劉穎男，吳曉冬，徐嘉鴻，張玉成*,王 華

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.科學(xué)研究中心;b.藥劑科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.長(zhǎng)春市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

鹿茸系鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿尚未骨化的幼角，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、無(wú)機(jī)元素、生物胺、核苷及多種無(wú)機(jī)物質(zhì)[1]。其中蛋白質(zhì)含量豐富，是鹿茸的主要功能成分之一[2]，我國(guó)對(duì)鹿茸的研究主要集中在對(duì)其粗提物，如乙醇萃取物[3]等的功能性評(píng)價(jià)。然而，研究表明鹿茸中蛋白質(zhì)經(jīng)酶解可產(chǎn)生生物活性肽，具有抗氧化[4]、抗骨質(zhì)疏松[5,6]、促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]等多種生物活性。體外實(shí)驗(yàn)中，通常采用骨肉瘤來(lái)源的成骨樣細(xì)胞作為藥物促進(jìn)成骨細(xì)胞形成功能的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8]，本研究采用人成骨肉瘤細(xì)胞的OS-732成骨樣細(xì)胞作為細(xì)胞模型，乙醇萃取梅花鹿茸有效成分后的殘?jiān)鼮樵?通過酶解鹿茸殘?jiān)蛛x純化出分子量為500-700Da的活性鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A、VAP-Ⅱ-B)混合組分[9]，研究其對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)增殖活力、細(xì)胞周期、相關(guān)mRNA含量的影響，旨在揭示鹿茸多肽促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖能力,并為探討其作用機(jī)理和開發(fā)治療骨質(zhì)疏松癥的鹿茸寡肽藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料人成骨肉瘤細(xì)胞OS-732選購(gòu)自北京積水潭醫(yī)院；胎牛血清、 胰蛋白酶、 IMDM、 MTT均購(gòu)自Sigma公司； 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、 SB203580(p38 MAPK)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所； Real Time PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司； BMP、CyclinD-1購(gòu)自華大中天生物；總RNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物(上海)有限公司。

1.2 引物合成合成BMP-2、cyclin D1擴(kuò)增引物， 進(jìn)行 SYBR Green I 的嵌合熒光法Real Time PCR反應(yīng)。 BMP 2引物： 5′-CGTGCTTCTTAGACGGACTG， 3′-TGACCTGAGTGCCTGCGATA；Cyclin D-1引物：5′-ACGAAGGTCTGCGCGTGTT，3′CCGCTGGCCATGAACTACCT； 內(nèi)參GAPDH： 5′TGCACCACCAACTGCTTAGC， 3′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG。 通過和內(nèi)參GAPDH比較， 確定樣品中目的基因的mRNA水平。

1.3 鹿茸多肽對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)的增殖作用MTT檢驗(yàn)以6×103/孔細(xì)胞接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。加入含鹿茸多肽提取物培養(yǎng)基(0、 100、 200 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)1-7天， 提前4 h加入MTT溶液20 μl， 加入100 μl DMSO， 振蕩使結(jié)晶物充分溶解。 490 nm條件下， 利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值， 記錄結(jié)果。 SPSS統(tǒng)計(jì)法分析出最佳鹿茸多肽濃度。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè)應(yīng)用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組和加入鹿茸多肽(0、 100、 200 μg/mL)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)組分別加入約1 ml預(yù)冷的PBS溶液重懸細(xì)胞， 70%預(yù)冷乙醇， 混勻后4℃ 固定12-24 h。每管細(xì)胞樣品中加入0.5 ml碘化丙啶染色液， 37℃避光溫浴30 min。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光， 激發(fā)波長(zhǎng)488 nm。

1.5 堿性磷酸酶(ALP)活性的檢測(cè)成骨細(xì)胞中分泌ALP水平與成骨細(xì)胞的活性有較好的相關(guān)性,可以作為骨形成的有效指標(biāo)[10]。 以人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)4×104/孔于6孔板中，加入含鹿茸多肽(最佳作用濃度)培養(yǎng)液于37 ℃， 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。固定后 37 ℃、 5% CO2繼續(xù)孵育4 h。2%硝酸鈷浸泡5 min， 1% 硫化銨浸泡2 min。 蒸餾水沖洗， 晾干。 在顯微鏡下觀察細(xì)胞制片的染色情況。

1.6 p38 MAPK對(duì)OS-732細(xì)胞的影響依照MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法檢測(cè)抑制劑對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)增殖的影響。 加入含有鹿茸多肽(最佳作用濃度)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞； 加入抑制劑組細(xì)胞提前20 min加入抑制劑后再加入含鹿茸多肽培養(yǎng)基。 設(shè)置不加入抑制劑與鹿茸多肽的對(duì)照組。

1.7 Real Time PCR檢測(cè)OS-732細(xì)胞中BMPmRNA的相對(duì)含量加入含鹿茸多肽(最佳作用濃度)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞， 設(shè)置對(duì)照組。 UNIQ-10柱式Trizol總RNA的提取， 采用Quant cDNA第一鏈合成試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄。 通過與內(nèi)參GAPDH比較， 確定樣品中目的基因的mRNA水平。 Stage 1： 預(yù)變性95 ℃， 30 s； Stage 2： PCR反應(yīng) 95 ℃， 3 s，60 ℃，30 s循環(huán)40次； Melt Stage:95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的生理活性將胎牛血清加入到IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)作為對(duì)照， 貼壁生長(zhǎng)后的細(xì)胞形態(tài)如圖 1A 所示。加入酶解鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)組分培養(yǎng)的細(xì)胞(圖 1B)形態(tài)無(wú)明顯變化， 2天后細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng)，細(xì)胞體積增大，胞漿豐富，3-4天后細(xì)胞融合。

圖1 人成骨肉瘤細(xì)胞OS-732形態(tài)(200×)對(duì)照組 (A);鹿茸多肽VAP-Ⅱ-A(200 mg/L) (B)

2.2 鹿茸多肽對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響VAP-Ⅱ-A(200 μg∕mL)與對(duì)照組相比增殖作用更明顯(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 如表1所示。

表1 鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-B)對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

2．3 鹿茸多肽對(duì)細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)方法分析結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組細(xì)胞(圖2A)比較， 加入鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)(圖2B)能夠明顯的促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)的周期轉(zhuǎn)化， 細(xì)胞周期S+G2期細(xì)胞指數(shù)明顯提高， 表現(xiàn)為S期的DNA含量明顯上升， 說明鹿茸多肽對(duì)細(xì)胞有明顯的增殖作用。

圖2 鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)對(duì)細(xì)胞周期的影響對(duì)照組 (A);鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A，200 mg/L) (B)

2.4 細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)采用改良鈣-鈷法檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性， 顯微鏡下40×結(jié)果如圖3。 與空白對(duì)照組灰色相比， 加入鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)組人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732，200 μg/mL)呈黑灰色， 分布密集， 活性明顯高于空白對(duì)照組， 這表明鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)能夠促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)合成ALP,促進(jìn)其向成骨特征方向分化。

圖3 鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)對(duì)成骨肉瘤細(xì)胞ALP活性的影響Control group (40×) (A);VAP-Ⅱ-A:200 μg/mL( 40×) (B)

2.5 p38 MAPK對(duì)細(xì)胞增殖的影響鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)能夠明顯促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)的增殖。 提前加入阻斷劑p38 MAPK 阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后， 再加入鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)組與對(duì)照組比較仍然能夠明顯提高S+G2期在細(xì)胞周期中所占比例，促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)。 而加入抑制劑組與加入鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)組比較， 細(xì)胞增殖活力(如表2，P<0.01)及周期轉(zhuǎn)化無(wú)明顯差異(如圖4)。 即阻斷劑p38 MAPK對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)增殖無(wú)影響。

圖4 細(xì)胞抑制劑對(duì)OS-732細(xì)胞的影響對(duì)照組 (A);加入鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A ，200 μg/mL) (B);加入 p38 MAPK(C)

表2 鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)對(duì)人成骨肉瘤細(xì)胞的增殖作用

2.6 人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)中BMP、CyclinD-1基因的mRNA相對(duì)含量差異應(yīng)用Real-Time PCR

方法檢測(cè)得到融解曲線及擴(kuò)增曲線。 與空白對(duì)照組比較， 加入鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)組的人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)中BMP、(Cyclin)D1和內(nèi)參(GAPDH)均有mRNA相對(duì)含量的差異， 其中BMPmRNA相對(duì)含量提高7倍(表3，P<0.01)， 這與鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)能夠促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)的分化與增殖緊密相關(guān)。

表3 Real-Time PCR 檢測(cè)OS-732細(xì)胞BMPmRNA表達(dá)

3 討論

本研究首先采集乙醇萃取新鮮梅花鹿鹿茸的活性成分后的殘?jiān)?，通過酶解法得到活性鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)， 分子量為500-700Da。 研究表明酶解鹿茸殘?jiān)械牡鞍踪|(zhì)含量為乙醇萃取物的5倍。 另外， 酶解鹿茸多肽混合物成分中的多種氨基酸組分中甘氨酸(Gly)和谷氨酸(Glu)含量較高。 酶解法得到的鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)能夠使OS-732細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)增加。 同時(shí)， 細(xì)胞生長(zhǎng)周期表現(xiàn)為G2+S期所占比例明顯較G1期所占比例提高。 本文通過加入細(xì)胞通路抑制劑(P38 MAPK)作為對(duì)照， 證實(shí)了細(xì)胞通路抑制劑對(duì)鹿茸多肽促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)的增殖作用沒有明顯影響。 鹿茸多肽(VAP-Ⅱ-A)作用后細(xì)胞中的BMP及Cyclind-1mRNA相對(duì)含量比對(duì)照組顯著提高， 進(jìn)一步證實(shí)了鹿茸多肽促進(jìn)人成骨肉瘤細(xì)胞(OS-732)增殖作用的可能機(jī)理。 本研究對(duì)鹿茸在臨床上促進(jìn)骨質(zhì)生長(zhǎng)、 治療骨質(zhì)疏松等作用的深入研究以及篩選具有防治骨質(zhì)疏松的活性鹿茸因子等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。