姚裕鋒黃紹剛林澤帆陳奕鈿李樅森陳嘉瑩曾小耘

（1. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，廣東 汕頭515041）

血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular endothelial cell，VEC）是各種生理刺激的重要整合者和轉(zhuǎn)化者，參與眾多生理過(guò)程[1]。各種刺激可調(diào)節(jié)VEC表型，如層流誘發(fā)內(nèi)皮一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin，TM）表達(dá)，使VEC有效抗血栓、抗黏附和抗炎[2]。相反，許多有害刺激如湍流、促炎細(xì)胞因子或晚期糖基化終產(chǎn)物[3]可能使VEC功能失調(diào)，最終降低eNOS表達(dá)，促進(jìn)血管細(xì)胞粘附分子-1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)VEC促凝表型[1]。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2（Krüppel-like factor 2，KLF2）作為Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員，參與VEC中多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮VEC抗血栓、抗炎和抗氧化等生理作用。對(duì)KLF2的研究，可為臨床上心血管藥物的開(kāi)發(fā)提供重要的思路?，F(xiàn)對(duì)KLF2的表觀遺傳修飾的調(diào)控機(jī)制予以綜述。

1 KLF2調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

KLF2可調(diào)節(jié)VEC中多種基因的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)其轉(zhuǎn)錄活性也接受多個(gè)因子的調(diào)節(jié)。位點(diǎn)分析表明在KLF2保守的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)存在肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（Myocyte enhancer factor 2，MEF2）的結(jié)合位點(diǎn)，后者為KLF2關(guān)鍵的正性轉(zhuǎn)錄因子[4]。IIa類組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases，HDACs）包括HDAC4/5/6/7/9/10，為MEF2轉(zhuǎn)錄活性的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。表觀遺傳學(xué)中，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶可誘導(dǎo)KLF2組蛋白中賴氨酸的乙酰化，使核小體松弛，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，而HDACs則可對(duì)抗這種過(guò)程[5]。IIa類HDACs N端結(jié)構(gòu)域高度保守，可介導(dǎo)其與MEF2的結(jié)合，使MEF2去乙酰化，抑制MEF2的轉(zhuǎn)錄活性，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)KLF2的表達(dá)[6,7]。IIa類HDACs N端絲氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)是決定其細(xì)胞定位和與MEF2相互作用的關(guān)鍵因素，其磷酸化將導(dǎo)致MEF2的解離和核輸出，從而促進(jìn)KLF2表達(dá)[5]。HDAC5還可直接與KLF2蛋白結(jié)合，降低其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[8]。KLF2 mRNA的3’端非編碼區(qū)可與microRNA-92a（miR-92a）結(jié)合，后者促進(jìn)KLF2 mRNA降解和抑制KLF2蛋白翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)KLF2的表達(dá)[9]。KLF2蛋白氨基端由轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)能與含WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶（WW domain E3 ubiquitin ligase 1，WWP1）結(jié)合，介導(dǎo)KLF2的泛素化和蛋白酶降解途徑[10]；羧基端包含三個(gè)串聯(lián)的Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)序列，能與靶基因的GC盒或GACCC盒結(jié)合，激活或抑制其靶基因，進(jìn)而調(diào)節(jié)VEC功能[11]。

2 KLF2的表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾是DNA-組蛋白復(fù)合物的可塑動(dòng)態(tài)變化，其通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子對(duì)染色質(zhì)的結(jié)合能力來(lái)快速改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。其機(jī)制主要包括DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白共價(jià)修飾和非編碼RNA等[12]。血流動(dòng)力學(xué)、炎癥、氧化應(yīng)激等因素引起KLF2表觀遺傳修飾，使KLF2表達(dá)量發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)VEC各種生理效應(yīng)。

2.1 血流動(dòng)力學(xué)

血流動(dòng)力學(xué)是引起KLF2表觀遺傳修飾的因素之一。血管中局部血流動(dòng)力學(xué)改變會(huì)影響細(xì)胞代謝，并觸發(fā)VEC的表觀遺傳改變[13]。層流剪切應(yīng)力可通過(guò)磷脂酰肌醇激酶（Phosphatidylinositol kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）依賴的染色質(zhì)重建信號(hào)通路調(diào)節(jié)VEC 中KLF2 的表達(dá)，這主要通過(guò)增加核仁素的表達(dá)實(shí)現(xiàn)[14]。用PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）后，核仁素可在層流切應(yīng)力下與p85（PI3K的修飾亞基）交互，使PI3K參與KLF2啟動(dòng)子的機(jī)械活化；核仁素一方面可自身結(jié)合于KLF2啟動(dòng)子并激活其表達(dá)，另一方面可與不均一核糖核蛋白D（Heterogeneous ribonucleoprotein-D，hnRNP-D）相互作用形成共激活復(fù)合物，進(jìn)而與KLF2啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)其表達(dá)，hnRNP-D和p300/ CBP相關(guān)因子（p300/CBP-associating facto，PCAF）都依賴PI3K/AKT通路與KLF2啟動(dòng)子結(jié)合，并可使其組蛋白H3、H4乙?；旧|(zhì)結(jié)構(gòu)變松弛，從而促進(jìn)KLF2的表達(dá)[14]。這些發(fā)現(xiàn)表明層流剪切應(yīng)力作用下的KLF2表觀遺傳修飾可能與PI3K/AKT通路有密切聯(lián)系。然而，關(guān)于該通路調(diào)節(jié)KLF2表達(dá)量的機(jī)制目前尚無(wú)定論。Johannes等人報(bào)道層流剪切應(yīng)力使PI3K/AKT快速（15s）瞬時(shí)激活，長(zhǎng)時(shí)間（>24h）的層流剪切應(yīng)力將降低HUVECs中PI3K/AKT通路磷酸化水平，進(jìn)而增強(qiáng)KLF2 mRNA的穩(wěn)定性[15]；Ding等人則認(rèn)為振蕩剪切應(yīng)力通過(guò)激活PI3K/AKT通路，誘導(dǎo)IIa類HDACs與MEF2結(jié)合，使后者去乙?；?，下調(diào)KLF2表達(dá)量[8]。

此外，VEC可在層流剪切應(yīng)力作用下釋放ATP，通過(guò)激活后者特異性P2X4受體，誘導(dǎo)鈣內(nèi)流和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal regulated protein kinase 5，ERK5）磷酸化，在已建立的ERK5/MEF2通路中調(diào)節(jié)KLF2表達(dá)[16]；而振蕩剪切應(yīng)力可抑制ERK5/MEF2通路，使KLF2的表達(dá)下調(diào)[17]。層流剪切應(yīng)力還可通過(guò)Ca2+和鈣調(diào)素依賴激酶依賴性途徑刺激VEC中IIa類HDACs的磷酸化和核輸出，誘導(dǎo)其和MEF2 的解離，增強(qiáng)MEF2 的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)KLF2表達(dá)[5]。層流剪切應(yīng)力還可解除HDAC5與KLF2蛋白的結(jié)合，提高KLF2轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)其靶基因eNOS的表達(dá)[8]。這些研究表明，HDAC5可能為VEC功能障礙的預(yù)防和動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性腦卒中等心血管疾病提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

一些研究則表明miR-92a在振蕩剪切應(yīng)力對(duì)KLF2負(fù)性調(diào)節(jié)過(guò)程中的重要作用。振蕩剪切應(yīng)力通過(guò)促進(jìn)miR-92a的表達(dá)，使得更多的miR-92a在AGO蛋白質(zhì)1（Argonaute-1， AGO1）的介導(dǎo)下，與KLF2 mRNA結(jié)合，組裝成小RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，后者通過(guò)募集AGO2，降低KLF2 mRNA轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制KLF2及其靶基因eNOS和TM的表達(dá)；而使用miR-92a抑制劑處理后，KLF2、eNOS和TM的表達(dá)量均增加[18]；且KLF2和KLF4的過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-92a的這種抑制作用[19]。這些結(jié)果表明，在引起動(dòng)脈粥樣硬化的湍流作用力下，VEC功能的紊亂主要是由miR-92a上調(diào)所引起，但關(guān)于血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)miR-92a表達(dá)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.2 炎癥

炎癥反應(yīng)時(shí)淋巴細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞可被激活并產(chǎn)生白細(xì)胞介素1β（Lnterleukin - 1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥介質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）和PI3K等通路，以及引起VEC內(nèi)關(guān)鍵基因的表觀遺傳修飾，從而降低一氧化碳的合成和生理利用率，增加活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等產(chǎn)物，造成血管收縮和細(xì)胞、組織損傷[20,21]。TNF-α可減弱層流剪切應(yīng)力對(duì)KLF2表達(dá)量的增強(qiáng)效應(yīng)[22]，這一過(guò)程需要p65參與，后者通過(guò)募集HDAC4和HDAC5并與其相互作用形成復(fù)合物，在HDAC4末端18個(gè)氨基酸序列的介導(dǎo)下與MEF2結(jié)合，抑制KLF2轉(zhuǎn)錄[22]。另一炎癥介質(zhì)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）通過(guò)增加甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)使KLF2下調(diào)，進(jìn)而影響VEC功能[23]。此外，Sirt1的過(guò)表達(dá)減少了顆粒物（Particulate matter，PM2.5）導(dǎo)致的肺內(nèi)VEC中KLF2表達(dá)量的降低幅度，其中機(jī)制可能涉及MEF2；KLF2表達(dá)量的上調(diào)降低了NF-κB活性，進(jìn)而抑制了PM2.5引起的肺內(nèi)炎癥和凝血反應(yīng)[24]。

PI3K/AKT介導(dǎo)的KLF2調(diào)控具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。肺炎鏈球菌感染時(shí)，跨膜受體Toll樣受體2和胞漿核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域可識(shí)別病原菌，誘導(dǎo)PI3K的兩個(gè)亞基p55α和p58α磷酸化，激活PI3K通路，促進(jìn)肺內(nèi)VEC中KLF2表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB和IL-8，控制炎癥和防止炎癥失控所導(dǎo)致的器官衰竭[25]。此外，血管生成素1與其TEK酪氨酸激酶受體2結(jié)合后，通過(guò)增強(qiáng)PI3K/AKT通路活性，促進(jìn)MEF2轉(zhuǎn)錄和KLF2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體血管活動(dòng)靜止，以此對(duì)抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）誘導(dǎo)的炎癥和血管生成反應(yīng)；這一途徑中AKT與MEF2之間分子聯(lián)系的機(jī)制尚未清楚，可能跟轉(zhuǎn)錄共激活因子p300和PCAF與MEF2的結(jié)合有關(guān)[26]。因此，PI3K/AKT通路或許可作為抗炎藥開(kāi)發(fā)的一種新方向。

2.3 氧化應(yīng)激

VEC在受到刺激后會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化物（Hydrogen peroxide，H2O2），氧化低密度脂蛋白（Oxidation modifies LDL，ox-LDL），高半胱氨酸和高級(jí)糖基終產(chǎn)物（High glycemic end product，AGE）等物質(zhì)，這些物質(zhì)以較高濃度持續(xù)存在于血漿或組織中，并主要通過(guò)氧自由基的過(guò)氧化反應(yīng)引起胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化和蛋白質(zhì)、核酸變性[27]。有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可通過(guò)表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路和多個(gè)酶的活性，從而促進(jìn)VEC凋亡[28]。表觀遺傳修飾還可通過(guò)影響氧化應(yīng)激中ROS的產(chǎn)生與清除，以及氧化還原平衡調(diào)控通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，從多個(gè)方面參與機(jī)體氧化平衡系統(tǒng)的調(diào)控[29]。在糖尿病中，H2O2和AGE可通過(guò)誘導(dǎo)小泛素樣修飾物SUMO的E2連接酶和E3連接酶來(lái)促進(jìn)ERK5泛素化，而ERK5的泛素化可降低自身轉(zhuǎn)錄活性，通過(guò)ERK5/MEF2通路降低KLF2的表達(dá)量[30]。同時(shí)，高血糖的長(zhǎng)期刺激也可降低此通路的磷酸化水平，增加KLF2靶基因內(nèi)皮素的表達(dá)，從而引起糖尿病血管的特征性改變[31]。

p66shc屬于SH2包含蛋白線粒體銜接子家族，是一種氧化還原酶，參與線粒體ROS生成和氧化信號(hào)翻譯。在H2O2或紫外線介導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，p66shc的ser36磷酸化將增加氧化應(yīng)激敏感性[32]。研究發(fā)現(xiàn)血漿S-腺苷同型半胱氨酸濃度升高可降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyl transferase-1，DNMT1）活性，造成VEC中p66shc啟動(dòng)子低甲基化，引起p66shc介導(dǎo)的VEC氧化應(yīng)激反應(yīng)和功能障礙[27]。p66shc主要依賴于MEF2A，通過(guò)抑制ERK5/MEF2通路，或者促進(jìn)核呼吸因子1與MEF2A啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)p66shc結(jié)合于KLF2啟動(dòng)子，下調(diào)KLF2表達(dá)[33]。進(jìn)一步研究報(bào)道LDL可通過(guò)上調(diào)p66shc，調(diào)控KLF2，但這不是其調(diào)控作用的主要途徑；LDL主要誘導(dǎo)DNMT1在轉(zhuǎn)錄水平修飾KLF2，同時(shí)將原先結(jié)合于KLF2啟動(dòng)子的MEF2替換成由甲基CGP結(jié)合蛋白2和zeste同系物2組成的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，從而抑制KLF2表達(dá)[34]。綜上所述，p66shc和KLF2可能有望成為氧化應(yīng)激相關(guān)的心血管疾病治療靶點(diǎn)。

2.4 其他

WWP1可與KLF2蛋白結(jié)合，促進(jìn)其泛素化和蛋白酶降解途徑[10]；腫瘤抑制因子FBW7可靶向促進(jìn)KLF2蛋白的泛素化降解[35]。以上兩個(gè)研究提供了KLF2翻譯后水平調(diào)節(jié)的機(jī)制。此外，p53可與KLF2結(jié)合并募集IIa類HDACs結(jié)合于KLF2啟動(dòng)子，使KLF2基因的組蛋白去乙酰化，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變緊密，降低KLF2的轉(zhuǎn)錄活性；敲除p53基因可增加KLF2表達(dá)[36]。內(nèi)皮集落形成細(xì)胞中，VEGF可促進(jìn)HDAC5磷酸化，上調(diào)KLF2表達(dá)[37]。

3 結(jié)論

綜上所述，KLF2的表觀遺傳修飾受多種因素影響，在KLF2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用；作為轉(zhuǎn)錄因子，KLF2則通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)對(duì)VEC功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。作為VEC功能調(diào)控位點(diǎn)，KLF2有望成為心血管疾病的藥物治療靶點(diǎn)及藥物療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，為心血管藥物的開(kāi)發(fā)提供新思路。然而，目前對(duì)KLF2的研究仍存在不足，以下問(wèn)題仍需解決：①KLF2對(duì)VEC保護(hù)機(jī)制的研究大多為體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，兩者最好相互補(bǔ)充和驗(yàn)證，以解釋體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異；②共同刺激因素下，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中KLF2表達(dá)量的變化情況及調(diào)控機(jī)制，及其與VEC中KLF2轉(zhuǎn)錄活性變化的聯(lián)系仍需深入探究。