王 響 鞠貴春

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春，130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春，130118)

鹿全身是寶，鹿茸、鹿角、鹿胎、鹿骨、鹿鞭、鹿血等均是《本草綱目》與民間驗方有記載的可供藥用的名貴中藥材和食療補品。尤其是鹿茸有明顯改善人體機能的功效，被列為動物藥之首?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中曾有記載“味甘溫，主漏下惡血，益氣強治補血之功，補腎之效?！薄侗静菥V目》中亦有記載“補腎壯陽，生精益血，補髓健骨”。我國對鹿茸的研究具有悠久的歷史，很早之前，人們對鹿茸的藥理作用不斷地進行探討，對鹿茸的多種藥理活性成分進行了分離，確定了鹿茸中含有蛋白多肽、甾體化合物、無機元素、多糖、脂肪酸、磷脂、胺類、生物堿和脂多糖等多種有效成分[1]，其中鹿茸多肽類物質(zhì)含量在50%以上，包含多種生長因子，可促進人體多種生長因子分泌，對人體的一些生理功能具有調(diào)節(jié)作用，具有顯著的藥理作用和保健功效。

1 鹿茸多肽的研究現(xiàn)狀

趙麗莉[2]利用Alcalase AF 2.4L堿性蛋白酶酶解馬鹿茸生成多肽，并且通過不斷優(yōu)化酶解條件從而選取出馬鹿茸酶解的最佳工藝。采用Tricine凝膠系統(tǒng)對馬鹿茸酶解后多肽分布進行分析，得出結論：馬鹿茸酶解前分子量主要分布在10—75 kDa，馬鹿茸酶解后分子量主要分布在5—2 kDa。郝林琳[3]從新鮮馬鹿茸中提取活性多膚，SDS-PAGE顯示其為一系列分子量低于17 kDa多肽混合物，檢測到其含有IGF-1、EGF、NGF等生長因子。Zhang等[4]從梅花鹿茸中提取出一種分子量為7.2 kDa，由68個氨基酸組成的水溶性多肽活性物質(zhì)，具有刺激軟骨生長，成骨樣細胞增殖的作用?？吕罹У萚5]從梅花鹿鹿茸中分離出分子量為153 kDa，能夠促進神經(jīng)纖維生長活性的鹿茸多肽。段冷昕[6]從馬鹿茸中分離出一種分子量為3.2 kDa的單體多肽，由32個氨基酸殘基組成，又稱為32肽，其中含量最多的氨基酸分別為纈氨酸，賴氨酸、甘氨酸和丙氨酸，具有抑制細胞內(nèi)IL-6，IL-1因子的功能。

2 鹿茸多肽的提取方法

鹿茸多肽的提取方法有很多種，常用的提取方法主要有以下幾種。

2.1 有機溶劑萃取法

在中藥提取方面，是最常用的方法，通常采用乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、苯、氯仿等有機溶劑提取。本方法的優(yōu)點是毒副作用小，溶劑易獲得，成本低，回收方便。缺點是有機溶劑對鹿茸多肽活性具有一定的破壞作用。有機溶劑熔點低、易燃，操作過程對溫度要求嚴格，控制難度較大，本方法可將鹿茸提出物分為鹿茸多肽組分Ⅰ和組分Ⅱ，這兩種組分均具有抗炎和促生長的作用[7]。

2.2 CO2超臨界萃取法

本方法利用減壓和變溫使提取物分離出來，無須回收溶劑，節(jié)約能耗，操作簡單，成本低，可循環(huán)利用。但是隨著萃取化合物的極性基團增多，萃取難度加大，化合物的相對分子質(zhì)量越高，萃取難度也增大。在鹿茸提取上具體就是將鹿茸冷凍后干燥，用粉碎機粉碎過篩，提取鹿茸多肽時，首先將鹿茸冷凍干燥，粉碎過篩后放入CO2超臨界萃取。在萃取壓力35 MPa，萃取溫度40 ℃以下時蛋白質(zhì)的萃取率可達130.73 mg/g[8]。

2.3 酶解提取法

本法可彌補有機溶劑萃取法的不足，解決了低溫控制難的問題，提取的鹿茸多肽活性高、純度好。將鹿茸冷凍干燥，粉碎后加入鹽酸胍和胃蛋白酶抑制劑浸提，離心取上清液，加入硫酸銨進行蛋白梯度鹽析，離心后的沉淀物進行復性，用透析袋截留，冷凍干燥后得到水溶性蛋白，然后利用胃蛋白酶、胰酶、氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)酶的pH，獲得不同分子量的鹿茸蛋白水解肽，采用的酶不同，鹿茸多肽獲得率也不同[9]。

2.4 Tris-Hcl法提取法

將鹿茸鮮品剃毛切薄片，沖洗后稱重，反復勻漿，勻漿過程中不斷添加勻漿液(Tris-Hcl緩沖溶液，pH 8.0)，4 ℃條件下離心后取上清液。除鹽后凍干，得到鹿茸蛋白質(zhì)粗提物，在-20 ℃保存。緩沖液pH值、溫度與提取時間影響提取率。此提取方法簡單易操作，節(jié)省時間，成本低，但pH值易受溫度影響[10]。

2.5 超聲波提取法

通常以水、醋酸緩沖溶液、堿性碳酸鹽緩沖溶液或磷酸緩沖溶液為溶劑，將鮮鹿茸洗凈、去毛、切片、粉碎后脫脂，根據(jù)不同需要加入不同的提取液，在特定溫度下超聲浸提一定時間，然后離心取上清液，透析后冷凍干燥。此提取方法的優(yōu)點是操作時間短，成本低，操作簡單安全性高，可有效提高鹿茸多肽的提取率[11]。

2.6 高壓電場法提取法

利用分子在高壓電場條件下產(chǎn)生極化反應，利用電場瞬間高強度的脈沖來破壞細胞壁，使細胞內(nèi)容物釋放出來。姜薇等[12]利用高壓脈沖電場輔助菠蘿蛋白酶制備鹿茸抗氧化肽，并進行了分離純化。此提取方法常溫提取，耗時短，可最大限度地保留鹿茸多肽的生物活性，節(jié)能無污染。

2.7 勻漿法

取新鮮鹿茸洗凈后切塊粉碎，浸泡沖洗至無色，用預先放于層析柜(4 ℃)中冷卻加入預冷的勻漿液(冰醋酸溶液)，膠體磨勻漿，間隔一定的時間吸取混合勻漿液，在4 ℃條件下，轉(zhuǎn)速離心后吸取上清液，放入透析袋中透析脫鹽，定時更換透析液并測量pH，直至pH為中性停止透析，透析袋內(nèi)液體為所需蛋白。此提取方法的優(yōu)點是隨著勻漿時間的增加，鹿茸多肽的濃度增加。但是與超生提取法相比，耗時較長[13]。

3 鹿茸多肽的藥理作用

3.1 對骨骼的藥理作用

劉繼華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，對骨折小鼠注射鹿茸多肽會使小鼠骨折愈合速度明顯加快，鹿茸多肽使骨髓腔充滿大量骨髓細胞，骨性連接更加稠密，抗骨折能力增強。李文超等[15]發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽對白介素-1β誘導的大鼠椎間盤軟骨終板細胞的增殖和基質(zhì)蛋白、基質(zhì)降解酶的基因表達具有逆轉(zhuǎn)作用。并且能有效地拮抗白介素-1β對軟骨終板細胞增殖的抑制作用，上升Ⅱ型膠原蛋白基因的表達，下調(diào)Ⅹ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-13基因的表達具有延緩椎間盤軟骨終板退變的作用。Zhang等[16]研究證實馬鹿茸多肽顯著逆轉(zhuǎn)了去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥，改善了骨重量系數(shù)、骨礦物質(zhì)密度、礦物質(zhì)含量和微結構，抑制了白介素1與白介素6的活化，同時發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽還具有促進軟骨細胞和成骨細胞增殖的作用。

3.2 對心肌細胞的藥理作用

徐巖等[17]研究表明，鹿茸多肽可促進心肌干細胞基因和心肌肌球蛋白重鏈基因的表達，通過調(diào)節(jié)氧化酶的活性，促進過氧化物的分解，對心肌干細胞分化成心肌細胞具有促進作用?，F(xiàn)代研究表明[18]鹿茸多肽對大鼠心肌缺血性損傷有保護作用，在一定劑量范圍內(nèi)可顯著減少因心肌缺血而造成的心肌梗死面積。鹿茸多肽具有提高血清和心肌組織中的超氧化物歧化酶的活性，降低血清中肌酸激酶、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和心肌組織中丙二醛的含量的作用，鹿茸多肽在心肌損傷性疾病的康復中有比較好的治療價值。

3.3 抗炎癥作用

炎癥與體內(nèi)血清中的丙二醛，超氧化物歧化酶和炎癥因子NO的含量有關，鹿茸蛋白水解肽可通過載體運輸和旁路運轉(zhuǎn)的方式被小腸上皮吸收利用。已有研究證實[19]：鹿茸多肽可有效抑制腸炎、風濕性關節(jié)炎等急慢性炎癥，對哮喘和動脈粥樣硬化也具有抑制作用。Dong等[19]認為鹿茸多肽對椎間盤髓核細胞原代培養(yǎng)有積極影響，顯著抑制由脂多糖誘導髓核細胞而產(chǎn)生的炎癥因子，包括白細胞介素-1β，腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6。鹿茸肽還會抑制由脂多糖誘導的丙二醛的增加和超氧化物歧化酶的減少，并且減少脂多糖對機體的攻擊，對抗椎間盤髓核細胞原代培養(yǎng)中脂多糖介導的炎癥。王昊天[8]采用CO2超臨界提取法和酶解法得到多種分子量不同的多肽，對抗炎效果進行了評估，認為鹿茸肽抗炎效果是多種肽共同作用的結果。Lee等[20]采用堿性蛋白酶酶解鹿茸粉得到了具有抗機體炎癥效果的鹿茸多肽，并證實鹿茸多肽會抑制炎癥介質(zhì)如一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達。趙磊等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹿茸水解蛋白肽更容易被小腸上皮細胞吸收，并且可顯著降低NO含量，增加血清中超氧化物歧化酶的含量，改善機體內(nèi)的氧化應激狀態(tài)，抗炎效果較好。這些研究結果表明鹿茸多肽可作為具有抗炎作用的潛在天然藥物。

3.4 抗氧化作用

機體的氧化機制與機體的衰老機制相關，據(jù)劉春娟[21-22]研究證明，鹿茸多肽增強超氧化物歧化酶活性，清除體內(nèi)過多的氧自由基的作用，在延緩衰老方面有顯著的功效。利用膜分離技術從鹿茸中分離出不同分子量的多肽并與維生素C為對照，比較不同分子量的多肽的抗氧化能力，結果表明分子量在6 214 μ以下的多肽在8.0—10.0 mg/mL的濃度下對羥基自由基的清除能力和對脂質(zhì)體氧化抑制的能力明顯高于維生素C。

3.5 抗疲勞作用

已有研究證明[23]鹿茸多肽可提高人體內(nèi)肌糖原和肝糖原的儲備量，或者是減少在運動過程中體內(nèi)肌糖原和肝糖原的損耗，由此兩種途徑延長糖在體內(nèi)代謝的時間從而達到抗疲勞作用，并且隨著鹿茸多肽劑量的增加，抗疲勞的作用越明顯。

3.6 對肝臟的藥理作用

肝纖維化是很多肝臟疾病的誘因，肝竇狀毛細血管化是肝細胞纖維化過程中的一個重要的病理改變，鹿茸多肽具有調(diào)解人體肝細胞，改善肝損傷，提高肝臟功能，從而能夠保護人體肝臟。鹿茸多肽能夠促進肝細胞再生，修復肝細胞損傷[24]。段冷昕[6]利用大鼠肝纖維化模型，觀察發(fā)現(xiàn)鹿茸肽可減輕肝竇毛細血管化，改善肝臟微循環(huán)，減輕肝纖維化病變，通過提高機體內(nèi)對自由基的清除程度，保護肝臟的細胞，在肝臟疾病的治療中作用明顯。

3.7 促進皮膚創(chuàng)口愈合

在臨床上皮膚創(chuàng)傷常見，包括燒傷、燙傷、劃傷等導致皮膚表面出現(xiàn)破損，鹿茸多肽作為鹿茸含量豐富的活性物質(zhì)，對人體組織間細胞的生長有促進作用。牛瓊等[25]利用鹿茸多肽治療大鼠背脊創(chuàng)口，發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽可促進皮膚創(chuàng)口愈合，作用機制是促進表皮細胞和成纖維細胞的分裂，鹿茸多肽在對皮膚創(chuàng)口治療過程中外敷給藥的效果要比注射給藥效果顯著。

3.8 對神經(jīng)系統(tǒng)作用

Bai等[26]認為鹿茸多肽在體外對神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元細胞的過程有明顯促進作用。Zhang等[4]證明，鹿茸多肽-聚乳酸聚羥基乙酸復合膜能夠提供神經(jīng)修復所需要的微環(huán)境，而鹿茸多肽作為其中必不可少的神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進周圍神經(jīng)再生。魏延云等[27]認為鹿茸多肽對大鼠坐骨神經(jīng)損傷，具有促進神經(jīng)再生、加快神經(jīng)軸生長作用。朱文赫等[28]認為鹿茸多肽可對抗神經(jīng)性藥物對小鼠記憶的損傷以及微波輻射對小鼠神經(jīng)細胞的損傷，對小鼠的記憶鞏固和記憶修復有促進作用。

3.9 其他作用

徐巖等[29]認為鹿茸多肽對人膠質(zhì)瘤細胞的增殖有抑制作用，二者之間有一定的量效關系，在腫瘤細胞的G2/M期阻滯腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡。黎同明等[30]研究證明，鹿茸多肽對生殖系統(tǒng)也有顯著作用，鹿茸多肽可提高雄鼠腺垂體細胞分泌的黃體生成素和睪酮的含量，對陽痿和性功能障礙有一定的治療作用。 Zang等[31]研究證實鹿茸多肽可使老化的雄性小鼠的性功能顯著改善，鹿茸對性功能的影響是通過促進幾種合成睪酮的限速酶的表達從而促進體內(nèi)睪酮合成。Zhu等[32]研究證明從鹿茸中分離出7.0 kDa的多肽可明顯增強人靜脈內(nèi)皮細胞的活力，減少細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位去極化，抑制氧化應激，證明了鹿茸多肽在治療心血管疾病的前景。Zhao等[33]證實鹿茸肽可通過阻斷TGF-β1信號傳導來防止心臟纖維化，在心臟組織中鹿茸肽具有抗纖維化作用。

4 小結

我國目前已經(jīng)具有了較為成熟的鹿養(yǎng)殖和鹿產(chǎn)品加工技術，多種分離純化方法都能夠提取鹿茸多肽，但是每一種分離提純方法都有一些不足的問題，還需要探索一種更有效、更快速、對成分活性損傷小的分離純化技術，在制劑工藝和給藥途徑上還需進一步規(guī)范。鹿茸多肽的作用機理還需要進行研究，如何能保證多肽分子在未起作用之前不失活。隨著鹿茸多肽在人類生活中廣泛的應用，對鹿茸多肽類產(chǎn)品質(zhì)量控制方法和毒副作用還需要研究。在藥品用藥安全方面和藥理作用方面還需進一步研究。