唐思詩，李 燕，陳知行，戴仲秋，敖科萍，何 超

馬爾尼菲籃狀菌(talarom-yces marneffei)原名馬爾尼菲青霉菌(penicillium marneffei)，是一種條件性致病真菌，其動物宿主為竹鼠[1]，往往導(dǎo)致免疫低下人群感染[2,3]。近年來，隨著免疫抑制藥的使用和艾滋病患者的增多，馬爾尼菲籃狀菌病在臨床愈發(fā)常見[4]，主要表現(xiàn)為肺、肝臟、脾臟、皮膚、淋巴結(jié)、骨髓和血流等局限型或播散型感染，以播散型感染最為常見[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，馬爾尼菲籃狀菌病患者6個月內(nèi)病死率為11.3%～29.4%[8,9]，發(fā)生血流感染(Blood steam infection，BSI)的患者預(yù)后更差[10]，實驗室應(yīng)對該類疾病的診治提供病原學(xué)依據(jù)，以改善患者預(yù)后。本研究擬建立馬爾尼菲籃狀菌BSI的實驗室診斷路徑，為該類疾病的診治提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 2012-04至2020-02在四川大學(xué)華西醫(yī)院就診的臨床疑似發(fā)生真菌血流感染病例。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑 XN 9000全自動血細胞分析儀(日本希森美康集團)；BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀(法國生物梅里埃公司)；Autof ms1000全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；DNK A400全自動微生物聯(lián)合檢測儀(天津丹娜生物科技有限公司)。

瑞氏-吉姆薩染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、革蘭染色試劑(法國生物梅里埃公司)、乳酸酚棉藍染色劑(為實驗室制備)；沙保羅瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、土豆瓊脂培養(yǎng)基(PDA)；質(zhì)控菌株：馬爾尼菲籃狀菌CMCC(F)B33r。

1.3 方法

1.3.1 外周血細胞計數(shù)及血涂片鏡檢 使用全自動血細胞分析儀對患者血液樣本進行血細胞計數(shù)和分析。將血細胞分析儀提示結(jié)果異常的血液樣本混勻后推片，使用瑞士-吉姆薩細胞染液進行染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2 血培養(yǎng)

1.3.2.1 樣本接種與培養(yǎng) 將患者血液樣本分別接種于需氧和厭氧培養(yǎng)瓶，置于BacT/ALERT 3D全自動血培養(yǎng)儀，35 ℃孵育。5.0 ml注射器取報陽瓶中培養(yǎng)液進行涂片，革蘭染色并鏡檢。如查見真菌菌絲或者孢子，按照血培養(yǎng)危急值流程報告臨床。取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種于2個SDA平板，分別置于28 ℃和35 ℃孵育。

對于村鎮(zhèn)銀行來說，我們主要從三個方面來討論。首先，從村鎮(zhèn)銀行貸款業(yè)務(wù)的違約概率來看。我們假定村鎮(zhèn)銀行貸款業(yè)務(wù)的平均違約概率為P(0＜P＜1)，P值會受到監(jiān)管部門監(jiān)管強度的影響，隨著監(jiān)管強度θ的增加，村鎮(zhèn)銀行的選擇會偏向更為優(yōu)質(zhì)的貸款客戶，P值隨之下降，下降的速率呈遞減趨勢并最終趨同于0。在監(jiān)管強度超過一定程度θ*后P值將不再降低，表明村鎮(zhèn)銀行貸款的平均違約概率能夠被監(jiān)管強度上升改變的最高限度，即:

1.3.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 每日觀察SDA瓊脂的顏色變化和菌落形態(tài)特征。取SDA平板上含菌瓊脂點種于PDA平板，置于28 ℃孵育，每日觀察菌落的生長情況及形態(tài)特征，取生長良好的菌苔進行乳酸酚棉蘭染色并鏡檢，觀察鏡下特征。結(jié)合菌株溫度依賴型雙相生長和菌落特征進行菌株鑒定。

1.3.2.3 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)快速鑒定菌種方法建立 使用無菌棉拭子挑取SDA平板上生長的菌苔，于30.0 μl 70%甲酸溶液制成菌懸液，取1 μl菌懸液滴加于質(zhì)譜靶板孔位中，自然晾干形成菌膜；取1.0 μl HCCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質(zhì)溶液均勻覆蓋于菌膜表面，自然晾干后將靶板放入Autof ms1000全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)儀進行檢測；將待測菌所得蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫內(nèi)蛋白指紋圖譜進行對比，分析得到鑒定結(jié)果及分值。種屬鑒定的閾值分別為≥9.0和≥6.0，如果第一次檢測分值<9.0，則重復(fù)進行第二次檢測，取最高分值作為該鑒定菌株最終檢測結(jié)果。

1.3.3 血清(1-3)-β-D葡聚糖檢測(真菌G試驗) 采用顯色法對患者血清中的(1-3)-β-D葡聚糖進行檢測。

1.3.4 觀察項目 收集患者基礎(chǔ)疾病、臨床表現(xiàn)以及與血培養(yǎng)陽性標本同一時期送檢的其他實驗室指標，主要包括血漿CD4+T淋巴細胞百分比(CD4+T%)、血漿CD8+T淋巴細胞百分比(CD8+T%)、血漿CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞比值(CD4+T/CD8+T)、血漿降鈣素原(PCT)等。分析病例診治情況和臨床結(jié)局指標(住院天數(shù)和住院病死率)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究計數(shù)資料采用百分比(%)表示，正態(tài)分布資料采用均值表示，偏態(tài)分布資料采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示。

2 結(jié) 果

2.1 病例基本情況 本研究納入馬爾尼菲籃狀菌血流感染病例24例，其中男21例，女3例，平均年齡42.2歲(20～55歲)，基礎(chǔ)疾病均患有艾滋病。

圖1 外周血涂片瑞氏-吉姆薩染色馬爾尼菲籃狀菌鏡下特征(×1000)

2.3 血培養(yǎng)及分離株鑒定

2.3.1 血培養(yǎng)報陽液的革蘭染色特征 血培養(yǎng)標本在儀器中孵育，平均報陽時間為(2.8±1.5)d，范圍為0.5～4.5 d，將陽性瓶培養(yǎng)液進行涂片和革蘭染色，鏡下查見兩頭鈍圓的臘腸形菌體(孢子相，圖2A)3例(12.5%)，查見真菌菌絲體(菌絲相，圖2B)21例(87.5%)。實驗室立即按照血培養(yǎng)危急值流程報告臨床：血培養(yǎng)報陽，查見真菌孢子和(或)菌絲。

圖2 馬爾尼菲籃狀菌血流感染血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)液革蘭染色鏡下特征

2.3.2 溫度依賴型雙相生長特性 將血培養(yǎng)報陽培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種SDA平板，如在28 ℃培養(yǎng)48～72 h觀察到灰白色絨毛狀菌落和產(chǎn)紅色色素(圖3A)，在37 ℃培養(yǎng)48～72 h觀察到濕潤平坦的淡褐色膜樣的酵母樣菌落(圖3B)，則為溫度依賴型雙相生長試驗陽性。

圖3 馬爾尼菲籃狀菌在SDA平板孵育48～72 h的菌落特征

2.3.3 菌落形態(tài)特征 取2.3.2轉(zhuǎn)種的SDA平板上菌苔點種于PDA平板，28 ℃不同孵育時間所見菌落特征圖例如圖4所示，培養(yǎng)期間取生長良好的菌苔進行乳酸酚棉蘭染色，鏡下查見：帚狀枝，?；嫌?～6個瓶梗，瓶身膨大頂端變窄，有分生孢子，分生孢子鏈呈長彎曲狀，孢子呈圓形或卵圓形(圖5)。

圖4 馬爾尼菲籃狀菌在PDA平板孵育不同時間的菌落特征

圖5 馬爾尼菲籃狀菌在PDA平板孵育48 h(A)和72 h(B)后乳酸酚棉蘭染色鏡下特征(×400)

2.3.4 MALDI-TOF MS鑒定馬爾尼菲籃狀菌 我們對9例SDA平板上生長48 h后的菌苔進行了MALDI-TOF MS檢測，然后將待測菌株蛋白質(zhì)峰與數(shù)據(jù)庫內(nèi)蛋白指紋圖譜進行比對。9例分離株均鑒定為馬爾尼菲籃狀菌。待測菌株蛋白質(zhì)峰與數(shù)據(jù)庫內(nèi)蛋白指紋圖譜進行比對圖例如圖6所示。

圖6 MALDI-TOF MS用于馬爾尼菲籃狀菌鑒定結(jié)果質(zhì)譜峰

2.4 真菌G試驗 8例進行了血清真菌G試驗檢測，其中5例陽性(62.5%)，3例陰性(37.5%)。

2.5 其他實驗室指標 本研究收治入院治療的患者16例，血漿CD4+T%均顯著降低(平均值3.2%，參考值33.2%～47.9%)，血漿CD8+T%均增高(平均值57.1%，參考值20.4%～34.7%)，CD4+T/CD8+T均顯著降低(平均值0.08，參考值1.0～2.3)，血漿PCT均增高(平均值10.9 μg/ml，參考值<0.05 μg/ml)。

2.6 病例診治過程和臨床結(jié)局 本研究24例血培養(yǎng)均查見馬爾尼菲籃狀菌，可同時結(jié)合外周血細胞計數(shù)、血涂片鏡檢、真菌G試驗及感染相關(guān)實驗室指標，進行馬爾尼菲籃狀菌BSI實驗室診斷，診斷路徑如圖7所示。

圖7 馬爾尼菲籃狀菌血流感染的實驗室診斷

16例住院患者中,13例(81.3%)出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，10例(62.5%)具有呼吸系統(tǒng)癥狀，12例(75.0%)繼發(fā)細菌和/或真菌感染，包括肺部感染8例和血流感染4例?；颊咦≡褐形粫r長為12.0 d,范圍為1.0～64.0 d，7例(47.7%)好轉(zhuǎn)出院，9例(52.3%)死亡。

3 討 論

馬爾尼菲籃狀菌是溫度依賴型雙相真菌，可引起艾滋病患者及其他免疫缺陷病患者繼發(fā)深部真菌感染。研究表明早期、足量、有效的抗真菌治療可以改善馬爾尼菲籃狀菌病的結(jié)局[11]。

本研究通過病例外周血細胞計數(shù)、血培養(yǎng)及真菌G試驗和臨床資料建立了馬爾尼菲籃狀菌BSI的實驗室診斷路徑如圖7所示，在實際工作中，應(yīng)依據(jù)實驗室條件進行方法學(xué)選擇，如缺乏質(zhì)譜儀，可僅進行基于菌株形態(tài)學(xué)鑒定的路徑。本實驗室尚未開展常規(guī)真菌核酸測序檢測，有報道顯示，基因測序在絲狀真菌感染中也得到廣泛應(yīng)用[12,13]，如患者高度懷疑為該類感染，但血培養(yǎng)陰性，可考慮建立基于核酸的分子生物學(xué)方法，可提高檢測靈敏度，也可縮短樣本檢測時間。

馬爾尼菲籃狀菌BSI，外周血細胞計數(shù)僅僅是一種初篩方法，且與外周血中的菌量密切相關(guān)，本研究納入病例中也僅有1例外周血涂片查見疑似病原菌。同時，外周血涂片鏡檢還可鑒別診斷和馬爾尼菲籃狀菌病臨床表現(xiàn)相似的另一種溫度依賴型雙向真菌，即莢膜組織胞漿菌[14]。

血培養(yǎng)是馬爾尼菲籃狀菌血流感染實驗室診斷的重要依據(jù)[15]，普通實驗室應(yīng)掌握本研究結(jié)果部分詳述的形態(tài)學(xué)鑒定特征。另外，本研究納入病例的血培養(yǎng)標本平均報陽時間為2.0 d，報陽曲線有時并不呈現(xiàn)典型的S形生長曲線，容易被誤認為是假陽性曲線，提示針對疑似發(fā)生真菌血流感染的病例，血培養(yǎng)生長曲線的參考價值有限。我們發(fā)現(xiàn)，針對這類病例血培養(yǎng)報陽培養(yǎng)液的涂片、革蘭染色及轉(zhuǎn)種，如采用2.0 ml針管會造成針頭堵塞，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，因此推薦使用5.0 ml粗針管進行涂片和平板接種。特別提醒，馬爾尼菲籃狀菌為溫度依賴型雙相真菌，是籃狀菌屬中可引起人體深部真菌感染的條件致病菌，我國衛(wèi)生部2006年公布的《人間傳染的病原微生物名錄》中將其危害程度歸于第三類[16]，因此所有樣本檢測操作應(yīng)在Ⅱ級生物安全條件進行，操作過程中應(yīng)避免孢子飛散，接種后可使用透明膠帶密封平板再孵育，樣本和菌株使用后應(yīng)高壓滅菌后按照廢棄污染物處理。

近年來，MALDI-TOF MS具有操作簡單、快速、準確性高、可重復(fù)性高的特點，往往數(shù)分鐘即可對單個樣本進行準確的菌種鑒定，已廣泛應(yīng)用于病原菌鑒定[17]，它是一種通過比對特征性蛋白指紋圖譜對微生物進行快速有效鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[17,18]。我們依據(jù)實驗室質(zhì)譜儀和絲狀真菌鑒定技術(shù)開展情況，對9例病例分離株進行復(fù)蘇和菌種鑒定，鑒定結(jié)果均為馬爾尼菲籃狀菌。有質(zhì)譜儀的實驗室可以使用該方法對馬爾尼菲籃狀菌進行快速鑒定，輔助疾病早期診斷。

血清真菌G試驗主要檢測酵母菌和絲狀真菌細胞壁的真菌(1-3)-β-D 葡聚糖，該多糖成分具有較高的特異性，可作為人體深部真菌感染的標志[19]。有研究認為真菌G試驗具有輔助診斷血培養(yǎng)確診合并播散性馬爾尼菲青霉菌病的臨床應(yīng)用價值[19]，陽性率為48.2%～80.0%[19-21]，本研究中回顧性分析發(fā)現(xiàn)8例患者進行了真菌G試驗檢測，陽性率為62.5%，但由于樣本量較小，有待于進一步擴大樣本分析。

本研究納入的16例住院患者中，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和呼吸系統(tǒng)癥狀，部分免疫學(xué)指標異常(CD4+T%顯著降低，CD+T8%增高，CD4+T/CD8+T顯著降低)，75.0%患者繼發(fā)了細菌/真菌的感染(又以肺部感染為主)，住院中位時間為12.0 d，住院病死率較高(52.3%)，這可能與患者機體免疫功能差、基礎(chǔ)疾病和治療效果等有關(guān)，針對該類患者在進行基礎(chǔ)疾病和支持治療的同時，應(yīng)盡早針對原發(fā)和繼發(fā)感染進行診治，以改善患者預(yù)后。

綜上所述，馬爾尼菲籃狀菌BSI的實驗室診斷應(yīng)綜合外周血細胞計數(shù)、血培養(yǎng)、真菌G試驗以及臨床資料綜合分析，這類病例免疫力差，易繼發(fā)感染，預(yù)后較差。