甘衛(wèi)澤，李益濤，曹夢園，李傲寒，張莉，齊亞銀

(1.昌吉州動物疾病預(yù)防控制中心，昌吉 831100；2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750000）

奶牛乳房炎會給牧場帶來棄奶、用藥殘留、乳品質(zhì)下降以及傳染牛只淘汰等重大損失，也可導(dǎo)致奶酪、凝乳等奶制品質(zhì)量下降[1～3]。乳房炎的發(fā)生原因非常復(fù)雜，一般可分為機械、物理、化學(xué)、微生物、飼養(yǎng)管理等多種因素單個或共同作用產(chǎn)生。

導(dǎo)致奶牛乳房炎常見的病原菌主要有接觸傳染型病原菌（包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、牛支原體、牛棒狀桿菌等），以及環(huán)境型病原菌（包括葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、原壁菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿隱秘桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、酵母菌、腸球菌等）。其中金黃色葡萄球菌是最常見的一種細菌，一旦感染很難徹底治療，后期會轉(zhuǎn)為慢性感染且耐藥性極強，同時金黃色葡萄球菌還可以危及人類健康，對公共食品衛(wèi)生安全造成一定的威脅[4,5]。

為此，本研究為了查明某規(guī)模化牧場奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的感染及耐藥現(xiàn)狀，采集隱性乳房炎源乳樣，采用常規(guī)微生物學(xué)結(jié)合16S rRNA 細菌鑒定的方法，進行金黃色葡萄球菌的分離鑒定，同時對其藥敏表型及耐藥基因進行檢測，以期為進一步制定有效防控措施提供科學(xué)指導(dǎo)意見。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 乳樣來源

無菌采集812份乳樣（經(jīng)現(xiàn)場檢測為隱性乳房炎），于4℃冷鏈保存運輸至實驗室備用。

1.1.2 主要試劑及藥品

LB肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉（上海生工生物工程股份有限公司）；甘露醇高鹽瓊脂（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；革蘭氏染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；藥敏紙片（頭孢喹肟、環(huán)丙沙星、紅霉素、阿奇霉素、青霉素、卡那霉素、頭孢噻吩、多西環(huán)素、阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林鈉、頭孢曲松，杭州濱和微生物試劑有限公司）。

1．2 菌株的篩選及鑒定

1.2.1 菌株的篩選及初步鑒定

無菌操作，將乳樣接種于LB肉湯，37℃培養(yǎng)24h；然后采取連續(xù)劃線的方法接種在甘露醇高鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。挑取黃色且周圍有黃色環(huán)的菌落進行涂片、革蘭氏染色、顯微鏡觀察，同時將疑似菌株再次接種于甘露醇高鹽培養(yǎng)基上用于再一次鑒定和純化。

1.2.2 分離株的16S RNA鑒定

提取細菌D N A保存于-2 0℃?zhèn)溆?。根?jù)張蕾等[6]研究設(shè)計金黃色葡萄球菌1 6 S R N A的引物，大小為1 4 6 6 b p，其引物序列：上游引物16S-F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；下游引物16S-R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。反應(yīng)體系為20μL，其中2xEs Taq MsterMix10μL，ddH2O 7μL，上下游引物各1μL，細菌DNA模板1μL。

PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性45s，56℃退火45s，75℃延伸1.5min；30個循環(huán)；72℃終延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取8～10μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測。

1．3 分離株的藥物敏感性試驗

1.3.1 分離株的藥敏表型檢測

根據(jù)紙片法（Kirby-Baure法）進行藥敏實驗。將分離培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌落接種于肉湯培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)至超過0.5麥氏單位，取出用鹽水或肉湯調(diào)節(jié)菌液至0.5麥氏單位，含菌量（1～2）×108CFU/mL。無菌操作：在MH瓊脂板上均勻涂菌，室溫放置3～5min。用鑷子取不同的藥敏紙片，貼于瓊脂表面，不同藥敏紙片的間距至少24mm，在平板貼6張藥敏紙片。將粘貼完藥敏紙片的平板置35℃孵育18～24h后，測量抑菌圈直徑。

參照美國臨床實驗室國家標準化管理委員會標準（CLSI2008）判定。

1.3.2 耐藥基因的檢測

設(shè)計耐四環(huán)素tetK基因、慶大霉素-卡那霉素aacA-aphD基因、利福霉素類rpoB基因、β-內(nèi)酰胺類blaZ、norA基因、喹諾酮類sepA基因、消毒劑Smr-1、ade B基因的引物。具體引物序列和所查閱文獻如表1所示。

表1 分離株耐藥基因引物序列

具體反應(yīng)程序如表2所示。

表2 各耐藥基因PCR體系

2 結(jié)果與分析

2．1 分離株的初步鑒定及形態(tài)學(xué)特征

奶樣在甘露醇高鹽培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為黃色并且周圍有黃色圓圈；菌液劃線于甘露醇高鹽的培養(yǎng)基上長出的菌落符合金黃色葡萄球菌的特性；金黃色葡萄球菌經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下呈球型，排列呈葡萄串狀，無芽孢、鞭毛，無莢膜（圖1）。

圖1 分離株葡萄球菌形態(tài)學(xué)特征

2．2 PCR鑒定結(jié)果

擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物大小與預(yù)期大小一致，為1 466bp（圖2）。

圖2 部分金黃色葡萄球菌16S RNA的PCR電泳結(jié)果圖

2．3 藥敏表型檢測結(jié)果

表3 部分分離株的藥敏實驗結(jié)果

選取的105份樣品中對頭孢噻肟敏感的占46.67%，耐藥的占33.33%，中介占20.00%；對環(huán)丙沙星敏感的占40.00%，耐藥的占53.33%，中介的占6.67%；對紅霉素敏感的占26.67%，耐藥的占66.67%，中介的占6.67%；對阿奇霉素敏感的占13.33%，耐藥的占60.00%，中介的占26.67%；對青霉素G敏感的占6.67%，耐藥的占93.33%；對卡那霉素敏感的占40.00%，耐藥的占46.67%，中介的占13.33%；對頭孢噻吩敏感的占26.67%，耐藥的占60.00%，中介的占13.33%；對強力霉素敏感的占40.00%，耐藥的占60.00%；對阿莫西林敏感的占20.00%，耐藥的占80.00%；對氨芐青霉素敏感的占13.33%，耐藥的占86.67%；對苯唑青霉素敏感的占40%，耐藥的占60.00%；對頭孢曲松鈉敏感的占53.33%，耐藥的占13.33%，中介的占33.33%。具體結(jié)果如表3所示。

2．4 耐藥基因檢測結(jié)果

通過PCR檢測其耐藥基因結(jié)果：在新疆地區(qū)分離的105株金黃色葡萄球菌中，有6種毒力基因的檢出率超過50%。其中blaZ為94.4%，norA為95.23%，rpoB為63.4%，ade B為54.2%，sepA為56.3%，tetK為61.1%；另外兩種耐藥基因的檢出率Smr-1為40.95%，aacA-aphD為46.67%。

3 討論

本試驗根據(jù)國標中甘露醇高鹽培養(yǎng)基篩選金黃色葡萄球菌的方法進行篩選，其中高濃度的氯化鈉可以抑制其他菌種，檢測結(jié)果與PCR一致，準確性高[13]。金黃色葡萄球菌的分離率為26.60%，為該牧場奶牛乳房炎的一個重要致病因素。目前臨床上對奶牛乳房炎已有一定的預(yù)防手段，但其發(fā)病率仍是居高不下，尤其存在一些抗生素濫用的現(xiàn)象，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌中存在很多的耐藥基因，從而致使其產(chǎn)生耐藥性，甚至是多重耐藥性，這與本試驗結(jié)果一致。本試驗分離所得到的金黃色葡萄球菌對青霉素G的耐藥程度最高，氨芐青霉素和阿莫西林的耐藥比例也分別高達86.67%和80.00%，對紅霉素耐藥，對阿奇霉素、頭孢噻吩、強力霉素、苯唑青霉素和環(huán)丙沙星耐藥均在50%以上。這與周欣云等[14]研究結(jié)果類似，說明金黃色葡萄球菌普遍存在耐青霉素的現(xiàn)象。但與高攀[15]研究的新疆地區(qū)金黃色葡萄球菌耐藥性有一定的差異，這可能與年份不同、采樣地點差異有一定的關(guān)系。但其與本試驗?zāi)退幓虻臋z出率和藥敏實驗結(jié)果類似，可為臨床用藥提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。建議在進行乳房炎的治療時，應(yīng)采取輪換用藥或選擇敏感性較高的藥物。

金黃色葡萄球菌具有傳染性較強、環(huán)境耐受能力強和抵御外部壓力的能力較強等特點[16]。在牧場中往往通過臥床、擠奶器械傳播，所以生產(chǎn)中應(yīng)該加強環(huán)境、公用器械的消毒。同時也應(yīng)通過加強奶牛的日常管理來增強奶牛自身的免疫力，注意飼養(yǎng)管理、精料比、擠奶管理等環(huán)節(jié)。同時也應(yīng)注意干奶期的乳房炎預(yù)防，建議干奶時每頭牛必須進行隱性乳房炎檢測，然后根據(jù)分離的菌株進行藥物治療并配合干奶針預(yù)防，降低金黃色葡萄球菌的感染風(fēng)險。該牧場通過淘汰金黃色葡萄球菌陽性牛、干奶時采取“乳暢治療+安倍寧干奶”的方式，取得了很好的效果。