李霞　陳曉水　黃藝偉　楊君　溫寶英　周國俊　李劍鋒

摘 要 基于表面增強拉曼光譜（SERS）可在低濃度待測物質(zhì)甚至是單分子水平上獲得高靈敏度結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)勢，本研究提出并建立了一種結(jié)合便攜式拉曼光譜儀，利用SERS實現(xiàn)原煙中廣譜殺菌劑三唑醇和三唑酮殘留同時快速檢測的方法。采用酸性條件下的聚酰胺作為凈化劑，以除去煙草中色素、酚類、有機酸類等的干擾影響，以納米金溶膠作為SERS基底，通過三唑醇或三唑酮在金溶膠表面的吸附放大拉曼信號，實現(xiàn)高靈敏檢測。結(jié)果表明，原煙中三唑醇、三唑酮殘留量的檢測靈敏度為1 mg/kg，檢測時間為8～12 min。本研究建立的SERS檢測方法操作簡便、成本低、快速、準確，適用于煙草中三唑醇和三唑酮農(nóng)藥殘留的快速檢測。

關(guān)鍵詞 表面增強拉曼光譜; 煙草; 農(nóng)藥殘留; 三唑醇; 三唑酮; 聚酰胺; 快速檢測

1 引 言

三唑酮是一種高效、低毒、內(nèi)吸性強的廣譜三唑類殺菌劑，主要用于防治植物真菌病毒如銹病、白粉病等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用非常廣泛，登記作物包括煙草、小麥、水稻、玉米、花生、番茄、蘋果樹等。三唑醇為三唑酮的代謝產(chǎn)物，其殺菌活性高于三唑酮，已被作為單獨藥劑在多種作物上登記使用。研究表明，三唑酮及三唑醇會產(chǎn)生神經(jīng)、生殖和基因毒性，并具有致癌和致畸效應(yīng)[1，2]。為保證兩種農(nóng)藥的科學合理使用，很多國家已明確限定了三唑酮和三唑醇在食品及農(nóng)作物中的最高殘留限量，中國煙草總公司發(fā)布了其在煙葉中的最大殘留限量標準[3]。因此，對三唑酮和三唑醇殘留量的快速檢測具有重要意義。

目前，煙草及煙草制品中三唑酮和三唑醇的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[4]、高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS） [5，6]及酶聯(lián)免疫分析法（ELISA） [7]等。色譜法具有準確性好、靈敏度高、可同時測定多種農(nóng)藥殘留等優(yōu)勢，但所需儀器設(shè)備昂貴，且樣品前處理復雜、檢測時間長，不適用于大批量樣品的快速篩查。酶聯(lián)免疫分析法相對于傳統(tǒng)儀器分析技術(shù)具有快速、簡便等優(yōu)勢，但在獲得高效價和高特異性的抗體，以及提高方法檢測靈敏度方面，仍有待進一步改進和提高。

表面增強拉曼光譜技術(shù)（SERS）是一種非常有效的探測分子間相互作用、表征表面分子吸附行為和分子結(jié)構(gòu)的工具，具有檢測靈敏度高、樣品前處理簡單、分析速度快、檢測成本低、可實現(xiàn)實時原位檢測等優(yōu)點，已被用于食品和農(nóng)產(chǎn)品中食用添加劑、農(nóng)藥殘留等的快速檢測[8～10]。Shende等[11]利用固相萃取結(jié)合SERS技術(shù)，檢測橙汁中甲基毒死蜱，最低檢出濃度可達到50 μg/kg。黃雙根等[12]采用SERS結(jié)合化學計量學的方法， 對小白菜中單一農(nóng)藥西維因進行快速定量檢測，最低檢測濃度低于0.976mg/L。Li等[13]應(yīng)用SERS技術(shù)檢測蘋果表皮中的甲拌磷和倍硫磷，甲拌磷的檢測限為0.05 mg/L，倍硫磷的檢測限為0.4 mg/L。近年來，有關(guān)SERS檢測農(nóng)藥的相關(guān)研究報道日趨增多，如朱曉宇等[14]利用SERS技術(shù)對綠茶中毒死蜱農(nóng)藥殘留進行了定量檢測，相關(guān)性可以達到0.9863，檢測限可達0.56 mg/kg，同時單個樣本的檢測可在15 min內(nèi)完成; 楊永安等[15]利用SERS技術(shù)對菜籽油中樂果農(nóng)藥殘留進行了檢測，檢測限可達到0.1 mg/kg。上述研究結(jié)果表明，SERS技術(shù)在農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測方面顯出了良好的應(yīng)用價值。

然而，由于煙草實際樣品復雜，前處理困難且時間長，因此SERS技術(shù)在煙草農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用難度較大，利用SERS技術(shù)檢測煙草中的農(nóng)藥殘留的文獻報道很少。此外，在生物體內(nèi)，三唑酮分子中的羰基極易被還原成羥基，生成三唑醇[16]。因此，同時對三唑酮和三唑醇進行檢測顯得尤為重要。目前，大部分農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的SERS檢測報道均為單標檢測，同時對兩種或者兩種以上的農(nóng)藥殘留直接檢測的研究未見報道。

基于此，本研究發(fā)展了一種結(jié)合前處理技術(shù)，使用便攜式拉曼光譜儀對原煙樣品中的三唑醇和三唑酮進行快速檢測的方法。首先，建立一種快速簡便的提取原煙中三唑醇和三唑酮的方法，采用納米金溶膠作為SERS基底，使三唑醇或三唑酮農(nóng)藥吸附于金溶膠表面，從而實現(xiàn)其拉曼信號的放大，最終實現(xiàn)三唑醇與三唑酮的高靈敏同時檢測，整個檢測在10 min內(nèi)完成。本方法具有靈敏度高、耗時短、操作簡便等優(yōu)點，為煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留的快速檢測提供了新思路。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SPEC-VKR785便攜式拉曼光譜儀（廈門斯貝克科技有限責任公司，激發(fā)光波長785 nm，最大激光功率為500 mW）; smart-N系列超純水儀（上海力康國際貿(mào)易有限公司，）; H2500R高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）; XH-C漩渦振蕩器（江蘇天翊儀器有限公司）。

三唑醇（96%，異構(gòu)體混合物）、三唑酮（99.8%）、聚酰胺（100～200目）購于阿拉丁化學試劑有限公司; 石油醚（分析純）、Na2SO4（分析純）購于國藥集團化學試劑公司; 納米金表面增強試劑購于廈門賽納斯科技有限公司。

2.2 三唑醇和三唑酮標準品的拉曼光譜采集

分別將標準品三唑醇、三唑酮固體粉末置于干凈的載玻片上，壓平，于便攜式拉曼光譜儀上進行拉曼光譜采集。

分別配制不同濃度的三唑醇、三唑酮標準溶液（1、0.1、0.05和0.01 mg/L）。取200 μL標準液，加入50 μL團聚劑（1 mol/L Na2SO4-HCl（4∶1， V/V））和200 μL納米金表面增強試劑，在785 nm激發(fā)光、激光功率500 mW、掃描時間10 s的條件下，采用便攜式拉曼光譜儀采集拉曼光譜。

2.3 原煙樣品的前處理

準確稱取磨粉后的原煙樣品（浙江中煙工業(yè)有限責任公司提供）1 g，加入10 mL水浸潤，再加入8 mL石油醚，漩渦振蕩，離心后，取上層液，依次加入凈化劑0.2 g聚酰胺和100 μL HCl（1 mol/L），振蕩，離心，收集有機層，吹干，加入500 μL水復溶，得到待測樣品液。

2.4 待測樣品液的SERS檢測

取200 μL待測樣品液于樣品管中，加入50 μL團聚劑、200 μL納米金表面增強試劑，混合均勻，在激發(fā)光源785 nm、功率500 mW、掃描時間10 s條件下，測定拉曼圖譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 三唑醇和三唑酮標準品的SERS分析

三唑醇和三唑酮標準品的拉曼光譜及其水溶液的SERS譜圖如圖1所示，在三唑醇的SERS譜中， 觀察到536、632、745、862、983、1012、1091和1221 cm-1處的SERS峰。根據(jù)三唑醇的分子結(jié)構(gòu)和拉曼峰位歸屬以及文獻[17]報道可知，在745 cm-1 處的拉曼信號可歸屬于CO鍵的伸縮振動，在862 cm-1的峰為CNN和苯環(huán)的彎曲振動，在1091 cm-1處的拉曼峰可歸屬于三唑醇分子中六元環(huán)的平面內(nèi)呼吸振動和CCl 鍵的伸縮振動。因此，在536、745、862和1091 cm-1處的特征峰可作為SERS光譜檢測三唑醇的判別依據(jù)。

類似的，三唑酮的SERS峰出現(xiàn)在589、641、830、987、1091和1221 cm-1處。其中，在589 cm-1 處的拉曼信號可歸屬于五元環(huán)的平面內(nèi)呼吸振動，在641 cm-1處的拉曼信號可歸屬于五元環(huán)的變形振動，在830 cm-1 處的拉曼信號可歸屬于六元環(huán)的呼吸作用，信號最強的1091cm-1峰可歸屬于三唑酮分子中CCl 鍵伸縮振動和六元環(huán)的平面內(nèi)呼吸振動。由于分子內(nèi)振動產(chǎn)生的分子極性變化較大，導致極化率變化明顯，信號較強[18，19]。因此，在589、641、830和1091 cm-1處的特征峰可作為SERS光譜檢測三唑酮的判別依據(jù)。

對比三唑醇和三唑酮SERS譜圖時，發(fā)現(xiàn)部分拉曼特征峰的出峰位置重疊，如987、1091、1221和1590 cm-1，這是由于三唑醇和三唑酮結(jié)構(gòu)十分相似，分子內(nèi)化學鍵的振動方式也類似，因此，其所反映出的拉曼光譜峰位置也十分接近。但是，羥基和羰基的極性不同，靠近這兩個官能團的化學鍵的振動能量不同，拉曼信號存在差別，如三唑醇在536 和862 cm-1的拉曼信號、三唑酮在589、641和830 cm-1的拉曼信號。因此，可以通過這些拉曼特征峰區(qū)分三唑醇與三唑酮。

由三唑醇和三唑酮系列標準溶液的SERS光譜（圖2）可進一步觀察到，三唑醇和三唑酮的SERS譜中特征峰強度隨標準溶液濃度（1、0.5、0.1、0.05和0.01 mg/L）而變化，且均在濃度低至0.05 mg/L時仍有明顯的拉曼譜峰。上述結(jié)果表明，本方法對三唑醇、三唑酮標準溶液的檢出濃度均可低至0.05 mg/L。

3.2 原煙樣品中三唑醇和三唑酮的檢測

受煙葉中色素、酚類、有機酸類等雜質(zhì)的干擾，農(nóng)藥分子的拉曼信號被削弱，本研究采用酸性條件下的聚酰胺對原煙樣品的提取液進行凈化處理[20]，以去除雜質(zhì)的干擾，并通過納米金溶膠作為SERS基底進行檢測。以磨粉后的原煙空白樣品為對照，分別向其中添加農(nóng)藥標準品至濃度為0、 0.5、 1、 2、 3、 4和5 mg/kg，自然晾干后，進行樣品前處理，并進行SERS檢測，分別得到原煙樣品中三唑醇和三唑酮的SERS光譜（圖3A和圖3B）。由于原煙樣品成分復雜，提取農(nóng)藥的同時，也有其它物質(zhì)被提取出來，導致原煙空白在994和1031 cm-1出現(xiàn)特征峰，但并未對到三唑醇和三唑酮特征峰產(chǎn)生干擾。由圖3A可知，三唑醇的濃度為1 mg/kg時，745和1091 cm-1的特征峰仍能明顯識別，當濃度低至0.5 mg/kg時，所得的SRES光譜與原煙空白的相似。實驗結(jié)果表明，此檢測方法對原煙中三唑醇農(nóng)藥殘留的檢出限低于1 mg/kg，重現(xiàn)較好，檢出率>90%。

由圖3B可知，三唑酮的濃度為1 mg/kg時，589、641、830和1091 cm-1處的特征峰較弱，但仍能明顯識別，當濃度低至0.5 mg/kg時，所得的SRES光譜與原煙空白譜圖的相似。實驗結(jié)果表明，本方法對原煙中三唑酮農(nóng)藥殘留的檢出限低于1 mg/kg，方法重現(xiàn)性良好。本方法檢測三唑醇和三唑酮的檢出限均低于標準[3]規(guī)定的最大限量值（5 mg/kg）。

在植物體內(nèi)，三唑酮分子中的羰基易被還原成羥基，生成三唑醇[16]。在原煙農(nóng)藥殘留的實際檢測過程中，三唑醇與三唑酮通常不是以單一農(nóng)藥的形式存在于煙葉中。

因此，進一步考察了原煙中三唑醇與三唑酮同時存在時對檢測的影響，實驗結(jié)果如圖4所示。分別在原煙中同時加入不同濃度的三唑醇與三唑酮，采用相同的處理方法對此煙葉樣品進行檢測，由圖4的SERS譜圖可知，當原煙樣品中的三唑酮濃度比三唑醇濃度小時，三唑酮（589、641、830和1091 cm-1）和三唑醇（745和1091 cm-1）的特征峰都能明顯觀察到; 反之，當三唑酮的濃度比三唑醇濃度大時，兩者之間的特征峰也互不干擾。由此可見，三唑醇和三唑酮二者拉曼譜峰互不干擾，可以實現(xiàn)對三唑醇和三唑酮的同時檢測。

4 結(jié) 論

發(fā)展了一種使用便攜式拉曼光譜儀，結(jié)合SERS技術(shù)同時快速檢測原煙中三唑醇和三唑酮的方法。采用酸性條件下的聚酰胺作為凈化劑，以除去煙草中色素、酚類、有機酸類等雜質(zhì)的干擾影響，再通過納米金溶膠作為SERS基底，使三唑醇或三唑酮農(nóng)藥吸附于金溶膠表面，從而實現(xiàn)其拉曼信號的放大與靈敏檢測。煙葉中三唑醇、三唑酮殘留量的檢測靈敏度為1 mg/kg，檢測時間為8～12 min。本研究為煙草中三唑醇和三唑酮的同時快速檢測提供了一種新方法。

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Simultaneous Determination of Triadimenol and Triadimefon

in Raw Tobacco by Surface-enhanced Raman Spectroscopy

LI Xia1， CHEN Xiao-Shui1， HUANG Yi-Wei2， YANG Jun1， WEN Bao-Ying2，

ZHOU Guo-Jun1， LI Jian-Feng2

1（China Tobacco Zhejiang Industrial Co. Ltd.， Hangzhou 310008， China）

2（College of Chemistry and Chemical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005， China）

Abstract Surface-enhanced Raman spectroscopy （SERS） can obtain highly sensitive structural information of substances with ultralow concentration or even at the single-molecule level. Herein， a rapid detection method for triadimenol and triadimefon in raw tobacco was established using SERS combined with portable Raman spectrometer. In this method， polyamide under acidic conditions was used as a purifying agent to remove the interference from pigments， phenols， organic acids and other impurities in tobacco. Gold-based SERS substrates were used to amplify the Raman signals through the adsorption of triadimenol and triadimefon on the surface of gold nanoparticles. It was found that the detection sensitivity of triadimenol and triadimefon residues in raw tobacco was 1 mg/kg， and the time needed was 8-12 min. This method was simple， low-cost， and accurate， thus was suitable for the rapid detection of triadimenol and triadimefon pesticide residues in tobacco.

Keywords Surface-enhanced Raman spectroscopy; Tobacco; Pesticide residues; Triadimenol; Triadimefon; Polyamide; Rapid detection

（Received 4 August 2020; accepted 8 September 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21925404， 21775127） and the Project of China Tobacco Zhejiang Co. Ltd. （No. ZJZY2019C005）.

2020-08-04收稿; 2020-09-08接受

本文系國家自然科學基金項目（Nos. 21925404、21775127）和浙江中煙工業(yè)有限責任公司科技項目（No. ZJZY2019C005）資助

*E-mail： zhougj@zjtobacco.com; Li@xmu.edu.cn