韓小敏，李鳳琴

(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100021)

黑曲霉群(Aspergillusnigergroup)是曲霉屬(Aspergillus)環(huán)繞亞屬(Subgen.Circumdati)黑色組(Sect.Nigri)的一組具有不同程度的黑褐色、紅褐色、橄欖褐色和暗褐色等至黑色分生孢子頭的菌群，即Raper & Fennell(1965)分類(lèi)系統(tǒng)中的Aspergillusnigergroup[1]。黑曲霉群菌種在自然界分布極為普遍，也是常見(jiàn)引起食品和飼料等腐敗變質(zhì)的植物病害真菌，但某些菌種因具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值而被廣泛用于食品、醫(yī)藥等工業(yè)[2]。20世紀(jì)80年代，美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)將黑曲霉列入一般認(rèn)為是安全的菌種(generally recognized as safe，GRAS)進(jìn)行管理，并將其廣泛用于淀粉酶、脂肪酶、檸檬酸和葡萄糖酸等幾十種食品添加劑的生產(chǎn)[3-6]。據(jù)報(bào)道，已知的黑曲霉群菌種主要來(lái)源于土壤，但近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉群菌種可普遍從污染的葡萄、咖啡和可可及其制品等中分離[7-11]。

黑曲霉群菌種作為食品發(fā)酵工業(yè)常用菌和食品中常見(jiàn)的腐敗菌，已有許多分類(lèi)學(xué)家對(duì)其系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)學(xué)關(guān)系進(jìn)行了比較全面的研究，但黑曲霉群菌種的正確分類(lèi)和鑒定仍然是目前分類(lèi)學(xué)研究中較為困難的一類(lèi)[10, 12-15]。截止到2019年，黑曲霉群中已有27種黑曲霉的分類(lèi)學(xué)地位被確定。此外，已有研究表明，該類(lèi)群菌種生物多樣性復(fù)雜，難以通過(guò)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，需要結(jié)合生理學(xué)分析、細(xì)胞外分泌物類(lèi)型、分子生物學(xué)手段等進(jìn)行綜合鑒定[10, 12-21]。FRISVAD等[16]總結(jié)了不同鑒定方法在曲霉屬(包括黑曲霉群)菌種分類(lèi)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育中的應(yīng)用情況，具體見(jiàn)表1。分別闡述形態(tài)學(xué)、生理特征、細(xì)胞外分泌物特征、分子生物學(xué)特征和全基因組測(cè)序等技術(shù)在該類(lèi)菌種分類(lèi)鑒定中的具體應(yīng)用情況。

表1 不同鑒定技術(shù)在曲霉屬真菌分類(lèi)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育中的應(yīng)用情況Table 1 Application of different identification technologies used to characterize Aspergillus strains for taxonomic and phylogenetic purposes

1 不同分類(lèi)和鑒定方法的研究現(xiàn)狀

1.1 形態(tài)學(xué)特征

通常來(lái)說(shuō)，以菌落的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征數(shù)據(jù)是曲霉屬真菌菌種分類(lèi)和鑒定的主要依據(jù)。但考慮到菌落形態(tài)受培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度等)的影響易發(fā)生改變，因此，如何確保待鑒定菌種與參考模式菌種的培養(yǎng)條件一致性是進(jìn)行正確鑒定的前提。我國(guó)的曲霉屬真菌鑒定學(xué)專(zhuān)著《中國(guó)真菌志 第5卷曲霉屬及其相關(guān)有性型》推薦黑曲霉群菌種鑒定的培養(yǎng)基為查氏瓊脂(czapek agar，CA)、查氏酵母膏瓊脂(czapek yeast extract agar，CYA)和麥芽汁瓊脂(malt extract agar，MEA)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，變化范圍為22～27 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為5、7、10和14 d或更長(zhǎng)時(shí)間[1]。真菌學(xué)分類(lèi)和鑒定領(lǐng)域的國(guó)際權(quán)威專(zhuān)家推薦黑曲霉群菌種鑒定的培養(yǎng)基為CYA、MEA和氯硝胺18%甘油(dichloran glycerol，DG18)瓊脂，培養(yǎng)溫度為15、25和37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為7和14 d 或更長(zhǎng)時(shí)間[13-16]。此外，對(duì)于某些難以通過(guò)上述培養(yǎng)基進(jìn)行區(qū)分的菌種，還可選擇肌酸蔗糖瓊脂(creatine sucrose agar，CREA)、麥芽汁提取物啶酰菌胺瓊脂(malt extract agar-boscalid，MEA-B)、酵母提取物蔗糖瓊脂(yeast extract sucrose agar，YES)和燕麥瓊脂(oatmeal agar，OAT)等，培養(yǎng)溫度還可選擇18、21、30、33和40 ℃等[13-14, 22-24]。

黑曲霉群菌種形態(tài)學(xué)鑒定的主要依據(jù)為待鑒定菌種在推薦的培養(yǎng)條件下的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)特征[1-2, 13-24]。其中菌落的宏觀形態(tài)特征主要包括菌落的生長(zhǎng)速度(以菌落直徑來(lái)表示)、菌落的邊緣是否整齊或有不規(guī)則缺裂、菌落的顏色及其變化、菌落的質(zhì)地(絲絨狀、絮狀、繩狀)、菌落的基部菌絲體薄或厚，柔軟或堅(jiān)韌，平坦、褶皺或具溝紋、菌落的表面是否產(chǎn)生無(wú)色或具有不同顏色的液滴、菌落的反面無(wú)色或具不同顏色，是否可以產(chǎn)生菌核等[1-2, 13-24]。菌落的微觀形態(tài)特征主要包括菌落在顯微鏡下的分生孢子梗包括足細(xì)胞、分子孢子頭、分生孢梗莖、頂囊、?；⑵抗：头稚咦拥鹊男螤?、大小、顏色、表面紋飾等，同時(shí)還要觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)具體特征如產(chǎn)孢細(xì)胞的層數(shù)、長(zhǎng)度和顏色等[1-2, 13-23]。黑曲霉群菌種一般具有黑色、黑褐色、紫褐色等的分生孢子頭，分生孢子頭一般為球形、輻射形或分裂成幾個(gè)柱狀結(jié)構(gòu)；分生孢梗莖一般為光滑無(wú)色或近頂囊處帶暗褐色；頂囊球形或近球形，有時(shí)呈暗褐色；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為單層或雙層或同時(shí)存在單層或雙層產(chǎn)孢細(xì)胞；分生孢子球形、近球形、橢圓形或橫向扁平，光滑或不同程度的粗糙至具刺或縱向條紋；有的菌種可以產(chǎn)生菌核，菌核一般為球形或近球形，初為白色至奶油色，老后顏色變暗[1-2, 13-24]。

1.2 細(xì)胞外分泌物的特征

作為對(duì)外界生物和非生物環(huán)境的反應(yīng)而產(chǎn)生的細(xì)胞外泌物的特征，也成為近年來(lái)黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定過(guò)程中常采用的重要依據(jù)[15]。該類(lèi)物質(zhì)主要包括次級(jí)代謝產(chǎn)物、過(guò)量合成的有機(jī)酸、積累的碳水化合物(例如海藻糖和多元醇)、胞外酶(extracellular enzymes)、疏水蛋白(hydrophobins)、黏附素(adhesins)、擴(kuò)張素(expansins)和伴侶蛋白(chaperones)以及某些可能參與避免真菌繁殖結(jié)構(gòu)被昆蟲(chóng)、螨類(lèi)和其他動(dòng)物食用的聚酮類(lèi)和生物堿等[25]。通常分泌到細(xì)胞外或聚集在細(xì)胞壁上，并隨著環(huán)境條件的變化而改變。對(duì)于那些能夠分泌到細(xì)胞外的次級(jí)代謝產(chǎn)物如真菌毒素和抗菌素等，因具有高度的種屬特異性，常被用于黑曲霉群菌種的分類(lèi)和鑒定[26-27]。此外，黑曲霉群的不同種/株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的差異也得到了全基因組測(cè)序研究的支持，即從基因組水平研究可知，黑曲霉群的不同種/株之間次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能力的差異往往與基因組水平上攜帶的聚酮與非核糖體肽合成酶基因的數(shù)量和相似性密切相關(guān)[28-30]。

近年來(lái)，隨著GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS等技術(shù)飛速發(fā)展，使得通過(guò)檢測(cè)一種或幾種特定的生物標(biāo)志物而輔助于黑曲霉群菌種的分類(lèi)和鑒定越來(lái)越成為可能。目前，可用于黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定且相對(duì)易于檢測(cè)的細(xì)胞外泌物主要有neoxaline、黑麥酮酸類(lèi)(secalonic acid)(包括黑麥酮酸D和F等)、環(huán)棒麥角素(cycloclavine)、狐茅麥角堿(festuclavine)、曲地酸(asterric acid)、dihydrogeodin、erdin(土曲霉素)、tensiol A和B、萘并-γ-吡喃酮類(lèi)化合物(naphtho-γ-pyrones)、赭曲霉毒素(ochratoxins)(包括OTA、OTB、OTα和OTβ)、伏馬菌素(fumonisins)(包括FB2、FB4和FB6等)和funalenone等[13]。但考慮到黑曲霉群菌種產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有種屬差異并與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，尤其是培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基組成等，例如并非所有的黑曲霉群菌種都可以產(chǎn)生OTA，且黑曲霉產(chǎn)生OTA能力和產(chǎn)量與其培養(yǎng)條件密切相關(guān)，因此科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)是利用外泌物的特征進(jìn)行黑曲霉群菌種鑒定的難點(diǎn)[31]。此外，有許多結(jié)構(gòu)尚不清楚但能在黑曲霉群的一個(gè)或多個(gè)物種中檢測(cè)到的次級(jí)代謝產(chǎn)物，也可以很好的輔助用于黑曲霉群菌種的分類(lèi)和鑒定。所以，總體來(lái)看，細(xì)胞外分泌物的特征是未來(lái)黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定過(guò)程中一個(gè)很好的補(bǔ)充方法。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

已有的研究證明，黑曲霉群菌種作為難以分類(lèi)和鑒定的種群，為了保證鑒定結(jié)果的可靠性，除了依靠形態(tài)學(xué)和細(xì)胞外分泌物的特征外，仍需結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、PCR-RFLP、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)、序列分析、引物特異性PCR和實(shí)時(shí)定量熒光PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)等多種分子生物學(xué)技術(shù)的鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合判斷[32-54]，具體情況見(jiàn)表2。

表2 分子生物學(xué)技術(shù)在黑曲霉群菌種鑒定中的應(yīng)用情況Table 2 Application of molecular biology technology in identification of A. niger group

RFLP是最早用于黑曲霉群新種鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)。KUSTERS-VAN等[32-33]采用RFLP技術(shù)探討了果膠裂合酶基因(pelA、pelB、pelD)和丙酮酸激酶基因(pki)作為DNA雜交實(shí)驗(yàn)的探針用于黑曲霉群菌種快速鑒定的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pelD基因在黑曲霉群的所有分離株中具有保守性，不能用于黑曲霉群菌種的鑒定，pelA和pelB可用于黑曲霉和塔賓曲霉的鑒定。KUSTERS-VAN等[32]和VARGA等[34]發(fā)現(xiàn)SmaI內(nèi)切酶消化rDNA后可將黑曲霉、塔賓曲霉、巴西曲霉、炭黑曲霉、日本曲霉、A.ellipticus和A.aculeatus區(qū)分開(kāi)。VARGA等[34]和HAMARI等[35]發(fā)現(xiàn)用HaeIII/BgIII消化線粒體DNA可將黑曲霉和巴西曲霉與塔賓曲霉區(qū)分開(kāi)，日本曲霉與A.aculeatus區(qū)分開(kāi)。隨后陸續(xù)報(bào)道了PCR-RFLP用于黑曲霉群菌種鑒定的可行性，尤其是發(fā)現(xiàn)采用RsaI消化ITS基因、Hinf I消化IGS基因和RsaI消化β-微管蛋白(beta-tubulin，benA)基因時(shí)可將黑曲霉群菌種的OTA潛在產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株區(qū)分開(kāi)[36-39]。PERRONE等[40-42]發(fā)現(xiàn)AFLP技術(shù)可以鑒定已知的大多數(shù)黑曲霉群菌種。SUSCA等[43]采用PCR-SSCP技術(shù)鑒定了包括黑曲霉、巴西曲霉和塔賓曲霉在內(nèi)的11種黑曲霉。

基于管家基因如核糖體RNA基因及其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)和基因內(nèi)間隔區(qū)(intergenic spacer，IGS)、線粒體細(xì)胞色素b(mitochondrial cytochrome b，Cytb)、benA、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)和細(xì)胞色素氧化酶I(cytochrome oxidase I，Cox I)建立的DNA序列分析和引物特異性PCR分析是目前黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定時(shí)最常用的分子生物學(xué)方法[44-53]。下面對(duì)DNA序列分析方法的可行性進(jìn)行詳細(xì)討論。FRISVAD等[16]經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，受序列變異度的影響，ITS序列僅能將黑曲霉群菌種大致區(qū)分為4個(gè)組：(1)黑曲霉和A.lacticoffeatus；(2)巴西曲霉(A.brasiliensis)；(3)A.costaricaensis；(4)塔賓曲霉、臭曲霉、A.vadensis和A.pipers，且大多數(shù)具有單層產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的菌種都具有相同的ITS序列，如日本曲霉、A.aculeatus和A.uvarum。YOKOYAMA等[45]通過(guò)對(duì)黑曲霉群12個(gè)種的32株黑曲霉的線粒體基因Cytb的402個(gè)核苷酸序列和133個(gè)氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)Cytb的氨基酸序列差異可以推斷日本曲霉、A.aculeatus、黑曲霉、塔賓曲霉、炭黑曲霉和A.ellipticus的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但是不能通過(guò)Cytb基因的核苷酸序列差異推斷塔賓曲霉和黑曲霉的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。GEISER等[46]基于Cox I和線粒體DNA基因的核苷酸序列對(duì)8個(gè)種42株黑曲霉的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析可知，基于CoX I和線粒體DNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均具有種內(nèi)和種間變異性，不能用于黑曲霉群菌種的分類(lèi)和鑒定；此外，SAMSON等[13]基于IGS序列差異分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域的核苷酸序列變異性太高，不能用于黑曲霉群菌種的鑒定。同時(shí)，基于丙酮酸激酶、果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、翻譯起始因子2、轉(zhuǎn)錄延伸因子1-α和RNA聚合酶2等基因的分子鑒定技術(shù)僅能區(qū)分2～5種黑曲霉，也不建議用于黑曲霉群菌種的分類(lèi)和鑒定[44-53]。大量研究證實(shí)，已知的黑曲霉群菌種中除了黑曲霉與A.lacticoffeatus可以通過(guò)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已經(jīng)公布菌株的benA基因的核苷酸序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行初步鑒定外，其余絕大多數(shù)菌株均需要通過(guò)下載已經(jīng)公布菌株的CaM核苷酸序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行初步鑒定。但考慮到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)公共、開(kāi)放的數(shù)據(jù)庫(kù)可以接受上傳的所有序列，并將其用于菌種的分類(lèi)鑒定或系統(tǒng)發(fā)育分析，但GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并不負(fù)責(zé)上傳序列真實(shí)性或正確性的判斷，因此在利用從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建時(shí)會(huì)出現(xiàn)因序列錯(cuò)誤而引起鑒定錯(cuò)誤。為了去除錯(cuò)誤的序列并保證鑒定結(jié)果的可靠性，建議采用基因參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)(reference sequence database，RefSeq)中公布的序列信息進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(http://www.ncbi.nlm.gov/refseq/)的構(gòu)建[7]。

ATOUI 等[47]、SUSCA等[48]和PERRONE等[49]基于管家基因的引物特異性PCR對(duì)黑曲霉群不同菌種的研究發(fā)現(xiàn)，不同管家基因的鑒定能力不同,如針對(duì)聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)AT結(jié)構(gòu)域的特異性引物可以特異性的鑒定炭黑曲霉，而針對(duì)CaM的特異性引物可以特異性的鑒定黑曲霉和炭黑曲霉。此外，即使是對(duì)同一個(gè)管家基因，引物序列的不同也會(huì)產(chǎn)生不同的鑒定能力，如ITS序列。GONZALEZ-SALGADO等[50]和HAUGLAND等[51]采用ITS/NIG、ITS1/JAP、ITS1/HET和ITS1/ELL可分別特異性的擴(kuò)增黑曲霉、塔賓曲霉、日本曲霉、A.heteromorphus和A.ellipticus。針對(duì)PKS序列的不同位置設(shè)計(jì)不同的引物時(shí)，僅能鑒定可產(chǎn)OTA的炭黑曲霉?jié)撛诋a(chǎn)毒株或同時(shí)鑒定產(chǎn)OTA的炭黑曲霉和黑曲霉的潛在產(chǎn)毒株[52-53]。

綜上可知，分子生物學(xué)技術(shù)是黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定中必不可少的重要組成部分，但每種分子生物學(xué)鑒定方法都難以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)、全面和準(zhǔn)確的鑒定。目前來(lái)說(shuō)，基于管家基因的序列測(cè)定是最為常用的方法，CaM和benA結(jié)合能鑒定黑曲霉群的絕大多數(shù)菌種，但I(xiàn)TS序列和其他管家基因的鑒定水平有限難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定。所以，在實(shí)際的鑒定中有必要結(jié)合多種管家基因的鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

1.4 生理特征

用于黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定研究的生理特征分析，主要是指菌種對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等的利用能力差異。已有研究證實(shí)，黑曲霉、塔賓曲霉、臭曲霉、日本曲霉和A.vadensis在7種不同碳源上的生長(zhǎng)曲線各不相同，但黑曲霉和塔賓曲霉的碳源利用情況最相似；相比于其他菌種，黑曲霉和塔賓曲霉對(duì)甘油、D-半乳糖醛酸鹽和乙酸鹽的利用能力均較差，臭曲霉和日本曲霉對(duì)木糖醇的利用能力較差，塔賓曲霉對(duì)檸檬酸的利用能力較差[54]。SAMSON等[13]對(duì)已經(jīng)被鑒定的19種黑曲霉的研究發(fā)現(xiàn)，CREA作為一種半選擇性培養(yǎng)基，可以將黑曲霉群菌種區(qū)分為不同的組。對(duì)于可以產(chǎn)生雙層小梗的菌種如黑曲霉及其近緣種包括巴西曲霉、臭曲霉、塔賓曲霉、A.vadensis、A.sclerotioniger、A.costaricaensis、A.piperis和A.lacticoffeatus來(lái)說(shuō)，其在CREA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度適中，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，可在菌落周?chē)纬牲S色的大暈環(huán)；而對(duì)A.ellipticus、A.heteromorphus和A.homomorphus來(lái)說(shuō)，在CREA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較快，但產(chǎn)酸能力相對(duì)前者較弱。此外，對(duì)于可以產(chǎn)生單層小梗的菌種來(lái)說(shuō)，CREA可以很好的將日本曲霉、A.uvarum、A.aculeatus和A.aculeatinus區(qū)分開(kāi)，具體生長(zhǎng)情況如下：A.uvarum在CREA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良、產(chǎn)酸能力有限，而A.aculeatus和日本曲霉在CREA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好、產(chǎn)酸能力中等；A.aculeatinus在CREA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快且產(chǎn)酸能力也很強(qiáng)。POLLASTRO等[55]開(kāi)發(fā)的半選擇性培養(yǎng)基MEA-B(含10 mg/L的啶酰菌胺)可將多種黑曲霉區(qū)分開(kāi)，如在MEA-B培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，只有炭黑曲霉、A.sclerotioniger、A.homomorphus和A.sclerotiicarbonarius生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而A.ellipticus、黑曲霉、巴西曲霉、A.vadensis、A.piperis和A.costaricaensis等均未在MEA-B培養(yǎng)基上觀察到菌落生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，許多菌株可恢復(fù)生長(zhǎng)，但只有炭黑曲霉、A.sclerotioniger和A.sclerotiicarbonarius能夠產(chǎn)生孢子。更重要的，根據(jù)A.ibericus與炭黑曲霉在MEA-B培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)，可以將與炭黑曲霉親緣關(guān)系很近但不能產(chǎn)生OTA的A.ibericus與炭黑曲霉區(qū)分開(kāi)。

已有研究證實(shí)，生理特征分析被成功用于2種具有重要工業(yè)利用價(jià)值且親緣關(guān)系較近的黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的鑒定[14]。將2種菌的28株菌接種在僅含0.2%碳源的基本培養(yǎng)基上，分析了其對(duì)30種碳源包括葡萄糖、D-半乳糖、半乳糖、D-來(lái)蘇糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、乳糖、eritrit、galactit、L-纈氨酸、L-β-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-組氨酸、L-瓜氨酸、順式烏頭酸、香蘭素(vanillin)、香蘭素酸(vanillin acid)、L-抗壞血酸、D-氨基葡萄糖、雙甘氨肽、水楊苷、果膠、松三糖和α-酮戊二酸的利用情況[14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種菌除了在分別以L-山梨糖和2-脫氧-D-葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不同外，黑曲霉和泡盛曲霉具有非常相似的碳源利用情況，具體情況如下：以L-山梨糖作為唯一碳源時(shí)黑曲霉的生長(zhǎng)速度明顯低于泡盛曲霉，以2-脫氧-D-葡萄糖作為唯一碳源時(shí)，所測(cè)定的黑曲霉菌株生長(zhǎng)狀況良好，但有86.7%的泡盛曲霉未被觀察到生長(zhǎng)[14]。

綜上可知，在特定的培養(yǎng)條件下，同種的黑曲霉具有相似的生理特征，但是不同種黑曲霉對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況差異較大?；谏硖卣鞯牟町惖姆诸?lèi)和鑒定也是未來(lái)黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定領(lǐng)域的一個(gè)新的發(fā)展方向。

1.5 全基因組測(cè)序分析

截止到2019年8月，全世界范圍內(nèi)已經(jīng)完成全基因組測(cè)序并公布的黑曲霉群菌種有5種17株，主要包括12株黑曲霉、1株泡盛曲霉、2株塔賓曲霉、1株日本曲霉、1株炭黑曲霉。其中最早完成測(cè)序的為檸檬酸生產(chǎn)常用菌黑曲霉ATCC 1015，公布日期為2011年10月12日；接著為黑曲霉SH-2，公布日期為2014年4月17日，其余15株均在近3年完成的測(cè)序，且17株菌中有6株菌為我國(guó)科學(xué)家負(fù)責(zé)完成測(cè)序工作。黑曲霉的基因組大小范圍為31.85～36.45 Mb，GC含量范圍為48.8%～51.6%。

但目前對(duì)于全基因組序列測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)等檢測(cè)方法的對(duì)比分析，尚缺乏足夠的數(shù)據(jù)支持，且對(duì)于許多最新報(bào)道、已經(jīng)被鑒定的多種黑曲霉群菌株來(lái)說(shuō)，也缺乏全基因組序列分析結(jié)果，后續(xù)研究中均有待于進(jìn)一步加強(qiáng)全基因組序列的分析。

2 總結(jié)與展望

黑曲霉群菌種作為具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和常見(jiàn)的植物致病性真菌，其分類(lèi)和鑒定工作一直是鑒定學(xué)中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題，迫切需要結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理特征、DNA序列特征以及細(xì)胞外分泌物的特征等進(jìn)行綜合分析。此外，為了保證鑒定結(jié)果的可靠性，需要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)生理特征、細(xì)胞外泌物特征、分子生物學(xué)特征尤其是全基因組序列特征在菌種分類(lèi)和鑒定工作中的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，期望通過(guò)國(guó)際合作制定出一套可以適合黑曲霉群菌種分類(lèi)和鑒定以及可以描述物種特征的最低判定標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范。