宋化穩(wěn)，徐娜娜，高德良，胡尊紀(jì)，莊治國，劉 鈺，吳希寶，莊占興

（山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東省化學(xué)農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250033）

桃褐腐病又名菌核病、果腐病、實(shí)腐病，是由鏈核盤菌（Monilinia spp.）引起的一種重要病害，世界產(chǎn)桃區(qū)均可發(fā)生[1]。花期危害造成花腐、僵果和枝條潰瘍，果實(shí)成熟期危害導(dǎo)致采摘前后和儲(chǔ)存期爛果[2]，嚴(yán)重威脅桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。造成桃褐腐病的病原菌有3種，分別為M. fructicola、M. fructigena和M.laxa。無性態(tài)為叢梗孢屬真菌Monilia spp.，我國大部分地區(qū)以M. fructicola為主要病原菌[1]。鏈核盤菌（Monilinia spp.）不僅危害桃，還危害蘋果、梨、李、梅、櫻桃、山楂等仁果和核果果樹，同時(shí)對(duì)薔薇科作物也可造成危害[3]。

化學(xué)防治仍然是防治桃褐腐病的主要方法。作為世界第一產(chǎn)桃大國[4]，目前我國登記在桃褐腐病上的農(nóng)藥僅有腈苯唑和小檗堿鹽酸鹽2個(gè)品種。因此，篩選對(duì)桃褐腐病菌高效低毒的殺菌劑品種，在生產(chǎn)中進(jìn)行混配和輪換用藥，對(duì)桃褐腐病的科學(xué)防控具有重要意義。

前人已多次測定過殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌的室內(nèi)毒力[5-18]，但所涉及的殺菌劑品種都不夠系統(tǒng)全面，測定方法除房雅麗等[6]采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法外，其余均采用菌絲生長速率法，未見用孢子萌發(fā)法進(jìn)行系統(tǒng)測定的報(bào)道，更沒有對(duì)2種方法測定數(shù)據(jù)進(jìn)行比較的研究，缺乏對(duì)各類殺菌劑作用特點(diǎn)的全面系統(tǒng)評(píng)價(jià)。本研究分別采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法測定了8類16種殺菌劑對(duì)山東省肥城地區(qū)桃褐腐病菌的室內(nèi)毒力，以期為桃褐腐病的化學(xué)防治進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：桃褐腐病菌，于2019年8月1日采自山東省肥城地區(qū)桃園鎮(zhèn)北臺(tái)村桃園。該地種植肥城桃歷史悠久，桃褐腐病歷年發(fā)生嚴(yán)重，桃園使用苯并咪唑類和保護(hù)性殺菌劑頻率較高。將桃褐腐病病果帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單孢分離，用PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，形態(tài)學(xué)鑒定為美澳型核果鏈核盤菌（Monilinia fructicola）。

供試藥劑概況見表1。

表1 供試藥劑概況

1.2 方法

1.2.1 含藥PDA培養(yǎng)基制備

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，用無菌水將16種試驗(yàn)藥劑分別稀釋成5～8個(gè)梯度濃度，分別取3 mL稀釋液加入裝有約25 mL，50℃左右的滅菌PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，定容至30 mL，搖勻后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后即制成含藥平板培養(yǎng)基。空白對(duì)照為無菌水。

1.2.2 含藥WA培養(yǎng)基制備

根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，將16種試驗(yàn)藥劑分別稀釋成5～8個(gè)梯度濃度，分別取3 mL稀釋液加入裝有約25 mL滅菌WA培養(yǎng)基的三角瓶中，定容至30 mL，搖勻后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后即制成含藥平板培養(yǎng)基?？瞻讓?duì)照為無菌水。

1.2.3 菌絲生長速率法

在無菌條件下，用直徑5 mm打孔器在分離培養(yǎng)5 d的桃褐腐病菌的菌落邊緣挑取菌餅，將菌餅置于含藥平板培養(yǎng)基中央，每處理重復(fù)4次，以不加藥劑的PDA平板作為空白對(duì)照。置于25℃，12 h光暗交替條件下培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算各處理菌落增長直徑及菌絲生長抑菌率。菌絲生長抑制率按式（1）計(jì)算。

1.2.4 孢子萌發(fā)法

將桃褐腐病菌在PDA平板上，于25℃，12 h光暗交替條件下培養(yǎng)7 d，用無菌去離子水洗分生孢子，用滅菌紗布過濾，充分震蕩搖勻制得孢子懸浮液。然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)觀察，將孢子懸浮液濃度調(diào)至105～106孢子/mL。

量取100 μL孢子懸浮液均勻涂布于含藥WA培養(yǎng)基平板上，于25℃，10 h光暗交替條件下培養(yǎng)20 h。然后鏡檢觀察孢子萌發(fā)情況，調(diào)換顯微鏡視野，每重復(fù)檢查孢子總數(shù)不少于200個(gè)，記錄檢查孢子總數(shù)及孢子萌發(fā)數(shù)，以芽管長度達(dá)到孢子短直徑的1/2視為萌發(fā)。每處理重復(fù)4次，以不含藥劑處理為空白對(duì)照。孢子萌發(fā)率和萌發(fā)抑制率分別按式（2）、（3）計(jì)算。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以設(shè)定的質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（x），抑制率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)（y），求出各藥劑對(duì)供試菌株的毒力回歸方程y=a+bx及有效抑制中濃度（EC50值）。

為了更直觀地比較各個(gè)藥劑的EC50值，將每種方法測定的16種藥劑中最大EC50值的藥劑的相對(duì)毒力倍數(shù)設(shè)定為1.00，計(jì)算出各個(gè)藥劑的相對(duì)毒力倍數(shù)。相對(duì)毒力倍數(shù)按式（4）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 16種殺菌劑對(duì)菌絲生長的抑制作用

16種殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌菌絲生長的抑制作用測定結(jié)果見表2。

表2 16 種殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌菌絲生長的抑制作用測定結(jié)果

由表2可見，16種殺菌劑抑制菌絲生長的EC50值介于0.018 4～61.530 5 mg/L，其中咪鮮胺、四霉素、腈苯唑和咯菌腈4種殺菌劑對(duì)菌絲生長的抑制活性較強(qiáng)，其EC50值分別為0.018 4、0.045 6、0.053 1和0.081 4 mg/L，均顯著小于0.1 mg/L，而代森錳鋅、百菌清、嘧菌酯和吡唑醚菌酯4種殺菌劑對(duì)菌絲生長的抑制活性較低，其EC50值分別為61.530 5、29.732 1、25.532 6和17.501 0 mg/L，均顯著大于10 mg/L。

2.2 16種殺菌劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用

16種殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌孢子萌發(fā)的抑制作用測定結(jié)果見表3。由表3可見，16種殺菌劑抑制孢子萌發(fā)的EC50值介于0.008 4～189.393 8 mg/L，其中四霉素和百菌清2種殺菌劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較強(qiáng)，其EC50值分別為0.008 4和0.037 8 mg/L，均顯著小于0.1 mg/L，而戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、腈苯唑、咪鮮胺、多菌靈、異菌脲和腐霉利等7種殺菌劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較低，其EC50值分別為189.393 8、143.422 1、96.639 3、90.332 0、77.296 7、44.750 8 和31.774 3 mg/L，均顯著大于10 mg/L。

表3 16 種殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌孢子萌發(fā)的抑制作用測定結(jié)果

2.3 8類殺菌劑的抑制作用特點(diǎn)比較

8類殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用比較見表4。結(jié)果表明，苯并咪唑類、麥角甾醇抑制劑和二甲酰亞胺類對(duì)菌絲生長的抑制活性較強(qiáng)，但對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較弱；保護(hù)性殺菌劑、甲氧基丙烯酸酯類和琥珀酸脫氫酶抑制劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較強(qiáng)，但對(duì)菌絲生長的抑制活性較弱；農(nóng)用抗生素類（四霉素和申嗪霉素）以及吡咯類（咯菌腈）對(duì)菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有較好的抑制活性。

表4 8 類殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用比較

3 結(jié)論與討論

從殺菌劑的作用機(jī)制分析，苯并咪唑類（MBCs）主要是抑制細(xì)胞的有絲分裂；麥角甾醇抑制劑（SBIs）主要是抑制生物膜的合成；二甲酰亞胺類（DCFs）為信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，使細(xì)胞內(nèi)滲透壓加大而最終死亡。此3類殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌菌絲生長的抑制活性較強(qiáng)，但對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較弱，表明桃褐腐病菌在菌絲生長階段的有絲分裂、生物膜合成及信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)比孢子萌發(fā)階段更加活躍，受到抑制后效果也更加明顯。甲氧基丙烯酸酯類（QoIs）和琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）均為呼吸抑制劑，保護(hù)性殺菌劑則作用于多個(gè)位點(diǎn)，此3類殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌孢子萌發(fā)的抑制活性較強(qiáng)，但對(duì)菌絲生長的抑制活性較弱，表明桃褐腐病菌在孢子萌發(fā)階段的呼吸作用比菌絲生長階段更活躍，對(duì)保護(hù)性殺菌劑的敏感性更高，耐受力更差，受到抑制后效果也更加明顯。農(nóng)用抗生素類的四霉素（又稱梧寧霉素）和申嗪霉素為多位點(diǎn)殺菌劑，其對(duì)桃褐腐病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制活性均明顯高于保護(hù)性殺菌劑代森錳鋅和百菌清，說明桃褐腐病菌對(duì)此2種抗生素更加敏感。吡咯類殺菌劑咯菌腈與二甲酰亞胺類作用機(jī)理相似，亦為信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，但其對(duì)桃褐腐病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制活性均明顯高于異菌脲和腐霉利，說明桃褐腐病菌對(duì)咯菌腈更加敏感。

本研究結(jié)果表明，苯并咪唑類、麥角甾醇抑制劑和二甲酰亞胺類對(duì)菌絲生長的抑制活性較強(qiáng)，但對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較弱。因此，此類殺菌劑適宜推遲到發(fā)病初期菌絲生長階段進(jìn)行治療應(yīng)用；保護(hù)性殺菌劑、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑和琥珀酸脫氫酶抑制劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性較強(qiáng)，但對(duì)菌絲生長的抑制活性較弱。因此，此類殺菌劑適宜在發(fā)病前期孢子萌發(fā)階段進(jìn)行預(yù)防應(yīng)用；農(nóng)用抗生素類四霉素和申嗪霉素以及吡咯類咯菌腈對(duì)菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有很好的抑制活性。因此，此類殺菌劑適宜于在桃褐腐病菌各生育期用藥。但是，同類殺菌劑不同品種間殺菌譜和殺菌特點(diǎn)可能存在較大差異，本試驗(yàn)測定的殺菌劑品種不能代表該類殺菌劑的全部品種，各類殺菌劑的其他品種對(duì)桃褐腐病菌的抑制特性有待進(jìn)一步測定。

甲氧基丙烯酸酯類（QoIs）殺菌劑屬于線粒體呼吸抑制劑，主要通過抑制細(xì)胞色素b與c1間的電子傳遞，從而阻斷ATP產(chǎn)生而使細(xì)胞死亡。房雅麗等[6]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正常的電子傳遞途徑被抑制后，植物病原真菌可從旁路氧化途徑獲取能量。在田間，寄主植物會(huì)分泌（類）黃酮類物質(zhì)抑制病原菌旁路氧化途徑，而在培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，旁路氧化途徑則不能被抑制。因此，室內(nèi)測定時(shí)通常需在培養(yǎng)基中加入100 mg/L的水楊肟酸（SHAM）來阻止旁路氧化途徑，但其前提是在此用量下水楊肟酸本身對(duì)該病原菌沒有明顯抑制活性，并且對(duì)旁路氧化途徑能夠有效抑制。該研究還發(fā)現(xiàn)，含量40～100 mg/L的水楊肟酸對(duì)大部分桃褐腐病菌菌絲生長具有明顯的抑制作用，不適合用于桃褐腐病菌菌絲生長測定[6]；另外，60 mg/L的水楊肟酸雖不影響孢子萌發(fā)的最高濃度，但該濃度對(duì)旁路氧化途徑的抑制程度尚無定論。因此本試驗(yàn)PDA培養(yǎng)基和WA培養(yǎng)基中均沒有加入水楊肟酸，水楊肟酸對(duì)肥城地區(qū)桃褐腐病菌室內(nèi)毒力測定中旁路氧化途徑的影響數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步研究。

由于用藥方式和用藥環(huán)境不同，室內(nèi)毒力測定結(jié)果與田間試驗(yàn)結(jié)果往往存在差異，本試驗(yàn)只測定了16種殺菌劑對(duì)桃褐腐病菌的室內(nèi)毒力，其田間防效需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。褐腐病有2個(gè)發(fā)病高峰期：一個(gè)是花期，一個(gè)是果實(shí)成熟期。幼果期一般不發(fā)病，落花后被侵染的幼果只在表面出現(xiàn)肉眼可見的小斑點(diǎn)，待到果實(shí)成熟期才迅速表現(xiàn)發(fā)病癥狀，這種現(xiàn)象被稱為“休止侵染或潛伏侵染”[2]，其休止侵染原因尚未見報(bào)道。休止侵染對(duì)田間藥效試驗(yàn)也造成了困難，花期用藥會(huì)影響授粉并且容易造成藥害，謝花后用藥又不能有效控制病菌花期侵染，只能提前到花露紅時(shí)期用藥。實(shí)踐顯示，北方桃褐腐病花期試驗(yàn)不容易調(diào)查試驗(yàn)結(jié)果。果實(shí)成熟前開展試驗(yàn)，只能控制病原菌再侵染，對(duì)果實(shí)內(nèi)休眠后恢復(fù)活力的病原菌則很難發(fā)揮作用，并且容易造成采收桃農(nóng)藥殘留超標(biāo)。如何制定切實(shí)可行的桃褐腐病田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)測定的菌種為Monilinia fructicola，但引起桃褐腐病的病原菌至少有3種[1]，肥城地區(qū)是否存在其他2種病原菌以及殺菌劑對(duì)其他2種病原菌的毒力是否與本結(jié)果一致還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)只測定了藥劑對(duì)菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制活性，對(duì)產(chǎn)孢量的影響也有待進(jìn)一步研究。另外，本毒力測定均采用成品制劑，較之于原藥測定更有利于指導(dǎo)田間應(yīng)用，但制劑加工中的填料和助劑對(duì)測定結(jié)果可能存在影響，不同制劑加工技術(shù)對(duì)桃褐腐病菌的影響因子有待進(jìn)一步測定。