趙敏蝶 吳 盡 趙宇卓 劉學(xué)東 鄭 冬 梁冬瑩

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，在其生長發(fā)育過程中，因細(xì)胞類型、環(huán)境以及內(nèi)部調(diào)節(jié)的不同，轉(zhuǎn)錄組信息的變化呈多樣性。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組的研究主要是在器官或者組織水平上測序，即轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)，忽略了單個細(xì)胞在遺傳方面的特殊性。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(single cell RNA-seq，scRNA-seq)是在單個細(xì)胞水平對mRNA進行高通量測序的一項新技術(shù)，將分離的單個細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA擴增后進行高通量測序，從單細(xì)胞水平上獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達譜[1-3]。scRNA-seq能夠以高通量和單分子分辨率研究單個細(xì)胞表達譜，揭示復(fù)雜細(xì)胞群體的異質(zhì)性，避免單個細(xì)胞的基因表達信號被群體的平均值所掩蓋。scRNA-seq更加精準(zhǔn)，最終得到的是每個細(xì)胞型的表達量，從而可以幫助理解組織異質(zhì)性，鑒定罕見的細(xì)胞類型，檢測細(xì)胞組分的變化，在人類的癌癥異質(zhì)性、胚胎發(fā)育、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞分型、差異表達通路等方面都發(fā)揮重要作用[4-7]。本文對scRNA-seq技術(shù)原理及其在動物研究中的應(yīng)用與進展進行綜述。不僅可以了解動物不同發(fā)育時期組織細(xì)胞之間的特性，為動物研究提供科學(xué)參考，針對野生動物的研究也能提供一個新的方向。

1 scRNA-seq技術(shù)的發(fā)展歷史及其在生物學(xué)研究中的作用

1990年Brady等首次描述了一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的單細(xì)胞cDNA擴增方法[8]。幾乎同時，Eberwine等提出了另外一種基于體外轉(zhuǎn)錄的線性擴增方法[9]。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，2002年起多篇文章報道了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因芯片分析[10-13]。2009年，Tang等首次報道單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的深度測序分析[3]，并于2010年再次發(fā)表相關(guān)研究工作[14]。至今，scRNA-seq已成為生物學(xué)研究中應(yīng)用熱門之一。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究能夠在單個細(xì)胞水平上揭示細(xì)胞內(nèi)整體水平的基因表達狀態(tài)和基因結(jié)構(gòu)信息，準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，深入理解其基因型和表型之間的相互關(guān)系[15]。scRNA-seq作為一種針對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進行測序的技術(shù)，隨著其發(fā)展，人們將會對細(xì)胞的認(rèn)識更加全面豐富。在生物學(xué)研究中，scRNA-seq可以研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，基因表達的異質(zhì)性與隨機性，基因表達水平，監(jiān)測新的基因(包括新的蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼RNA基因，尤其是低表達基因)，定量研究基因的突變情況等。scRNA-seq技術(shù)主要用于大規(guī)模細(xì)胞圖譜構(gòu)建[16-20]、細(xì)胞亞群細(xì)化和稀有細(xì)胞類型鑒定[19，21]、腫瘤方向研究[22]、干細(xì)胞發(fā)育及分化研究[23]、免疫方向研究[24-27]、神經(jīng)科學(xué)研究[28]、發(fā)育生物學(xué)[3-4，16-19，29-38]等。這些研究為人類認(rèn)識和了解生物機體和各種功能提供了重要的方法和途徑。同樣，scRNA-seq在動物的研究中也得到推廣和應(yīng)用。

2 scRNA-seq在動物研究中的方法

近年來，隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，許多研究人員利用該技術(shù)對動物的某些單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本進行研究，初步實現(xiàn)在單個細(xì)胞水平上對動物機體的了解，確定了scRNA-seq技術(shù)在動物研究中的適用性。具體的研究方法通常分為以下幾部分。

2.1 單細(xì)胞分離

首先，研究者要對單個細(xì)胞進行分離以獲得單細(xì)胞樣品。分離單個細(xì)胞，常用技術(shù)：連續(xù)稀釋法、顯微操作法、微流控芯片(microfluidics)、熒光激活細(xì)胞流式分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)、磁性激活細(xì)胞分選(magnetic-activated cell sorting，MACS)、轉(zhuǎn)錄組體內(nèi)分析法(transcriptome in vivo analysis，TIVA)以及激光捕獲顯微切割法(laser capture microdissection，LCM)等。研究人員根據(jù)實驗條件和目的對單細(xì)胞的分離采取不同的方法。例如汪俊幫等人在顯微鏡下分離出了小鼠(Musmusculus)胚胎二細(xì)胞期的細(xì)胞[39]。

2.2 建庫及數(shù)據(jù)獲得

scRNA-seq數(shù)據(jù)的獲得通常包括細(xì)胞裂解、mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、cDNA擴增、文庫構(gòu)建4個步驟。首先加入緩沖液使細(xì)胞降解，獲得mRNA，去除蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)，純化mRNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄，一般使用oligo-dT引物和SuperscriptⅡ或Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈，并通過模板轉(zhuǎn)換，合成cDNA的第二條鏈。再對已逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進行PCR或者IVT擴增，對擴增得到的產(chǎn)物進行純化測序。

單個哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的總RNA含量約為10 pg，其中mRNA約為0.1—0.5 pg，而目前高通量測序文庫需要至少數(shù)十納克DNA，因此單細(xì)胞RNA-seq的文庫構(gòu)建過程需將起始核酸進行數(shù)十萬倍擴增[40]。根據(jù)合成第二條cDNA鏈時使用的酶，可將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的cDNA擴增方法分為PCR法、體外轉(zhuǎn)錄法和Phi29 聚合酶法。將擴增得到的產(chǎn)物進行純化后，一般采用高通量測序技術(shù)(high-throughput RNA sequencing)對轉(zhuǎn)錄組進行不同深度測序分析，得到大量原始的讀長(reads)，初步得到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

2.3 分析

對scRNA-seq數(shù)據(jù)的處理首先要進行質(zhì)量控制、表達量估計以及數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化。獲得scRNA-seq原始reads后，需要對原始reads，對齊reads及不同批次細(xì)胞進行質(zhì)量控制，以剔除低質(zhì)量數(shù)據(jù)。質(zhì)量評估后，采用不同的數(shù)據(jù)表達方式來代表表達水平。但這些方法不適用于直接比較細(xì)胞間的表達量差異，對于大多數(shù)下游分析，均需要先將不同細(xì)胞的數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。scRNA-seq實驗中存在的各種噪聲，會對后續(xù)分析造成影響，所以，也需對數(shù)據(jù)進行評估和調(diào)整實驗誤差，來減少技術(shù)或生物來源造成的scRNA-seq實驗的噪聲。根據(jù)所調(diào)查的生物問題有許多分析方法，本文從細(xì)胞水平分析和基因水平分析兩個方面進行介紹。

2.3.1 細(xì)胞水平分析

細(xì)胞水平分析包括可視化、聚類分析、細(xì)胞發(fā)育階段推斷和排序等[18，31-33]。處理單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)這樣一個高維的數(shù)據(jù)時，一個常用的策略是將這些細(xì)胞投影到低維的空間上，達到可視化分析，也就是降維技術(shù)，通過僅考慮二維或三維空間，可視化提供了定性地探索數(shù)據(jù)的平均值。聚類分析用于識別細(xì)胞亞型(如細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞分化周期的判定等)，提供了通過相似性對細(xì)胞進行分組的機制。scRNA-seq能夠提供單個細(xì)胞全基因表達譜，利用scRNA-seq數(shù)據(jù)，結(jié)合計算機技術(shù)可將非同步細(xì)胞群中單個細(xì)胞的分化路徑排序。細(xì)胞發(fā)育階段推斷和排序分析是通過降維和基于圖論的原則，將處于不同分化階段的細(xì)胞進行排序。Monocle、PQ-trees等方法的使用使得scRNA-seq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成細(xì)胞所處的不同分化階段，可以確定基因表達的動態(tài)變化。

2.3.2 基因水平分析

基因水平分析包括高變異基因的鑒定、差異表達基因和標(biāo)記基因的識別、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析等。對于高變異基因的鑒定，Brennecke等首先利用插入分子估計了技術(shù)噪音，并建立了均值-方差關(guān)系模型來識別高度可變的基因[41]；Kim等提出了一個基于生成模型的統(tǒng)計框架，將總方差分解為技術(shù)和生物方差，這將有助于識別可變基因[42]；貝葉斯模型可聯(lián)合模擬尖峰和內(nèi)源性基因，并提供生物變異程度的后驗分布[43]。在scRNA-seq研究中識別亞群的差異表達基因和標(biāo)記基因是一個簡單但重要的分析。MAST、M3Drop等scRNA-seq實驗方法通過混合模型或簡單統(tǒng)計檢驗識別差異表達。標(biāo)記基因的識別是通過差異分析來識別每個cluster下的標(biāo)記基因，將該cluster下的細(xì)胞作為一組，其他cluster下的細(xì)胞作為另一組，然后進行差異分析。scRNA-seq研究的一個重要應(yīng)用是識別基因的共調(diào)控模塊和利用基因與基因表達相關(guān)性構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究人員已經(jīng)鑒定了許多共表達基因的功能模塊，可以描述小鼠的每個胚胎發(fā)育階段。scRNA-seq研究中推斷的網(wǎng)絡(luò)是無向的；也就是說，它們不能在基因之間提供直接的調(diào)節(jié)關(guān)系。為了揭示哪個基因位于調(diào)控級聯(lián)的上游/下游，通常需要進行擾動實驗(例如敲除目的基因)。

3 scRNA-seq在動物研究中的應(yīng)用

3.1 早期胚胎發(fā)育

在胚胎發(fā)育的早期階段，受精卵會經(jīng)歷廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和表觀遺傳重編程過程。早期胚胎發(fā)育階段的細(xì)胞數(shù)量極為稀少，其轉(zhuǎn)錄組分析尤其需要scRNA-seq技術(shù)。2009年，Tang等首次應(yīng)用scRNA-seq于單個小鼠卵裂球，檢測到比微陣列技術(shù)多75%的基因表達，并識別出1 753個以前未知的剪接連接；對于卵母細(xì)胞，與野生型對照相比，1 696和1 553個基因分別異常上調(diào)[3]。2013年，小鼠和人類著床前胚胎的高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜陸續(xù)完成[16-17]。利用scRNA-seq篩選出影響盤羊(Ovisammon)卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵基因，并結(jié)合實時定量PCR技術(shù)對基因進行定量驗證，即從分子水平研究卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控機制，以此來提高羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育后期胚胎的潛力[29]。蘭道亮等對野牦牛(Bosgrunniens)GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和數(shù)據(jù)對比分析，篩選出了4 767個差異表達基因[30]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的時間序列可以揭示細(xì)胞分化途徑的動態(tài)特征。研究人員用scRNA-seq技術(shù)分別在斑馬魚(Daniorerio)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)早期胚胎發(fā)育過程中建立了基因表達動態(tài)圖譜，將相關(guān)數(shù)據(jù)以幾分鐘到幾小時的時間間隔組合在一起，對細(xì)胞進行逐個描述，并觀察胚胎最終形成的過程，揭示了單個細(xì)胞構(gòu)建整個生物體的完整過程[31-33]。這些研究為野生動物早期胚胎發(fā)育的研究提供了新的途徑。

3.2 組織器官發(fā)育

組織器官發(fā)育是scRNA-seq技術(shù)應(yīng)用的另一個重要領(lǐng)域。多種組織器官(包括肺[4]、腦[34]、心臟[35]、腎臟[36]、小腸[37]等)發(fā)育過程中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析已被報道。2018年，研究人員對來自小鼠20個器官和組織的約10萬個單細(xì)胞進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果揭示了之前研究中從未完整展示的基因表達圖譜，并且能直接比較不同組織和細(xì)胞類型的基因表達，最終建立了一個名為Tabula Muris的儲存小鼠細(xì)胞信息的開源數(shù)據(jù)庫[39]。DeLaughter等從小鼠胚胎發(fā)育的7個不同階段提取心臟細(xì)胞樣本，利用scRNA-seq技術(shù)檢測了單個細(xì)胞基因活性隨時間的變化，提供了一個時間和空間的圖譜，描繪了心臟不同細(xì)胞群的發(fā)展[35]。scRNA-seq技術(shù)可以通過分析單個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組精細(xì)地識別出各種細(xì)胞類型，同時能夠發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型以及標(biāo)記基因。Carter等研究得到了來自12個關(guān)鍵發(fā)育時間點的小鼠小腦單細(xì)胞圖譜，鑒定了主要的小腦細(xì)胞亞群，確定了有助于小腦發(fā)育的亞群[18]。Pandey等將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與腦解剖相結(jié)合，得到了約13 000個斑馬魚松果體韁細(xì)胞，確定了18種神經(jīng)元類型和幾十種標(biāo)記基因，創(chuàng)建了全面的斑馬魚松果體韁單細(xì)胞圖譜[19]。scRNA-seq技術(shù)鑒定細(xì)胞類型和識別標(biāo)記基因的特點將有力推動發(fā)育生物學(xué)的研究。

3.3 免疫系統(tǒng)

免疫細(xì)胞對抗原物質(zhì)的應(yīng)答反應(yīng)具有復(fù)雜和不均一性的異質(zhì)性特點，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)有望在此方面揭示豐富的未知信息。先天性淋巴細(xì)胞(ILCs)是動物免疫應(yīng)答和體內(nèi)平衡的重要介質(zhì)。Hernández等利用scRNA-seq獲得了組織穩(wěn)態(tài)期間和免疫攻擊后斑馬魚淋巴細(xì)胞的綜合圖譜，從野生型斑馬魚的腸道以及rag1突變(缺少T和B細(xì)胞)的斑馬魚中共收集14 080個單細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了ILC樣細(xì)胞[24]。應(yīng)用scRNA-seq可以獲得斑馬魚特異性免疫細(xì)胞類型的第一個轉(zhuǎn)錄組并對其進行表征。差異表達分析揭示了新的免疫細(xì)胞特異性基因，為免疫系統(tǒng)的進化提供了更多的線索[25]。在其他研究中，scRNA-seq揭示了斑馬魚中存在Th2和調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)，進一步證實了哺乳動物和硬骨魚在免疫生物學(xué)上的相似性[26-27]。

3.4 其他

scRNA-seq技術(shù)可作為一種新的腫瘤細(xì)胞鑒定技術(shù)，更加精準(zhǔn)地判定腫瘤類型以及揭示相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Puram等采用scRNA-seq的方法分析了來自頭頸鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞。他們通過分析構(gòu)建出頭頸癌中存在的所有不同細(xì)胞的圖譜[22]。scRNA-seq還可用于大腦細(xì)胞圖譜繪制。Carter等研究得到了來自12個關(guān)鍵發(fā)育時間點的小鼠小腦單細(xì)胞圖譜，利用已知的譜系標(biāo)記進行驗證，表明單細(xì)胞數(shù)據(jù)能準(zhǔn)確概括小腦的發(fā)育。最后，創(chuàng)建了名為Cell Seek的數(shù)據(jù)集[18]。Davie等研究構(gòu)建了全面的成年果蠅(Drosophilamelanogaster)大腦細(xì)胞圖譜；開發(fā)了SCENIC果蠅數(shù)據(jù)庫，能映射出果蠅大腦中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)類細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；繪制了大腦衰老過程中的細(xì)胞狀態(tài)變化，利用機器學(xué)習(xí)的方法，根據(jù)細(xì)胞的基因表達譜來準(zhǔn)確預(yù)測細(xì)胞的年齡[20]。除此之外，Gerber等針對東方蠑螈(Cynopsorientalis)肢體再生的問題，聯(lián)合使用Cre-loxP報告基因譜系跟蹤和scRNA-seq，追蹤了CT細(xì)胞譜系的再分化軌跡及肢體再生過程中特殊譜系的分子重建步驟[44]。Feregrino等利用發(fā)育中的紅原雞(Gallusgallus)的足趾作為研究脊椎動物模式形成的范例，使用scRNA-seq，對來自雞自噬模式3個關(guān)鍵發(fā)育階段的17 628個細(xì)胞進行了測序[45]。結(jié)果顯示鑒定了23個具有不同轉(zhuǎn)錄譜的細(xì)胞群，檢測出稀有細(xì)胞類型，推斷出在發(fā)育過程中與不同組織類型相一致的基因共表達模塊。Foster等研究小海膽(Hakiacorbularis)胚胎時利用scRNA-seq分析揭示了胚胎發(fā)育過程中存在的細(xì)胞類型、抑制各種信號通路導(dǎo)致的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化，以及這些通路在影響發(fā)育軌跡方面的選擇性[46]。非洲爪蟾蝌蚪具有很高的再生潛力，為了描述這種再生反應(yīng)，Aztekin等人在尾部截肢后進行了scRNA-seq[47]。轉(zhuǎn)錄譜分析顯示，再生組織細(xì)胞分泌與關(guān)鍵再生途徑相關(guān)的配體，向祖細(xì)胞發(fā)出信號，以重建丟失的組織。

4 展望

隨著第三代測序技術(shù)的發(fā)展，scRNA-seq技術(shù)也逐漸得到重視。近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)取得了較為明顯的發(fā)展，被應(yīng)用到諸多領(lǐng)域，隨著方法學(xué)的成熟，scRNA-seq技術(shù)在未來動物研究中將會得到更加廣泛地應(yīng)用?？赡馨▽Ω鞣N組織器官的發(fā)育過程進行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型等；與基因組編輯技術(shù)結(jié)合，對轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行單細(xì)胞分辨率分析；與細(xì)胞成像技術(shù)結(jié)合，揭示基因表達網(wǎng)絡(luò)引起細(xì)胞差異以及進行動態(tài)調(diào)控的作用機制提供檢測方法等。目前，scRNA-seq在野生動物保護研究中的應(yīng)用并不廣泛。野生動物保護研究主要集中在棲息地保護、環(huán)境資源保護、人為干擾等方面，對個體與基因?qū)哟蔚难芯坎⒉簧钊?。scRNA-seq在小鼠、果蠅、雞等實驗?zāi)Ｐ蛣游锘蚣倚笠约跋旙?、非洲爪蟾、斑馬魚等的應(yīng)用研究證明了該技術(shù)可應(yīng)用于野生動物的個體和基因?qū)哟蔚谋Ｗo研究中。未來，如果將scRNA-seq技術(shù)更多的應(yīng)用到野生動物研究中，在單細(xì)胞水平上研究野生動物不同組織的基因表達情況，包括基因突變、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等，構(gòu)建個體不同組織的細(xì)胞圖譜，研究個體干細(xì)胞發(fā)育及分化等內(nèi)容，從早期胚胎發(fā)育到組織器官發(fā)育、免疫系統(tǒng)等多個領(lǐng)域，可以更加充分地從個體和基因方面了解野生動物的發(fā)育生長，對更好地保護和利用野生動物具有重要意義。