金愛燕，李立萍，朱 虹，高春成，左文娜，王洪芹

(滄州市中心醫(yī)院 耳鼻喉科，河北 滄州061000)

鼻咽癌是頭頸部最為常見的腫瘤類型，發(fā)病率逐年遞增，具有隱匿性強、進展緩慢的特點[1]。大多數(shù)晚期鼻咽癌患者經(jīng)放射治療后仍會復發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。文獻報道[3]，鼻咽癌的發(fā)生和癌基因的活化表達相關，因此揭示鼻咽癌相關的基因和調(diào)控機制對治療鼻咽癌具有極其重要的意義。長鏈非編碼RNA(long-chain noncoding RNA，lnc RNA)曾被認為不發(fā)揮實際作用，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤細胞周期、腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移與化療耐藥等相關的信號通路方面均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[4]。作為lnc RNA家族成員之一，非編碼RNA(anti-differentiation noncoding RNA，Lnc RNA)PCGEM1已被證實在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有分化調(diào)控的作用[5]。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中有諸多非編碼RNA、抑癌基因、促癌基因及蛋白因子的參與，但目前關于PCGEM1在鼻咽癌中的作用研究報道甚少，其是否能夠調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞的放療敏感性尚不清楚。因此，本研究通過對鼻咽癌組織和細胞株的研究，探討PCGEM1對鼻咽癌細胞輻射敏感性的分子機制，為新型靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2016年1月-2018年6月經(jīng)放射治療失敗后于我院接受手術(shù)治療的95例鼻咽癌患者癌組織及距離癌組織超過2 cm處的正常組織，用以上組織構(gòu)建鼻咽癌組織芯片，在免疫組織化學染色后共15例組織標本出現(xiàn)不同程度缺失，剩余80例標本經(jīng)組織病理學檢測證實為原發(fā)性鼻咽癌，并納入研究，患者年齡38-72歲，中位年齡51歲。所有患者均同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)我院倫理委員會審核批準后收集標本。

1.2 細胞及主要試劑和儀器

鼻咽癌細胞株SUNE-1購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，siPCGEM1及陰性對照netative control(NC)干擾片段，miR148a、PCGEM1及U6引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設計完成。DMEM培養(yǎng)基(D777)；SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒(QPK-201)于TOYOBO采購；X射線生物輻照儀購自Thermo；Trizol reagent(9009)采購自TaKaRa；Transwell小室采購自BD；MTT試劑盒購自碧云天；γH2AX、TGF、Smad抗體購自博泰恒通。蘇凈Airtech超凈工作臺；SANYO MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；5810R 型高速離心機；Roche R480實時熒光定量PCR儀。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

調(diào)整鼻咽癌細胞株SUNE-1細胞株濃度至1×106個/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的siPCGEM1和陰性對照轉(zhuǎn)染至細胞，以SUNE-1作為空白對照，得到SUNE-1-siPCGEM1及SUNE-1-NC細胞株。

1.4 qRT-PCR檢測Lnc RNA PCGEM1的表達

采用Trizol法提取各組細胞總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為：95℃預變性10 min，然后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40 個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。U6作為內(nèi)參(上游引物為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，Lnc RNA PCGEM1(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，miR-148a(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，miR-148a(上游引物為 5’-CCCAACCCTTGTAACTGTCT-3’，下游引物為5’-TCCGAGGTGTGCAGGG-3’)，相對表達量用2-△△CT表示。每個樣本獨立重復實驗3 次。

1.5 MTT實驗檢測細胞增殖

細胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1經(jīng)5 Gy電離輻射照射后，按照每孔500-1000 個密度鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光4 h 后，棄掉孔內(nèi)液體，再加DMSO各100 μl，置于37℃搖床上快速振蕩15 min，以便充分溶解結(jié)晶物，最后將96 孔板置于酶標儀上檢測 492 nm 處的OD值。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲

實驗前12 h更換為無血清培養(yǎng)基，細胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1經(jīng)10 Gy電離輻射照射后，將40 μl matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室中，消化細胞并用1x PBS清洗2遍，將500 μl 完全培養(yǎng)基加入24 孔板，細胞計數(shù)，取5×105細胞重懸，向Transwell小室中加200-250 μl 細胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡。置于培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng) 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1%結(jié)晶紫染液500 μl進行染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察顯穿過膜的細胞并拍照計數(shù)。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移

實驗前12 h更換為無血清培養(yǎng)基，細胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1經(jīng)10 Gy電離輻射照射后，調(diào)整細胞濃度，以5×104個/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，用10 μl sterile pipette 槍頭沿直線做劃痕，加入100 μl PBS將細胞碎片沖洗掉，然后無血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，分別于0 h和24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞運動情況以及劃痕寬度，計算細胞遷移的距離和細胞遷移率。

1.8 免疫熒光標記

細胞SUNE-1、SUNE-1-NC及SUNE-1-siPCGEM1經(jīng)10 Gy電離輻射照射后，分別于0 h、6 h進行免疫熒光檢測，將細胞貼附于載玻片上，PBS清洗后，4% 多聚甲醛固定室溫下固定 15 min，再經(jīng)0.1Triton X-100室溫通透細胞20 min，2%羊血清室溫封閉1 h，加入γH2AX一抗，4℃下孵育過夜，再加入二抗室溫孵育1 h，經(jīng)DAPI核染色后共聚焦顯微鏡拍照并記錄細胞中綠色γ-H2AX foci數(shù)量。

1.9 生物信息學預測

使用生物信息學網(wǎng)站starBase預測PCGEM1可互補結(jié)合的微小RNA(microRNA，miRNA)。

1.10 熒光素酶基因報告分析

通過miRBase數(shù)據(jù)庫獲得人的PCGEM1基因序列，以HNEC細胞基因組DNA為模板，采用PCR擴增PCGEM1的3′-非翻譯區(qū)序列，構(gòu)建至熒光素酶報告基因載體psi-CHECK中，記為野生型lncRNA PCGEM1-wild，同時構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒lncRNA PCGEM1-mutant。將HEK293T 細胞按30%左右密度鋪24 孔板，將miRNA-148a mimic及mimic control分別與空載質(zhì)粒、野生型lncRNA PCGEM1-wild及突變型lncRNA PCGEM1-mutant共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，分為空白組、野生組和突變組。轉(zhuǎn)染后24 h，根據(jù)雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Lnc RNA PCGEM1在不同組織中的表達

RTFQ-qPCR結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中 Lnc RNA PCGEM1的表達水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 Lnc RNA PCGEM1在不同組織中的表達

2.2 Lnc RNA PCGEM1表達與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關性

統(tǒng)計收集的80例鼻咽癌患者的臨床病理資料，分析臨床病理特征與lnc RNA PCGEM1表達的相關性，以所收集數(shù)據(jù)總體水平的70%作為lnc RNA PCGEM1高、低表達水平的分界線，結(jié)果顯示lnc RNA PCGEM1表達水平與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(P>0.05)，分化程度越低，臨床分期越晚，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者lnc RNA PCGEM1表達水平越高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Lnc RNA PCGEM1表達與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關性

2.3 細胞系構(gòu)建

qRT-PCR結(jié)果顯示SUNE-1組和SUNE-1-NC組Lnc RNA PCGEM1的表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SUNE-1-siPCGEM1組細胞中Lnc RNA PCGEM1的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，提示成功構(gòu)建 PCGEM1沉默細胞系，見圖2。

圖2 各細胞中Lnc RNA PCGEM1相對表達量

2.4 Lnc RNA PCGEM1對鼻咽癌細胞株SUNE-1輻射敏感性的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與SUNE-1組和SUNE-1-NC組相比，SUNE-1-siPCGEM1組經(jīng)電離輻照后OD492 nm值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明Lnc RNA PCGEM1被沉默后，能增強鼻咽癌細胞SUNE-1的輻照敏感性，見圖3。

圖3 MTT法檢測Lnc RNA PCGEM1對SUN-1放射敏感性的影響注：與SUNE-1比較， *P<0.05；與SUNE-1-NC比較， #P<0.05

2.5 Lnc RNA PCGEM1對電離輻照誘導的鼻咽癌細胞株SUNE-1侵襲能力的影響

Transwell實驗顯示，相比SUNE-1組和SUNE-1-NC組，電離輻照后，SUNE-1-siPCGEM1細胞通過matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果表明沉默Lnc RNA PCGEM1后，抑制鼻咽癌細胞電離輻射后的侵襲能力，見圖4。

圖4 Lnc RNA PCGEM1對電離輻射誘導SUNE-1侵襲能力的影響

2.6 Lnc RNA PCGEM1對電離輻照誘導的鼻咽癌細胞株SUNE-1遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果，相比SUNE-1組和SUNE-1-NC組，電離輻照后，SUNE-1-siPCGEM1組細胞遷移率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果表明沉默Lnc RNA PCGEM1后，抑制鼻咽癌細胞電離輻射后的遷移能力，見圖5。

圖5 Lnc RNA PCGEM1對電離輻射誘導SUNE-1遷移能力的影響

2.7 Lnc RNA PCGEM1對鼻咽癌細胞株SUNE-1電離輻射誘導DNA 損傷的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，相比SUNE-1組SUNE-1和SUNE-1-NC組，SUNE-1-siPCGEM1組細胞γH2AX的熒光強度更高，異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果表明沉默Lnc RNA PCGEM1后，抑制鼻咽癌細胞電離輻射后的DNA損傷的修復作用，見圖6。

圖6 Lnc RNA PCGEM1對電離輻射誘導的SUNE-1 DNA損傷的影響

2.8 Lnc RNA PCGEM1與miR-148a的作用關系

經(jīng)starbase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PCGEM1和miR-148a之間有互補結(jié)合序列，推測兩者可能具有靶向調(diào)控關系。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-148a后，野生型PCGEM1的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型PCGEM1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，說明PCGEM1和miR-148a具有靶向調(diào)控關系，見圖7A、7B。

圖7A Starbase數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果

圖7B 熒光素酶報告基因測定結(jié)果

2.9 miR-148a在不同細胞中的表達

qRT-PCR檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾細胞系和空白細胞對照中miR-148a結(jié)果表明，相比SUNE-1組和SUNE-1-N組lnc RNA PCGEM1被沉默后，miR-148a表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，證實lnc RNA PCGEM1可以特異性結(jié)合miR-148a并發(fā)揮負向調(diào)控作用，見圖8。

圖8 不同細胞中miR-148a相對表達量

3 討論

目前關于Lnc RNA在腫瘤中的作用僅有一小部分被透徹研究，有些Lnc RNA在腫瘤中的表達異常改變，功能類似于癌基因或抑癌基因[6]，可通過參與調(diào)控細胞周期，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。目前，尚無標志性Lnc RNA可以直接預測BUCC，但Lnc RNA PCGEM1在前列腺癌中特異性表達已由Srikantan等證實，該基因位于染色體2q32位點上[7]。Zhang等人[8]采用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PCGEM1在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。另有研究表明[9]在胰腺癌患者癌組織和血清中，Lnc RNA PCGEM1的表達量上升。有學者稱[10]，Lnc RNA PCGEM1在鼻咽癌中表達水平明顯升高。本研究采用RT-PCR檢測其在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌組織中表達水平明顯高于正常組織，與上述研究結(jié)果相符。統(tǒng)計分析lnc RNA PCGEM1表達與患者臨床病理特征的相關性發(fā)現(xiàn)，分化程度越低，臨床分期越晚，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者lnc RNA PCGEM1表達水平越高，推測lnc RNA PCGEM1可能是癌分子。

研究表明[11]，胰腺癌細胞中沉默Lnc RNA PCGEM1可促進 CDK1激酶與 EZH2 結(jié)合，使EZH2的蘇氨酸Thr-345和Thr-487處磷酸化增加，最終導致EZH2的泛素化降解。Peng等[12]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Lnc RNA PCGEM1表達可抑制結(jié)直腸癌的侵襲及遷移。據(jù)報道[13]，在輻射誘導的癌細胞模型中，Lnc RNA PCGEM1的表達水平出現(xiàn)異常升高，提示Lnc RNA PCGEM1的表達與癌細胞經(jīng)電離輻射后的應激反應有關。本研究結(jié)果顯示，電離輻射照射后，沉默Lnc RNA PCGEM1的鼻咽癌細胞株SUNE-1增殖和遷移能力明顯受到抑制，提示沉默Lnc RNA PCGEM1能夠增強鼻咽癌輻射敏感性。電離輻射可引起腫瘤細胞DNA雙鏈斷裂，不能修復的DNA損傷會介導細胞凋亡而被清除，γH2AX作為DNA雙鏈斷裂的標志物，可有效反映DNA損傷程度[14]。本研究結(jié)果中，沉默Lnc RNA PCGEM1后腫瘤細胞γH2AX表達明顯高于對照組，提示抑制Lnc RNA PCGEM1的表達可加劇DNA損傷或降低DNA損傷的修復能力。以上結(jié)果表明，Lnc RNA PCGEM1在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，有望作為該病的治療及預后的標志因子。

微小RNA(MicroRNA，miRNA) 是存在于真核生物中一類長度為18-25nt的非編碼單鏈小分子RNA，其作用機理主要是直接結(jié)合在特定的靶信使RNA的3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)，促使靶RNA發(fā)生降解或者翻譯被抑制，從而調(diào)控目的基因的表達[15]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，種類繁多的miRNA家族成員與人類多種疾病及腫瘤的發(fā)展密切相關[16]。miR-148a基因位于人類染色體的12q22n上，相關研究證實，miR-148a對前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌及宮頸癌均發(fā)揮抑制作用，但在肝癌中促進細胞增殖及轉(zhuǎn)移進而起到促癌作用，在淋巴細胞白血病中，miR-148a表達異常且參與細胞增殖及遷移[17]。Lnc RNA PCGEM1調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否有miR-148a參與鮮有報道。lnc RNA對不同細胞具有多向調(diào)節(jié)功能，因而在諸多人類疾病中發(fā)揮重要作用，有研究證實了mRNA和lnc RNA之間一種新的調(diào)控機制，即兩者的相互影響跟它們競爭共同的miRNA反應元件有關，此時lnc RNA可能發(fā)揮了競爭性內(nèi)源性RNA的作用，對miRNA進行吸附并調(diào)控其靶標，從而使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平進一步增加[18]。本研究同時采用starbase數(shù)據(jù)庫對Lnc RNA PCGEM1的靶基因進行預測，分析發(fā)現(xiàn)Lnc RNA PCGEM1和 miR-148a之間存在一定的結(jié)合位點，由此推測miR-148a可作為Lnc RNA PCGEM1的下游靶基因。此外采用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-148a與全Lnc RNA PCGEM1轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)兩者能形成一定的互補堿基對，進一步證實了兩者的靶向關系。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞中沉默Lnc RNA PCGEM1后，miR-148a表達水平顯著上調(diào)，證實Lnc RNA PCGEM1對miR-148a發(fā)揮負向調(diào)控作用。以上結(jié)果表明，在鼻咽癌中Lnc RNA PCGEM1可能通過特異性結(jié)合并抑制miR-148a的表達進而增加鼻咽癌細胞輻射敏感性。

綜上，Lnc RNA PCGEM1在鼻咽癌中呈高表達，與分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移相關。沉默Lnc RNA PCGEM1表達可能通過上調(diào)miR-148a水平增加鼻咽癌細胞輻射敏感性，從而抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲能力，但具體機制有待進一步研究。