū)的具有高信噪比的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢弧?/p>

柔性電極雖然與神經(jīng)組織有較好的力學(xué)匹配性，但也為其植入過程帶來了挑戰(zhàn)。目前用于柔性電極植入的方法主要有在電極表面涂覆可溶解的高聚物50，如明膠51、絲素蛋白52和蔗糖12等，以在電極表面形成剛性涂層；或者將電極附著于微針53或梭子11,33,49,54,55上輔助電極植入，待電極植入后將梭子移出。這兩種方法均是通過暫時(shí)增強(qiáng)電極剛度從而將柔性電極植入生物組織。Vitale等56提出一種用雙層聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)微流控裝置輔助碳納米管纖維(carbon nanotube fiber，CNTf)電極植入生物組織的方法(如圖4所示)。此方法未改變電極的剛度或尺寸，在整個(gè)植入過程中，僅柔性電極進(jìn)入了腦組織中，極大減小了急性損傷。由Parylene-C包覆的12 μm直徑的碳納米管纖維電極的抗彎剛度為0.23 ×10-9N·m2。將電極植入小鼠腦片的丘腦網(wǎng)狀核(thalamic reticular nucleus，TRN)區(qū)域，可在光遺傳刺激下記錄到突觸后神經(jīng)元響應(yīng)；在體實(shí)驗(yàn)中，利用此電極可檢測(cè)到單個(gè)神經(jīng)元的自發(fā)放電活動(dòng)，從而證明了這一流體驅(qū)動(dòng)的方法可用于柔性神經(jīng)電極體內(nèi)和體外植入及神經(jīng)活動(dòng)記錄。

圖4 雙層PDMS微流控輔助碳納米管纖維電極植入裝置56Fig.4 Schematics of the two-layer PDMS microfluidic device assisting insertion of flexible CNTf microelectrodes 56.

3 碳納米材料透明電極

3.1 透明石墨烯電極

石墨烯因其優(yōu)異的導(dǎo)電性、導(dǎo)熱性、可轉(zhuǎn)移性和力學(xué)強(qiáng)度而被廣泛用于多個(gè)研究領(lǐng)域。得益于其寬光譜范圍內(nèi)的高透光性57，石墨烯可用于制備透明神經(jīng)電極陣列，實(shí)現(xiàn)電生理記錄、光學(xué)成像和光遺傳刺激的多功能集成，有助于進(jìn)行高時(shí)間-空間分辨率的神經(jīng)環(huán)路研究。

基于石墨烯的透明電極陣列允許大面積的入射光透過，同時(shí)入射光可直接照射位點(diǎn)之下的神經(jīng)元23；相比之下，對(duì)于不透明的金屬電極來說，只能刺激電極位點(diǎn)周圍的組織，極大地限制了高分辨率的光遺傳實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行57。Park等23制備了基于四層石墨烯的碳層電極陣列(carbon-layered electrode array，CLEAR)，此器件包含16個(gè)石墨烯電極位點(diǎn)，Parylene-C作為電極基底和封裝層(如圖5a所示)，其在紫外到紅外波段內(nèi)的透光率超過90%。器件受到光照時(shí)產(chǎn)生的光偽跡幅值具有光功率和光刺激持續(xù)時(shí)間的依賴性，因此，減小光功率可減少或消除偽跡。將CLEAR器件置于Thy1::ChR2轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層，實(shí)現(xiàn)了473 nm藍(lán)光光遺傳刺激下的神經(jīng)電信號(hào)記錄(如圖5b所示)；在電極記錄位點(diǎn)處，由于石墨烯的寬光譜透光性，可透過CLEAR器件進(jìn)行皮層血管的熒光成像和光學(xué)相干斷層(optical coherence tomography，OCT)成像，透明的電極記錄位點(diǎn)未對(duì)其下組織造成遮擋，可清晰成像。此外，在后續(xù)的工作中，此課題組使用16通道透明石墨烯微電極陣列(如圖5c所示)，進(jìn)行微皮層電圖(microelectrocorticography，μECoG)的記錄，在轉(zhuǎn)基因GCaMP6f小鼠皮層上實(shí)現(xiàn)了同時(shí)的神經(jīng)電刺激和神經(jīng)活動(dòng)成像58。石墨烯的透光性使得電刺激誘發(fā)的神經(jīng)活動(dòng)可以通過熒光鈣成像變得可視化。作者發(fā)現(xiàn)石墨烯電極的CIL可達(dá)到116.07-174.10 μC·cm-2。作者還發(fā)現(xiàn)相比陽極刺激，采用陰極刺激可以引起更強(qiáng)的神經(jīng)響應(yīng)，證明了電荷向大腦的更有效傳遞。這些工作展現(xiàn)了高透光性的神經(jīng)電極陣列相對(duì)非透明金屬電極在電生理技術(shù)、光學(xué)成像和光遺傳實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)勢(shì)。

圖5 透明石墨烯電極Fig.5 Transparent graphene electrodes.

Kuzum等14利用透明柔性石墨烯神經(jīng)電極陣列實(shí)現(xiàn)了同步光學(xué)成像和電生理記錄。電極以聚酰亞胺作為柔性基底，p型摻雜的石墨烯作為位點(diǎn)，SU-8作為封裝層(如圖5d所示)，摻雜的石墨烯電極展現(xiàn)了低阻抗和高電荷儲(chǔ)存容量。此電極可在海馬組織切片上同時(shí)進(jìn)行鈣離子成像和電生理記錄，而未引入光偽跡。透明的石墨烯電極可以檢測(cè)到高頻電活動(dòng)，與具有較高空間分辨率但低時(shí)間分辨率的鈣成像實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)。將石墨烯包裹于Ag電極表面，可極大地降低Ag的腐蝕；將包裹著石墨烯的Au電極浸于磷酸鹽緩沖液六個(gè)月后，拉曼光譜仍顯示了石墨烯的特征峰，證明了石墨烯不僅使電極具有低噪聲和透光性，同時(shí)石墨烯可作為金屬微電極的腐蝕保護(hù)層，具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性。Thunemann等26采用電化學(xué)鼓泡法將石墨烯轉(zhuǎn)移至50 μm厚度的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)基底上，石墨烯經(jīng)過圖案化成為電極位點(diǎn)，同時(shí)石墨烯表面的清理避免了裂紋的形成和有機(jī)物的殘留；最后以SU-8作為封裝層，得到了具有16個(gè)通道的透明石墨烯微電極陣列(如圖5e所示)。電極的阻抗小于1.5 MΩ(1 kHz)，將電極以5 mm的曲率半徑(處于小鼠皮層的自然彎曲范圍內(nèi))反復(fù)彎曲20次，未發(fā)現(xiàn)器件的失效。將電極置于小鼠初級(jí)軀體感覺皮層表面，可實(shí)現(xiàn)從皮層表面到1200 μm深度的中間神經(jīng)元和血管的雙光子成像；同時(shí)，利用此電極可進(jìn)行單脈沖電刺激對(duì)側(cè)胡須時(shí)LFP和鈣離子瞬變信號(hào)的同步記錄、光遺傳調(diào)控下LFP信號(hào)記錄和小動(dòng)脈擴(kuò)張的雙光子成像，以及胡須刺激下同步血流動(dòng)力學(xué)光學(xué)成像和神經(jīng)電活動(dòng)記錄。

Jeong等59制備了透明的石墨烯/垂直排列碳納米管雜化電極。電極的透光性允許對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行光學(xué)監(jiān)測(cè)和調(diào)控；同時(shí)，培養(yǎng)在其上的神經(jīng)元緊密附著在電極表面(如圖5f所示)并均勻分布，形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。石墨烯/垂直排列碳納米管電極構(gòu)筑了良好的神經(jīng)界面，可對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢贿M(jìn)行胞外記錄，峰間幅值可達(dá)1.6 mV，均方根噪聲水平為5.92 μV。

透明電極還可用于記錄視網(wǎng)膜電圖(electroretinography，ERG)60。Yin等61制備了柔性透明的石墨烯角膜接觸鏡電極(graphene contact lens electrodes，GRACEs)(如圖6a所示)，此電極具有寬光譜范圍下的透光性和低阻抗，并可與角膜形成共形、緊密的界面，且在常規(guī)ERG的記錄時(shí)間內(nèi)，佩戴此電極沒有對(duì)角膜產(chǎn)生明顯的損傷。利用該電極，作者實(shí)現(xiàn)了多種ERG信號(hào)的高質(zhì)量記錄。在全視野ERG (full- field ERG，ffERG)記錄中，GREACEs可記錄到比商業(yè)ERG-Jet電極更高的角膜電位幅值；該電極還可以用于記錄多焦ERG(multifocal ERG，mfERG)信號(hào)(如圖6b所示)，得益于共形界面帶來的眼睛屈光度的保持。此外，多位點(diǎn)透明石墨烯電極陣列(如圖6c所示)實(shí)現(xiàn)了具有空間分辨的ERG響應(yīng)記錄，并觀察到ERG信號(hào)幅值在角膜中央最高，并向顳側(cè)和鼻側(cè)呈遞減的現(xiàn)象。

3.2 碳納米管透明電極

碳納米管具有優(yōu)異的電學(xué)性能，可形成超薄且光學(xué)透明的薄膜，并已發(fā)展了多種制備透明導(dǎo)電碳納米管薄膜的方法62。因此碳納米管在透明柔性生物電子器件領(lǐng)域具有極大應(yīng)用潛力。通過浮動(dòng)催化劑化學(xué)氣相沉積法(floating catalyst chemical vapor deposition，F(xiàn)CCVD)制備得到的碳納米管既可進(jìn)一步紡成纖維46，也可在乙醇中經(jīng)過致密化形成二維網(wǎng)絡(luò)，后者可用于制備透明電極。

Zhang等63制備了基于碳納米管網(wǎng)狀薄膜的可拉伸透明電極陣列(如圖7a所示)，其中，電極以PDMS作為基底，SU-8作為封裝層。該電極在400 nm到2.5 μm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的透光率超過85%，并且在20%的拉伸下透光率保持穩(wěn)定。碳納米管薄膜透明電極具有較低的阻抗和較高的電荷儲(chǔ)存容量，在反復(fù)拉伸下阻抗變化極小。研究中將電極放置于小鼠脾后皮層(Retrosplenial cortex，RSC)表面，實(shí)現(xiàn)了光遺傳刺激下的電生理記錄(如圖7b所示)，同時(shí)，此電極具有比Au電極更小的光偽跡(如圖7c所示)，可忽略不計(jì)。將電極置于大鼠初級(jí)視覺皮層，在誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作下，實(shí)現(xiàn)了同步雙光子鈣成像和ECoG信號(hào)記錄(如圖7d所示)。最后，基于該電極陣列優(yōu)異的可延展性，作者還實(shí)現(xiàn)了麻醉態(tài)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷下皮層腦電信號(hào)的原位、連續(xù)實(shí)時(shí)的檢測(cè)，展示了該電極陣列在機(jī)械活性神經(jīng)系統(tǒng)(包括創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓等)中的應(yīng)用潛力。

4 基于碳納米材料的MRI兼容電極

應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的電刺激可用于改善癲癇、帕金森、抑郁、聽力損失和慢性疼痛等癥狀16。在電刺激中，電荷注入量不可超過電極材料本身的最大電荷注入密度，以避免發(fā)生不可逆法拉第反應(yīng)64，因?yàn)檫@種在電極-組織界面發(fā)生的不可逆法拉第反應(yīng)會(huì)損傷電極和周圍組織49,65。因此，對(duì)神經(jīng)刺激應(yīng)用來說，需要尋找具有低阻抗和高電荷注入能力的神經(jīng)電極材料64，同時(shí)還應(yīng)考慮電極在體內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性問題。

圖6 柔性透明的石墨烯角膜接觸鏡電極61Fig.6 Soft transparent graphene contact lens electrodes (GRACE)61.

功能磁共振成像(Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI)為全腦規(guī)模的神經(jīng)活動(dòng)繪制和神經(jīng)環(huán)路的探索提供了有利工具66，將其與DBS技術(shù)聯(lián)用可以更好的研究大腦功能和連接模式，以及電刺激的調(diào)控效果和機(jī)理，這對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診療具有重要意義。偽影是評(píng)估醫(yī)療器件是否具有MRI兼容性的重要因素67，由神經(jīng)電極產(chǎn)生的偽影會(huì)阻礙MRI對(duì)周圍組織結(jié)構(gòu)的確定67，并影響對(duì)電極位置的判斷。一些金屬電極與生物組織的磁化率不匹配，會(huì)干擾磁場(chǎng)，導(dǎo)致在電極周圍產(chǎn)生很大偽影67-70，影響了腦區(qū)的MRI信號(hào)的獲得66；尤其是廣泛應(yīng)用于fMRI的回波平面成像(echo-planar imaging，EPI)序列，因?yàn)閷?duì)磁化率不匹配更加敏感，使得fMRI更易受到植入物引起的場(chǎng)畸變的影響。因此，fMRI-DBS聯(lián)用的關(guān)鍵是對(duì)電極材料和電極尺寸的選擇。具有與水/組織相近的磁化率、高電荷注入能力的小尺寸電極，可以有效減小MRI偽影和組織損傷，并提高電刺激分辨率32，可實(shí)現(xiàn)DBS下大腦全激活圖譜的獲得。文獻(xiàn)報(bào)道石墨烯和碳納米管可用于制備MRI兼容的神經(jīng)電極，實(shí)現(xiàn)對(duì)電極周圍組織的MRI可視化及電極位置的確定31。

圖7 透明碳納米管電極63Fig.7 Transparent carbon nanotubes electrodes 63.

多孔結(jié)構(gòu)和大比表面積的石墨烯纖維(graphene fiber，GF)具有較高的電荷注入能力，將其作為刺激電極或用于修飾神經(jīng)電極的刺激位點(diǎn)，可在不損失刺激效率的前提下得到小尺寸電極，從而可以提高神經(jīng)刺激的空間分辨率和選擇性。Zhao等32研制了一種基于GF的高度MRI兼容的DBS電極，這種電極主要由水熱法合成的石墨烯纖維以及纖維表面沉積的parylene-C絕緣層所構(gòu)成(如圖8a所示)，該電極具有比同尺寸PtIr電極更高的電荷注入能力和高穩(wěn)定性，同時(shí)在9.4 T MRI下具有更小的偽影(如圖8b所示)。以帕金森癥大鼠的丘腦底核(subthalamic nucleus，STN)為刺激靶點(diǎn)，利用此石墨烯纖維雙極電極進(jìn)行DBS，有效的提高了大鼠運(yùn)動(dòng)能力，改善了帕金森癥狀。作者在帕金森癥的模型大鼠中實(shí)現(xiàn)了DBS-fMRI的同步聯(lián)用，以STN為靶點(diǎn)，得到了DBS激活的包括刺激靶點(diǎn)在內(nèi)的完整fMRI圖譜，發(fā)現(xiàn)帕金森大鼠運(yùn)動(dòng)速度的提高和大鼠運(yùn)動(dòng)皮層(motor cortices)、內(nèi)側(cè)和外側(cè)蒼白球(internal globus pallidus，GPi；external globus pallidus，GPe)、丘腦底核和尾狀殼核(caudate putamen)的血氧水平依賴(blood-oxygenationlevel-dependent，BOLD)響應(yīng)正相關(guān)，這些結(jié)果暗示了DBS的機(jī)理有可能是通過正向和反向激活運(yùn)動(dòng)回路共同實(shí)現(xiàn)的。

Guo等31比較了碳納米管纖維電極和PtIr電極在3T MRI掃描下的偽影，其中碳納米管纖維電極具有更小的炎癥反應(yīng)和幾乎不可見的MRI偽影。

前述Lu等33的工作發(fā)現(xiàn)所制備的碳納米管纖維神經(jīng)電極具有很高的MRI兼容性，與PtIr電極相比，碳納米管纖維電極具有更小的MRI偽影(如圖8c所示)，可以允許對(duì)電極植入位置和周圍腦組織的MRI可視化。

5 碳納米材料神經(jīng)電極的生物安全性

雖然碳納米材料在生物電子學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但仍需考慮其生物安全性問題。文獻(xiàn)報(bào)道具有一定尺寸和結(jié)構(gòu)的石墨烯和碳納米管可與細(xì)胞膜相互作用或被細(xì)胞攝取71-73；同時(shí)可誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生而具有潛在的細(xì)胞毒性73，并且ROS的產(chǎn)生水平具有材料濃度和接觸時(shí)間的依賴性。當(dāng)PC12細(xì)胞暴露于100 μg·mL-1的石墨烯納米片4 h后，ROS的水平相比于對(duì)照組增長(zhǎng)了5倍，說明氧化應(yīng)激機(jī)制參與了細(xì)胞毒性的產(chǎn)生過程73。因此，碳納米材料的毒性問題一直以來受到廣泛關(guān)注72,74。

圖8 MRI兼容的基于碳納米材料的神經(jīng)電極Fig.8 MRI compatible neural electrodes made from carbon nanomaterials.

目前，對(duì)于碳納米材料細(xì)胞毒性的報(bào)道多是基于石墨烯和碳納米管的懸浮液。當(dāng)碳納米材料以懸浮液形式存在時(shí)，具有更高的流動(dòng)性，可以進(jìn)入細(xì)胞，并分散在細(xì)胞質(zhì)中而具有細(xì)胞毒性41,75。碳納米材料的細(xì)胞毒性效應(yīng)受到諸多因素的影響，包括純度、尺寸分布、分散和聚集狀態(tài)、表面功能化以及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)變量(如使用劑量、細(xì)胞群)72,76-78。值得注意的是，上述這些因素間存在相互作用，當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞毒性研究時(shí)，應(yīng)當(dāng)充分考慮這些相互作用。

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的釋放標(biāo)志著細(xì)胞膜的損傷和細(xì)胞壞死，Zhang等73發(fā)現(xiàn)將PC12細(xì)胞暴露于高濃度(100 μg·mL-1)石墨烯納米片溶液24 h后，LDH的釋放量增加，但低濃度(0.01-10 μg·mL-1)石墨烯對(duì)LDH的釋放沒有影響；相比之下，單壁碳納米管誘導(dǎo)了更嚴(yán)重的LDH的釋放，且釋放量隨濃度的增加而增大；這可能是因?yàn)樘技{米管更具有流動(dòng)性，更容易穿透細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。

Belyanskaya等76探究了單壁碳納米管(singlewalled carbon nanotubes，SWCNTs)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響。將神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞暴露于不同濃度的SWCNTs懸浮液中，其中，30 μg·mL-1的SWCNTs使DNA含量降低了35%，暗示了細(xì)胞數(shù)量的降低，DNA含量的降低存在著SWCNTs濃度的依賴性，且SWCNTs的團(tuán)聚程度越大，毒性也越大。

但是，基于碳納米材料的神經(jīng)電極未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，主要是因?yàn)橛糜跇?gòu)筑或修飾神經(jīng)電極的碳納米材料以非溶液態(tài)形式存在，將其制備成纖維、沉積在基底上或嵌入到其它聚合物基質(zhì)中時(shí)，可避免脫落并降低其在體內(nèi)擴(kuò)散及殘留的可能性46,79，其危險(xiǎn)性也大大降低，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的毒性效應(yīng)。如前述Zhang等11工作中，將碳納米管分散在PSS溶液中，之后通過LBL自組裝法在涂覆了PVA的基底上沉積成膜，制備得到CNT:PSS/PVA復(fù)合物電極。將電極植入腦組織后再移出，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)保持完整且無明顯脫落現(xiàn)象，證明了碳納米管可牢固附著于基底上。在神經(jīng)元生長(zhǎng)的研究中80，功能化的多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWNTs)表面攜帶正電荷，可在聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)基底上沉積成膜，PEI的存在避免了MWCNTs的剝落。MWNTs基底表現(xiàn)出良好的生物相容性并可促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)。Chen等79將PEDOT-碳納米管沉積到預(yù)先濺射了Au的基底上，形成了具有納米隧道結(jié)構(gòu)的復(fù)合物涂層。在此研究中，碳納米管嵌入到PEDOT基質(zhì)中，降低了其在體內(nèi)擴(kuò)散的可能性。在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，神經(jīng)元可緊密附著于PEDOT-碳納米管涂層上，并促進(jìn)了神經(jīng)突的生長(zhǎng)。此外，將PEDOT-碳納米管沉積到電極位點(diǎn)，可進(jìn)行大鼠坐骨神經(jīng)的急性信號(hào)記錄。由此可看到，通過優(yōu)化基于碳納米材料電極的制備方法，可避免碳納米材料在生物體內(nèi)的脫落與擴(kuò)散，證明了碳納米材料可用于構(gòu)筑生物相容性的神經(jīng)界面。

面對(duì)碳納米材料生物效應(yīng)的廣泛討論，應(yīng)該避免對(duì)其毒性問題的普遍化或一般化，因?yàn)榕c這些納米材料相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)取決于具體的應(yīng)用環(huán)境72；另外，石墨烯和碳納米管的結(jié)構(gòu)不同，其與細(xì)胞相互作用的機(jī)制也不相同73，導(dǎo)致兩者對(duì)細(xì)胞的毒性存在差異。因此，應(yīng)對(duì)石墨烯與碳納米管的生物相容性進(jìn)行分別評(píng)估24。未來的研究需要根據(jù)碳納米材料的不同物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行生物安全性的全面探索，設(shè)計(jì)并優(yōu)化碳納米材料的制備工藝，以最大限度地降低對(duì)人類健康和環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)。

6 總結(jié)與展望

碳納米材料為柔性和多模態(tài)兼容的神經(jīng)電極技術(shù)的發(fā)展注入了新的活力，基于石墨烯和碳納米管的神經(jīng)電極實(shí)現(xiàn)了同步電生理測(cè)量和光學(xué)調(diào)控以及DBS-fMRI的聯(lián)用，為大腦神經(jīng)環(huán)路的研究及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的DBS治療研究提供了有力工具。然而，對(duì)于碳納米材料在基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)研究和臨床中的應(yīng)用來說，仍然存在很多挑戰(zhàn)。首先，如何改善碳納米材料的制備和加工方法，以獲得結(jié)構(gòu)、純度、功能化狀態(tài)等一致可控的神經(jīng)電極，從而提高其生物安全性，仍是需要解決的問題。其次，需要發(fā)展小尺寸且多位點(diǎn)集成的神經(jīng)電極，以實(shí)現(xiàn)大范圍神經(jīng)活動(dòng)的檢測(cè)。此外，迄今為止大多數(shù)神經(jīng)電極的研究是在哺乳動(dòng)物模型中進(jìn)行的，因此，還需要考慮到動(dòng)物模型與人類在力學(xué)、形態(tài)、組織等方面的異同，并進(jìn)一步改善神經(jīng)電極的尺寸和結(jié)構(gòu)。最后，很多臨床應(yīng)用需要植入物在數(shù)年的時(shí)間尺度內(nèi)工作，碳納米材料在這個(gè)長(zhǎng)時(shí)間尺度內(nèi)的穩(wěn)定性和安全性也急需評(píng)估。因此，基于碳納米材料的神經(jīng)電極在面向臨床轉(zhuǎn)化前仍需要進(jìn)行諸多研究工作，以構(gòu)筑電極與生物組織之間高效且穩(wěn)定的神經(jīng)界面，實(shí)現(xiàn)高分辨、安全且長(zhǎng)期穩(wěn)定的神經(jīng)記錄和刺激。