陳玉娟，趙瑤，馬鮮平，高麗旭，姚婷，劉倩如，謝遠(yuǎn)兵，易華山

（1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市永川區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 402160）

奶牛乳房炎（Cow mastitis）的病原菌主要是一些條件性和傳染性的致病菌。在伊朗，據(jù)Batavani[1]報(bào)道，引起乳房炎的前三大病原菌包括蠟樣芽孢桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，需氧，產(chǎn)孢子，是廣泛分布于土壤、水、空氣、飼料、食品和環(huán)境中的一種條件致病菌，存在于奶牛養(yǎng)殖環(huán)境之中，B.cereus甚至?xí)云渌≡鸀橐劳?，更加快速地定植和黏附在乳房上皮?xì)胞之中，從而加快整個(gè)病程，且易導(dǎo)致奶牛死亡[2]。近年來(lái)，在我國(guó)新疆、寧夏等地B.cereus的檢出率較以前明顯增加[3]，而且它產(chǎn)生的腸毒素有致吐和致瀉作用，易導(dǎo)致人食物中毒；感染奶牛泌乳量下降，甚至失去泌乳能力，給全球畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重的損失[4,5]。B.cereus腸毒素可分為嘔吐型和腹瀉型兩類[6]，主要毒力因子分別為：與嘔吐毒素相關(guān)的非核糖體多肽合成酶系（NRPS）基因[7]；與腹瀉毒素相關(guān)的溶血性BL基因（hb1A、hb1B、hb1C和hb1D）、非溶血性腸毒素Nhe基因（nheA、nheB和nheC）、腸毒素FM基因（entFM）、腸毒素T基因（bceT）和細(xì)胞毒素K基因（cytK）[8,9]。不同菌株中毒力基因的攜帶數(shù)目不相同，各毒力基因的攜帶率亦有差異。有研究測(cè)得菌株各毒力基因的攜帶率分別為非溶血性Nhe基因（89.19%）、entFM基因（79.88%）、bceT基因（49.85%）、溶血性BL基因（48.35%）、ctyK基因（47.75%）和嘔吐毒素相關(guān)基因ces（1.50%）。嘔吐型腸毒素又稱為耐熱的腸毒素，其對(duì)奶牛乳房炎有明顯的致病作用[10]，但是該毒素的致病機(jī)理及致病的具體作用尚不清楚；腹瀉型腸毒素又稱為不耐熱的腸毒素，可導(dǎo)致奶牛流產(chǎn)[11]。本研究對(duì)耐藥性奶牛乳房炎患牛乳液中分離的一株蠟樣芽孢桿菌2018CQ-CMM01（B.cereus2018CQ-CMM01）腸毒素基因進(jìn)行了克隆和序列分析，以期為耐藥性奶牛乳房炎致病菌毒素相關(guān)基因的分子生物學(xué)研究及奶牛乳房炎的防治等提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 菌株

從榮昌某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)乳房炎患牛乳液中分離的蠟樣芽孢桿菌2018CQ-CMM01株（B.cereus2018CQCMM01），70%甘油、-80℃保存菌液（由西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院獸醫(yī)科學(xué)研究中心保存）。

1.1.2 主要試劑

瓊脂糖，購(gòu)自華美生物工程公司；蛋白胨，購(gòu)自O(shè)xoid公司；EB溶液、50×TAE，購(gòu)自北京博奧華醫(yī)生物科技有限公司；10×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司公司；動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自康寧生命科學(xué)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

參照GeneBank收錄的B.Cereus的基因序列（NZ_CP030982.1），利用引物設(shè)計(jì)軟件Premer Primer5.0設(shè)計(jì)entFM基因引物F：5’-GTTCGTTCAGGTGCTGGTAC-3’，R： 5’-AGCTGGGCCTGTACGTACTT-3’。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1．2 方法

1.2.1 DNA的提取

取蠟樣芽孢桿菌2018CQ-CMM01株細(xì)菌培養(yǎng)液5mL，10 000r/min（11 500×g）離心1min，盡量吸凈上清，參照北京天根信息技術(shù)公司提供的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）操作說(shuō)明提取基因組DNA。

1.2.2 目的基因擴(kuò)增及測(cè)序

以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，以entFM基因引物F和R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為20μ L。反應(yīng)條件：95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5min；94℃ 45s，55℃ 1min，72℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于0.01g/mL的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓、電流分別為150V、194mA，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京華大基因生物有限公司測(cè)序。

1.2.3 目的基因生物信息學(xué)分析

利用Expasy中的ProtParam程序（http://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)等特征數(shù)，并分析其穩(wěn)定性、疏水性等理化特性；通過(guò)Protscale平臺(tái)（http://web.expasy.org/protscale/）分析該蛋白的親疏水性；應(yīng)用SOPMA在線軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)Ent蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；借助SignalP平臺(tái)（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）檢測(cè)其信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，用TargetP2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）預(yù)測(cè)該蛋白是否含切割位點(diǎn)；利用CBS Prediction servers的TMHMM（http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)Ent蛋白的跨膜區(qū)。

1.2.4 Ent基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)得的Ent核苷酸序列與NCBI中檢索的22株相似序列進(jìn)行核酸水平和蛋白水平的對(duì)比。利用NCBI的Blast Tree View Widget功能繪制Ent基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用DNAMan軟件對(duì)Ent基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.5 Ent基因內(nèi)一段小ORFs的序列分析

利用DNAStar中Editseq功能進(jìn)一步分析Ent基因特性，并對(duì)得到的ORFs序列進(jìn)行分析。用NCBI的Blastx功能分析這段ORFs的同源性和保守性結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2．1 Ent基因PCR擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)蠟樣芽孢桿菌2018CQ-CMM01株的活化培養(yǎng)，提取基因組DNA，利用EntF和EntR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.01g/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，大約在1 100bp處有特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

圖1 Ent基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2．2 Ent基因序列測(cè)定

經(jīng)測(cè)序表明，Ent克隆基因片段長(zhǎng)度為1 098bp，共編碼349個(gè)氨基酸。

2．3 Ent基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 Ent蛋白理化特性分析

通過(guò)ProtParam程序分析得到，Ent蛋白理論分子質(zhì)量（MW）為40 324.06，分子式為C1844H2763N435O507S37，原子總數(shù)為5 586；理論等電點(diǎn)(pl)為8.52，為堿性氨基酸；在氨基酸組成上，Ser（S）49個(gè)，占14.0%，含量最高，其次Val（V）39個(gè)，占11.2%，Thr（T）36個(gè)，占10.3%；不穩(wěn)定性指數(shù)（ⅱ）計(jì)算為42.11，因此將其歸類為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為93.41，總平均親水性（GRAVY）為0.705，屬于疏水性蛋白。利用ProtScale在線軟件計(jì)算疏水性圖譜，發(fā)現(xiàn)整個(gè)蛋白質(zhì)中疏水性最大值在第97位氨基酸，為4.367，最小值在第67位氨基酸，為-1.856，且Ent蛋白疏水區(qū)域大于親水區(qū)域，為疏水性蛋白，與其預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖2）。

圖2 Ent蛋白的疏水性分析

2.3.2 Ent蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SOPMA平臺(tái)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ent蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成元素為延伸鏈，含141個(gè)，占40%，其次為無(wú)規(guī)則卷曲97個(gè)，占27.79%，α-螺旋95個(gè)，占27.22%，β-轉(zhuǎn)角16個(gè)，占4.58%（圖3），幾種結(jié)構(gòu)均無(wú)規(guī)律散在分布。

圖3 Ent蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3.3 Ent蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)分析

經(jīng)SignalP數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在其N端27～28位有僅29.98%的可能存在信號(hào)肽；TargetP2.0分析結(jié)果表明該序列切割位點(diǎn)存在的可能極低，為16.91%，綜合兩種軟件的分析結(jié)果，預(yù)測(cè)該Ent蛋白不存在信號(hào)肽或切割位點(diǎn)，是一種非分泌蛋白。利用TMHMM對(duì)Ent蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示克隆片段編碼蛋白存在5個(gè)明顯的跨膜區(qū)，大概是在3～27位、78～102位、115～139位、273～297位、305～324位（圖4），該蛋白為跨膜蛋白。

圖4 Ent基因蛋白跨膜區(qū)

2．4 Ent基因序列分析結(jié)果

2.4.1 Ent基因核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果及分析

本研究中，Ent克隆基因核苷酸序列與不同腸毒素同源性對(duì)比分析可得，與B.cereus克隆Pnc9腸毒素FM樣基因部分序列（EF453659.1）相似度為96.45%，與B.cereus克隆Pnc10腸毒素FM基因部分cds（EF453660.1）相似度為95.54%，與B. cereus克隆Pnc6腸毒素FM基因部分cds（EF453657.1）相似度為95.36%，與B.cereus克隆Pnc1腸毒素FM基因部分cds（EF453652.1）相似度為95.29%，且通過(guò)與DNAMan軟件分析核苷酸序列同源性，發(fā)現(xiàn)該基因與上述同源基因的同源性為95.22%，存在部分的缺失、插入及替換。將該Ent基因核苷酸序列與溶芽孢桿菌FJ部分序列（CP040336.1）、蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10792部分序列（CP020754.1）、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10987部分序列（CP026375.1）作同源性對(duì)比，相似度分別為100%、96.63%和95.81%。

2.4.2 Ent基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用Blast Tree View Widget在線軟件將測(cè)得Ent核苷酸序列與NCBI中檢索的22株相似序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，這些序列分別是中國(guó)菌株CP040336.1（2018-01-05）、CP011151.1（1979）、CP024655.1（2008-03）、CP040334.1（2017-12-27）、CP012483.1（2014-03-30）、CP022445.1（2003-07-10）、CP026607.1（2008-10）、CP010577.1（1987）、CP020002.1（2015-10-02）；美國(guó)菌株CP020754.1（1946）、CP053972.1、CP001186.1、CP001177.1、CP003763.1；韓國(guó)菌株CP017060.1（2015-08-16）、CP029454.1（2016-01-01）、CP041981.1（2013-05-20）；泰國(guó)菌株EF453659.1、EF453660.1、EF453657.1、EF453652.1；巴基斯坦B. cereus標(biāo)準(zhǔn)株CP026375.1。結(jié)果表明，Ent基因與中國(guó)菌株CP040336.1同源性最高，與巴基斯坦B. cereus標(biāo)準(zhǔn)株CP026375.1，泰國(guó)株EF453659.1、EF453660.1、EF453657.1等處于不同進(jìn)化分支；而中國(guó)的CP011151.1、CP024655.1與美國(guó)的CP020754.1、CP053972.1等其他參考菌株位于不同的兩個(gè)進(jìn)化分支上，表明該基因與中國(guó)菌株CP040336.1的遺傳距離最近，其次與亞洲的泰國(guó)菌株親緣關(guān)系較近（圖5）。

圖5 基于 Ent基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2．5 Ent基因編碼區(qū)內(nèi)小ORFs

2.5.1 編碼區(qū)內(nèi)ORFs

利用DNAStar的Editseq功能進(jìn)一步研究該基因特性，得到一段長(zhǎng)為141bp的ORFs，序列如下：

ATGAATCCACTGCAGTCAAAACCAGCAGGTGT TGTACCAGCAGTTCTGTATGGTGAACCATTTAAAGA TCTAGCGAATCCAGCGATTGAAGATGTATTTCCACC TGTTGTTGGTTTTTGTACGTCTTTACCTGGTTGTTGA

2.5.2 ORFs（141bp）分子特征分析

用DNAstar軟件包中的Editseq功能對(duì)141bp的ORFs進(jìn)行了翻譯，翻譯結(jié)果為：MNPLQSKPAGVV PAVLYGEPFKDLANPAIEDVFPPVVGFCTSLPGC。通過(guò)分析可知，該蛋白含有46個(gè)氨基酸，理論分子量為4.7ku，等電點(diǎn)PI值為4.1。用NCBI的Blastx功能對(duì)ORFs（141bp）核苷酸序列到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（表1），分析其同源性及保守性結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白與魏氏芽孢桿菌P60肽酶（PEM24067.1）的部分序列相似性為98%，與蠟樣芽孢桿菌內(nèi)肽酶（WP_074532117.1、PFW58890.1等）的相似性為100%，與蠟狀芽孢桿菌ATCC 1087 的SH3結(jié)構(gòu)域蛋白（KFL74150.1）的相似性為98%，與移動(dòng)桿菌內(nèi)肽酶（WP_120449857.1）的相似性為98%，與蘇云金芽孢桿菌內(nèi)肽酶（WP_103577936.1）部分序列的相似性為98%，表明該蛋白與蠟樣芽孢桿菌內(nèi)肽酶的同源性最高。由保守結(jié)構(gòu)域分析可知，該結(jié)構(gòu)域與Spr特異性位點(diǎn)、NLPC_P60非特異性位點(diǎn)和NLPC_P60家族有相似的保守性結(jié)構(gòu)域（表2）。該結(jié)構(gòu)域與Spr特異性位點(diǎn)、NLPC_P60非特異性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列對(duì)比詳見(jiàn)圖6，紅色字體為相同的保守氨基酸位點(diǎn)。Spr特異性位點(diǎn)有細(xì)胞壁相關(guān)水解酶作用，而NLPC/P60家族存在于幾種脂蛋白中，空間結(jié)構(gòu)域?yàn)槎嗑垠w（圖7）。根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)同源性對(duì)比及保守性分析，推測(cè)該ORFs為與蠟樣芽孢桿菌組R309803（EEK79374.1）腸毒素相關(guān)的新基因或調(diào)控因子。

表1 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)同源性對(duì)比表

表2 ORFs保守性結(jié)構(gòu)域

圖6 ORFs保守性結(jié)構(gòu)域與保守性氨基酸位點(diǎn)

圖7 NLPC_P60家族結(jié)構(gòu)域模式圖

3 討論

腸毒素被認(rèn)為是引起食物中毒的一種重要因素，腸毒素在體內(nèi)促使體液和電解質(zhì)從腸道黏膜中流失，引起一系列的腸道病理變化從而出現(xiàn)腹瀉癥狀。腸毒素還包括腸毒素T、腸毒素FM（EntFM）及腸毒素K（CytK），它們都為單一蛋白組分，分別由bceT、entS和cytK（entK）基因編碼[12]。但是本研究中Ent基因在ORF的第137～277位，存在一個(gè)小的ORFs編碼區(qū)，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該區(qū)編碼的氨基序列與蠟樣芽孢桿菌內(nèi)肽酶表現(xiàn)出極高的同源性，且該區(qū)的結(jié)構(gòu)域與Spr特異性位點(diǎn)、NLPC_P60非特異性位點(diǎn)和NLPC_P60家族有相似的保守性結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明他們可能存在功能上的相關(guān)性和進(jìn)化上的同源性。

本研究對(duì)Ent核苷酸序列與NCBI中檢索的22株相似序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)克隆的Ent基因與中國(guó)菌株CP040336.1同源性極高而與大部分其他中國(guó)參考菌株的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，但是核苷酸序列一致性在95%以上，這可能與國(guó)內(nèi)對(duì)蠟樣芽孢桿菌的研究較少有關(guān)。將Ent基因克隆片段與不同腸毒素進(jìn)行核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)它們的同源性高達(dá)95.22%，一定程度上說(shuō)明腸毒素基因的高度保守性。Je?berger等人的研究也證明腸毒素基因nheABC和hblCDA有強(qiáng)遺傳保守性[13]；同時(shí)，該Ent基因存在部分的缺失、插入及替換，由此推測(cè)，這些突變可能是毒株毒力發(fā)生變化的主要原因。該Ent基因核苷酸序列與溶芽孢桿菌FJ部分序列和蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10792部分序列也表現(xiàn)出較高的同源性，說(shuō)明腸毒素基因在進(jìn)化上的多樣性。

嘔吐型腸毒素（Cereulide）是蠟樣芽孢桿菌通過(guò)非核糖體途徑合成的，其是一種環(huán)狀十二肽，最適溫度為12～22℃，受多種環(huán)境因素的調(diào)節(jié)影響，因其耐熱性和穩(wěn)定性，在巴氏殺菌、加熱和胃內(nèi)消化過(guò)程中難以被消滅而致病[14～17]。腹瀉型毒素主要有Hbl、Nhe和CytK，其中Hbl和Nhe 都是由三個(gè)亞基組成的毒素[18～20]，而CytK是一種可形成β-桶的溶血性毒素，該毒素可使細(xì)胞形成孔洞從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死[21]。研究表明細(xì)菌毒素能在細(xì)胞膜上形成孔洞，這種孔洞會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈉離子（Na+）和氯離子（Cl-）的流失，使細(xì)胞的電位失去平衡而導(dǎo)致腹瀉[22,23]。本研究將蠟樣芽孢桿菌腸毒素Ent基因上一個(gè)141bp的ORFs核苷酸序列到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該編碼區(qū)能編碼桿菌通道蛋白相關(guān)的內(nèi)肽酶，可能成為與蠟樣芽孢桿菌組R309803（EEK79374.1）腸毒素毒力相關(guān)的調(diào)控原件或調(diào)控因子。該小ORFs編碼的通道蛋白及酶蛋白是否參與孔洞的形成機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)乳源蠟樣芽孢桿菌Ent基因的分析結(jié)果將為進(jìn)一步探究其功能和表達(dá)機(jī)制提供基因材料，也為科學(xué)地預(yù)防奶牛乳房炎提供分子水平的依據(jù)。同時(shí)，蠟樣芽孢桿菌作為一種常見(jiàn)的食源性條件致病菌，是市售食品污染來(lái)源的關(guān)鍵因素。因此加強(qiáng)對(duì)乳源及食品中蠟樣芽孢桿菌污染的監(jiān)控，建立一種簡(jiǎn)便可靠的檢測(cè)方法及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估亟待研究。

4 結(jié)論

本研究克隆了奶牛乳源蠟樣芽孢桿菌Ent基因ORF為1 098bp，編碼349個(gè)氨基酸；該蛋白為堿性的疏水性蛋白，不穩(wěn)定，無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，存在5個(gè)跨膜區(qū)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈組成。在基因ORF內(nèi)存在一個(gè)大小為141bp的小的ORFs編碼區(qū)，對(duì)141bp小ORFs區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其編碼桿菌通道蛋白相關(guān)的內(nèi)肽酶，可能是毒力基因調(diào)控因子；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明Ent基因與中國(guó)菌株CP040336.1的遺傳距離最近，與巴基斯坦B.cereus標(biāo)準(zhǔn)株CP026375.1，泰國(guó)株EF453659.1、EF453660.1等處于不同進(jìn)化分支上。