甘晟勛，蕭 琦，劉 歡，劉軍鋒，鄧 利，王 芳

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院北京市生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；2.廈門北化生物產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，福建廈門 361000）

衣康酸，學(xué)名為亞甲基丁二酸，具有共軛雙鍵和2個(gè)羧基，是合成各種化學(xué)品的重要原料。衣康酸在塑料和樹(shù)脂領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，此外，在涂料、潤(rùn)滑劑和生物基彈性體等方面也有所應(yīng)用［1-4］。

衣康酸目前主要通過(guò)土曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)。在土曲霉發(fā)酵中，由順烏頭酸脫羧酶（Cis-aconitate decarboxylase，Cad）催化順烏頭酸（Cis-aconitate）生成衣康酸（Itaconate）。土曲霉發(fā)酵具有原料價(jià)格低、發(fā)酵易控制、無(wú)毒副產(chǎn)物產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)，但是存在菌體生長(zhǎng)慢和發(fā)酵過(guò)程對(duì)氧敏感的缺點(diǎn)［5］。因此，選擇生長(zhǎng)快、培養(yǎng)條件較寬松、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單的菌株生產(chǎn)衣康酸成為亟待解決的問(wèn)題，而大腸桿菌則是優(yōu)先選擇。大腸桿菌中生產(chǎn)衣康酸代謝見(jiàn)圖1。

Okamoto等在將cad基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過(guò)λred/ET重組法敲除IDH基因（編碼異檸檬酸脫氫酶，催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸），過(guò)表達(dá)acn基因（編碼烏頭酸酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)化為順烏頭酸），在2.00 L發(fā)酵罐中衣康酸產(chǎn)量達(dá)到4.34 g/L［6］。Kiira等通過(guò)改變培養(yǎng)基和降低培養(yǎng)溫度來(lái)減緩cad基因的表達(dá)速率，同時(shí)強(qiáng)化glt（編碼檸檬酸合酶，催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸）和acn基因的表達(dá)，敲除IDH和pta基因（編碼磷酸轉(zhuǎn)乙?；?，催化乙酰磷酸和乙酰輔酶A的相互轉(zhuǎn)化），所構(gòu)建的工程菌在搖瓶發(fā)酵中的產(chǎn)量達(dá)到0.69 g/L［7］。Harder等［8］通過(guò)在已構(gòu)建的衣康酸生產(chǎn)菌株中引入溫敏性啟動(dòng)子lambda控制IDH基因的表達(dá)，使菌株可在37℃下生長(zhǎng)而在28℃下產(chǎn)酸，從而顯著提高了菌株生產(chǎn)衣康酸的能力。因此，利用大腸桿菌生產(chǎn)衣康酸是未來(lái)生產(chǎn)衣康酸的趨勢(shì)，具有廣闊的市場(chǎng)前景［9］。

在已報(bào)道的大腸桿菌生產(chǎn)衣康酸研究中，主要存在2個(gè)制約衣康酸產(chǎn)量提升的問(wèn)題：一是發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸的含量較高［10］；二是細(xì)胞代謝過(guò)程與發(fā)酵過(guò)程的協(xié)同控制［7］。因此，本研究在構(gòu)建產(chǎn)衣康酸工程菌的基礎(chǔ)上，首先通過(guò)glt過(guò)表達(dá)強(qiáng)化衣康酸的合成途徑，然后構(gòu)建乙酸回補(bǔ)途徑以降低乙酸的合成，最后考察了溫度和外源添加前體物對(duì)衣康酸產(chǎn)量的影響，最終通過(guò)菌株內(nèi)部代謝過(guò)程和外部條件控制的協(xié)同作用提高工程菌生產(chǎn)衣康酸的能力。

1 材料與方法

1.1 宿主、質(zhì)粒與引物

所用大腸桿菌宿主有 MG1655、JM109、Rosetta、Origami B和 BL21，質(zhì)粒為 pET-22b，引物列于表1。cad（NCBI序列 ID：BAG49047.1）基因序列來(lái)源于土曲霉［11］，glt（ID：CAA46902.1）基因序列來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌，ACS（ID：NC_000913.3）和 acn（ID：AAC74358.1）基因序列來(lái)源于大腸桿菌K-12。以上基因由Genewiz（中國(guó)）公司合成或從本實(shí)驗(yàn)室已有質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得。

表1 本研究中所用引物

1.2 重組載體構(gòu)建

使用Prime STAR（Takara）緩沖液，以帶有目的基因片段的質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因片段。對(duì)回收純化后的基因片段與質(zhì)粒pET-22b分別進(jìn)行雙酶切，然后在T4連接酶（Takara）的作用下連接基因片段與質(zhì)粒，分別構(gòu)建基因表達(dá)載體。具體如下：將cad基因連接至pET-22b的NdeⅠ與NcoⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-cad；將glt基因連接到pET-22b-cad中NcoⅠ與BamHⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-cad-glt；將ACS基因和acn A基因分別連接至pET-22b-cad-glt的EcoRⅠ與HindⅢ或SacⅠ與EagⅠ之間，分別構(gòu)建pET-22b-cad-glt-ACS和 pET-22b-cad-glt-acn。最后將構(gòu)建好的重組載體分別通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

將陽(yáng)性重組菌株用LB培養(yǎng)基（10.0 g/L胰蛋白胨、5.0 g/L酵母提取物和5.0 g/L NaCl）在37℃和200 r/min條件下培養(yǎng)12 h，然后按照2.0%的接種量接種至SOC培養(yǎng)基（20.0 g/L胰蛋白胨、5.0 g/L酵母提取物、0.2 g/L KCl、1.0 g/L MgCl2、3.6 g/L葡萄糖和0.5 g/L NaCl），在37℃和200 r/min下生長(zhǎng)至OD600值約為1.0時(shí)，加入0.3 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，最后在18℃和220 r/min條件下發(fā)酵24 h后收集發(fā)酵液。在外源添加衣康酸前體物的研究中，在加入IPTG誘導(dǎo)后0、0.5、1.0和2.0 h分別加入10.0、12.0、14.0 g/L的檸檬酸鹽，或2.0 g/L的順烏頭酸。所有搖瓶培養(yǎng)均設(shè)置3個(gè)平行。

1.4 分析方法

通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵液在600 nm處的光吸收來(lái)衡量菌體的生物量。利用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中的衣康酸［12］。色譜柱使用Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱（25.0 cm，0.4 cm i.d.，Bio-Rad），流動(dòng)相為 4.0 mmol/L H2SO4，分析條件為：UV210 nm，流速 0.6 mL/min，柱溫60℃，進(jìn)樣體積為10.0μL。將衣康酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成5種不同濃度梯度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L），根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中衣康酸的含量。

檸檬酸鹽利用率計(jì)算方法：利用檸檬酸鹽加入量及發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中檸檬酸鹽的含量差值，計(jì)算出檸檬酸鹽的消耗量，再除以檸檬酸鹽加入量，得到檸檬酸鹽的利用率。

2 結(jié)果

2.1 外源基因cad在不同宿主中的表達(dá)

大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的原核模式生物，已發(fā)展出多種不同基因型和用途的表達(dá)宿主。為了尋找外源基因cad的最佳表達(dá)宿主，分別將質(zhì)粒 pET-22b-cad轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21、Rosetta、Origami B、JM109和 MG1655。重組菌株于37℃和200 r/min培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移到18℃用IPTG誘導(dǎo)24 h。結(jié)果如圖2所示，BL21的衣康酸含量達(dá)到54 mg/L，其次是Rosetta和Origami B分別產(chǎn)生了29和15 mg/L，而JM109和 MG1655幾乎不能產(chǎn)生衣康酸。結(jié)果表明：BL21是適合cad基因表達(dá)產(chǎn)生衣康酸的宿主，故用于后續(xù)的研究。

2.2 衣康酸合成途徑的強(qiáng)化

順烏頭酸既是衣康酸合成的底物，又是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物，其在細(xì)胞中的含量對(duì)衣康酸的產(chǎn)量影響甚大。為了提高衣康酸的產(chǎn)量，本研究對(duì)檸檬酸和順烏頭酸（衣康酸合成的兩個(gè)前體）的生物合成進(jìn)行了強(qiáng)化，通過(guò)過(guò)表達(dá)編碼檸檬酸合酶的glt基因和編碼烏頭酸酶的acn基因提高檸檬酸和順烏頭酸的生成量。與僅表達(dá)cad基因的菌株相比，cad與glt基因共表達(dá)菌株的衣康酸含量達(dá)到104 mg/L，提高了22%（圖3（a）），同時(shí)生物量也有一定的提高（圖3（b））。這表明，增強(qiáng)檸檬酸合酶的表達(dá)可以促進(jìn)檸檬酸的生產(chǎn)，為烏頭酸酶提供充足的底物，進(jìn)而促進(jìn)了衣康酸的合成。但是acn、cad、glt共表達(dá)菌株的衣康酸產(chǎn)量，比cad、glt共表達(dá)菌株的衣康酸含量低21%（圖3（a）），而生物量顯著提高（圖 3（b））。此外，在僅表達(dá)glt基因和僅表達(dá)acn基因的菌株中沒(méi)有檢測(cè)到衣康酸。綜上，glt和 cad的表達(dá)以“pushpull”的方式增強(qiáng)衣康酸的合成，而acn基因的表達(dá)則有利于菌體生長(zhǎng)。

2.3 乙酸回補(bǔ)途徑的構(gòu)建

通過(guò)工程菌產(chǎn)物的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的乙酸含量較高，表明細(xì)胞碳源損失嚴(yán)重，影響了衣康酸的合成（圖4（a））。為挽回?fù)p失的碳源，同時(shí)改善細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，在工程菌中引入了乙酸回補(bǔ)途徑。通過(guò)表達(dá)編碼乙酰輔酶A合成酶的ACS基因，工程菌中乙酸含量明顯下降，24 h時(shí)乙酸含量?jī)H為0.857 g/L（圖4（b）），并且衣康酸的含量提高 17.0%，達(dá)到128 mg/L（圖 4（c）），同時(shí)生物量提高7.80%（圖4（d））。由于ACS的表達(dá)產(chǎn)物僅促進(jìn)代謝中間物乙酰輔酶A的合成，故僅表達(dá)ACS基因的菌株并不具有生產(chǎn)衣康酸的能力。結(jié)果表明，ACS的表達(dá)將副產(chǎn)物乙酸重新利用，實(shí)現(xiàn)了碳流的回補(bǔ)，提高了菌株生產(chǎn)衣康酸的能力。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度

為了尋找工程菌生產(chǎn)衣康酸的最佳發(fā)酵溫度，將共表達(dá)cad、glt和ACS的菌株分別置于18、22、26和30℃下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖5所示，發(fā)酵液中衣康酸含量呈現(xiàn)出隨溫度的升高而逐漸下降的趨勢(shì)，在18℃時(shí)衣康酸含量最高，為131 mg/L。菌體生物量的變化趨勢(shì)則與衣康酸含量的變化趨勢(shì)相反?？紤]到已經(jīng)在發(fā)酵初期通過(guò)37℃發(fā)酵來(lái)提高生物量，并且低溫更有利于菌株產(chǎn)酸，所以選擇18℃作為工程菌生產(chǎn)衣康酸的發(fā)酵溫度。

2.4.2 外源添加檸檬酸鹽

在工程菌和發(fā)酵液中均未檢測(cè)到檸檬酸，表明工程菌對(duì)檸檬酸的利用能力較強(qiáng)。為了有效利用外源檸檬酸鹽，從檸檬酸鹽的加入時(shí)間點(diǎn)和加入量2個(gè)方面考察了外源添加檸檬酸鹽對(duì)衣康酸發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，在0 h加入12.0 g/L檸檬酸鈉的工程菌表現(xiàn)出最高的衣康酸含量，達(dá)到317 mg/L，比未添加檸檬酸鈉提高了142%（圖6（a））。但是隨著檸檬酸鈉加入時(shí)間的延后，衣康酸含量呈下降的趨勢(shì)。同樣，生物量的變化也呈現(xiàn)出隨著檸檬酸鈉加入量的增加而降低的趨勢(shì)（圖6（b））。有趣的是，檸檬酸鹽的消耗在各加入時(shí)間點(diǎn)和不同加入量組內(nèi)及組別之間沒(méi)有明顯的變化，最高利用率為66.0%（圖6（c））。值得注意的是，添加檸檬酸鈉還減少了乙酸的產(chǎn)生，其中0 h加入12.0 g/L檸檬酸鈉實(shí)驗(yàn)組僅產(chǎn)生0.579 g/L的乙酸（圖6（d））。根據(jù)以上結(jié)果，在0 h加入12.0 g/L檸檬酸鈉的發(fā)酵效果最佳。

2.4.3 外源添加順烏頭酸

順烏頭酸是衣康酸合成的直接前體。但在工程菌及發(fā)酵液中均沒(méi)有檢測(cè)到順烏頭酸，推測(cè)順烏頭酸在發(fā)酵中被完全消耗。據(jù)此，考察了外源添加順烏頭酸對(duì)衣康酸生產(chǎn)的影響。結(jié)果如圖7所示。

在加入順烏頭酸后，衣康酸含量得到不同程度的提高，尤其在0 h加入順烏頭酸，衣康酸產(chǎn)量最高達(dá)到207 mg/L；在利用IPTG誘導(dǎo)后2.00 h加入順烏頭酸，生物量（OD600）最高達(dá)到6.49，同時(shí)順烏頭酸利用率最高為26.8%。由于工程菌對(duì)外源添加的順烏頭酸利用能力較弱，故外源添加順烏頭酸對(duì)于衣康酸的生產(chǎn)作用相比外源添加檸檬酸鹽的作用較小。

3 討論

在利用大腸桿菌表達(dá)外源基因時(shí)，質(zhì)粒、表達(dá)宿主和外源基因的適配對(duì)基因表達(dá)有一定的影響［13-14］。Okamoto等［6］利用大腸桿菌 BW25113表達(dá) cad，產(chǎn)生 26.7 mg/L的衣康酸；Jeon等［15］以大腸桿菌XL1-Blue為宿主，僅表達(dá)cad時(shí)的衣康酸產(chǎn)量達(dá)到 30.0 mg/L；Yang等［16］則在 Rosetta（DE3）中表達(dá)cad基因，產(chǎn)生25.0 mg/L衣康酸。本研究針對(duì)適配性問(wèn)題選擇了5種不同的宿主菌來(lái)表達(dá)cad基因，發(fā)現(xiàn)BL21菌株和cad基因有較好的適配，而其余4種宿主表達(dá)cad基因的能力較差。推測(cè)原因是，雖然cad基因序列來(lái)源于真核細(xì)胞，但是該序列中沒(méi)有特定的稀有密碼子，而Rosetta和Origami B菌種在表達(dá)外源蛋白時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些稀有tRNA，產(chǎn)生過(guò)程消耗大量能量，從而使外源蛋白的表達(dá)效率降低［17］。

文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)過(guò)表達(dá)編碼檸檬酸合酶的glt基因和編碼烏頭酸酶的acn基因可以提高檸檬酸和順烏頭酸的生成量［12，18］。本研究也考慮了這2個(gè)基因?qū)Πl(fā)酵生產(chǎn)衣康酸的影響，發(fā)現(xiàn)acn的表達(dá)導(dǎo)致衣康酸的產(chǎn)量下降。可能的原因是，acn編碼的烏頭酸酶不僅催化檸檬酸合成順烏頭酸，還催化順烏頭酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，從而促進(jìn)了TCA循環(huán)，導(dǎo)致更多的碳源用于細(xì)胞生長(zhǎng)，使菌體生物量提升，而衣康酸產(chǎn)量降低。衣康酸的合成主要依賴于TCA循環(huán)，作為TCA循環(huán)限速酶的檸檬酸合酶對(duì)TCA循環(huán)的進(jìn)行和衣康酸的合成起到關(guān)鍵性作用，因此加強(qiáng)glt基因表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了TCA循環(huán)和菌株生產(chǎn)衣康酸的能力。而外源添加檸檬酸鈉后可以促進(jìn)順烏頭酸的合成。所以通過(guò)兩者之間形成的協(xié)同效應(yīng)，可達(dá)到提高衣康酸產(chǎn)量的目的。

利用大腸桿菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生如乙醇、甲酸和乙酸等多種副產(chǎn)物［19］。主要副產(chǎn)物乙酸的積累不僅影響菌體生長(zhǎng)，而且抑制目的基因的表達(dá)［20］。一般來(lái)說(shuō)5～10 g/L的乙酸含量會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)；當(dāng)含量大于10 g/L時(shí)，細(xì)胞將會(huì)停止生長(zhǎng)；而當(dāng)含量大于12 g/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)完全被抑制［21］，所以在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)乙酸含量的控制至關(guān)重要。本研究中利用ACS基因成功強(qiáng)化了菌株的乙酸回補(bǔ)途徑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)損失碳源的回補(bǔ)利用，提高了菌株發(fā)酵的生物量和衣康酸的產(chǎn)量。然而，另一種表達(dá)編碼磷酸轉(zhuǎn)乙?；傅膒ta基因及編碼乙酸激酶（催化乙酰磷酸和乙酸的相互轉(zhuǎn)化）的ack基因的大腸桿菌生物量和對(duì)乙酸的利用并沒(méi)有明顯的改善［22］。

Jeon等［15］報(bào)道了大腸桿菌在M9培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸時(shí)，能一定程度上提高衣康酸的含量。推測(cè)M9培養(yǎng)基中含有的檸檬酸鹽能促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)和衣康酸含量的提高［23］。為了防止檸檬酸鹽的加入對(duì)糖酵解途徑產(chǎn)生抑制作用［24-26］，本研究對(duì)添加檸檬酸鹽的時(shí)間點(diǎn)和加入量分別進(jìn)行考察，結(jié)果表明，適宜的檸檬酸鈉添加可以顯著提高工程菌衣康酸的含量。

雖然與土曲霉發(fā)酵相比，本研究所構(gòu)建工程菌的衣康酸產(chǎn)量還有一定差距，但是通過(guò)宿主篩選、代謝途徑調(diào)控和前體物外源補(bǔ)充，成功使衣康酸的產(chǎn)量由初始僅表達(dá)cad基因時(shí)的54 mg/L提升到了317 mg/L，提高了5倍。因此，本研究采用的胞內(nèi)碳源回補(bǔ)與胞外碳源補(bǔ)充聯(lián)用法有效提高了工程菌生產(chǎn)的衣康酸產(chǎn)量。

4 結(jié)論

1）構(gòu)建了生產(chǎn)衣康酸的工程菌，以“pushpull”的策略共表達(dá)glt和cad是增強(qiáng)工程菌衣康酸合成途徑的有效手段。構(gòu)建的乙酸回補(bǔ)途徑減少了副產(chǎn)物乙酸導(dǎo)致的碳源分流，結(jié)合適宜的前體物添加方式，可顯著提高工程菌生產(chǎn)衣康酸的能力。

2）確定了工程菌生產(chǎn)衣康酸的發(fā)酵工藝參數(shù)：在LB培養(yǎng)基中37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，然后以2.0%接種量接種到SOC培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600值為1.0時(shí)，加入0.3 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，同時(shí)加入12.0 g/L檸檬酸鈉，最后在18℃、220 r/min條件下發(fā)酵24 h。

3）為綜合利用微生物代謝工程和發(fā)酵策略生產(chǎn)二元羧酸及其他化學(xué)品提供了可行的方法。