左青婷 熊文碧

（1. 四川大學華西藥學院，四川 成都 610041；2. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理學教研室，四川 成都 610041）

1 mRNA疫苗

mRNA疫苗的概念起源于1989年，Vical公司成功將外源性mRNA裝載進脂質(zhì)體納米粒中并轉(zhuǎn)染入真核細胞[1]。隨后的一系列研究進一步證明外源性mRNA可以遞送入活體組織中并產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可治療性用于病人的蛋白質(zhì)錯誤或缺失[2]。除此之外，在二十世紀九十年代初，有研究表示mRNA可以遞送抗原信息引發(fā)機體的免疫反應[3]。在隨后的30年研究中，mRNA疫苗已經(jīng)到達了一個新的高度，許多候選藥物具有腫瘤治療和感染性疾病防治的應用前景，已經(jīng)進入臨床試驗。目前的mRNA疫苗主要包括非復制型（Non-replicating）mRNA疫苗和自我擴增型（Self-amplifying） mRNA疫苗。

1.1 非復制型mRNA疫苗

非復制型mRNA疫苗通過線性pDNA或PCR模板的體外轉(zhuǎn)錄合成，主要結(jié)構(gòu)包括5'帽子結(jié)構(gòu)（Cap）、5'非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）、開放閱讀框（Open reading frame，ORF）、3'非翻譯區(qū)和多聚腺苷酸尾巴〔Poly（A）〕。5'-UTR和3'-UTR中的調(diào)節(jié)元件可以調(diào)控mRNA的翻譯過程。ORF是含有編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。5`帽子可以防止mRNA被外切酶迅速降解；防止天然免疫傳感器的識別；與真核翻譯啟動因子結(jié)合[4]。Poly(A)尾巴通過多聚腺苷酸結(jié)合蛋白（Poly A binding protein，PABP）連接帽子和尾巴，增強mRNA的穩(wěn)定性[5]。

1.2 自我擴增型mRNA疫苗

自我擴增型mRNA是將編碼抗原的核酸序列直接插入單鏈RNA病毒中，其中編碼mRNA復制機制的基因是完整的，只是編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因被目的基因替換[6]。和非復制性mRNA相比，自我擴增型mRNA有兩個優(yōu)勢：自我復制能力使目標抗原在宿主細胞中高水平表達；mRNA表達時間增長，如非免疫源性報告蛋白可以在體內(nèi)持續(xù)兩個月的表達[7]。

mRNA疫苗相比于DNA疫苗更加安全，不會導致治療性基因整合突變，并且能成功激活體內(nèi)的免疫應答。此外，一種新的mRNA結(jié)構(gòu)通常可以以一種直接、快速的方式合成，這一特點使mRNA疫苗在面對傳染性疾病如流感時成為理想的候選藥物。但是，為了保證mRNA疫苗在體內(nèi)的穩(wěn)定性與安全性，還需要合適的載體材料。mRNA疫苗的載體材料分為病毒載體和非病毒載體。本綜述主要討論用于遞送mRNA的非病毒載體的種類及研究進展。

2 遞送mRNA疫苗的非病毒載體材料

2.1 陽離子脂質(zhì)

脂質(zhì)體是由單層或多層磷脂雙分子組成的球形囊泡，囊泡內(nèi)為含有靶基因的水性核心。通常使用含有極性頭部基團和非極性尾部的材料制備，這些基團之間的疏水和親水相互作用刺激囊泡形成。帶正電的陽離子脂質(zhì)可以與帶負電的mRNA相互作用，從而達到遞送目的。但由于早期使用的陽離子脂質(zhì)在生理條件下也帶正電，既容易與生物流體中其他帶負電的分子相互作用，又容易被免疫細胞捕獲。因此，PH響應的陽離子脂質(zhì)被篩選出，并被制備成多種形式的mRNA的遞送載體。

脂質(zhì)納米粒（Lipid nanoparticle，LNP）是其中研究較多、較成熟的一種。LNP是由脂質(zhì)形成的、具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡。組成脂質(zhì)雙層殼的材料有可電離脂質(zhì)、磷脂、膽固醇、聚乙二醇化脂質(zhì)，每種脂質(zhì)都發(fā)揮著不同的功能。含有胺基的脂質(zhì)或類脂類，如Dlin-MC3-DMA、G0-C14、C12-200是可電離脂質(zhì)，有著合適的pKa，在較低的PH條件下帶正電，在生理條件下呈中性，這樣既減少了非特異性脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，又可幫助mRNA實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。組成LNP的磷脂（二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿），膽固醇，聚乙二醇（PEG）化脂質(zhì)（二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG、二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?PEG）則有提高雙層膜的穩(wěn)定性，促進細胞內(nèi)攝取等作用。

正電中心的結(jié)構(gòu)、尾巴的長度、尾巴的幾何結(jié)構(gòu)以及連接鏈的長度等都會影響到LNP的效價。Anderson[8]等通過烯基環(huán)氧化合物與多胺核之間的開環(huán)反應合成具有烯基氨基醇類的可電離脂質(zhì)（OF-00、OF-01、OF-02、OF-03）。脂質(zhì)與膽固醇、1,2-二醇基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、C14-PEG-2000以及未修飾的編碼人紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）的mRNA配制成LNP，以cKK-E12[9]為陽性對照，進行轉(zhuǎn)染效率的比較。OF-02 LNPs的EPO血清濃度遠高于cKK-E12 LNPs的EPO血清濃度。此外，在進行量效曲線對比時，OF-02 LNPs優(yōu)于cKK-E12 LNPs，前者在2.25 mg?kg-1劑量時達到了最大EPO濃度25400±5300 ng·ml-1。cKK-E12和OF-02的正電中心均為雙賴氨酸衍生的二酮哌嗪，區(qū)別在于前者的尾巴為氨基醇類脂質(zhì)，后者連接的是碳十六二烯烴。除此之外，適當增加連接鏈長度、加入載脂蛋白E等也能提高mRNA的轉(zhuǎn)染效率[10]。

除了脂質(zhì)納米粒外，陽離子脂質(zhì)還會被制備成陽離子納米乳（Cationic nanoemulsion，CNE）用于提高mRNA疫苗在體內(nèi)的穩(wěn)定性。Brito[11]的研究團隊使用陽離子脂質(zhì)（2, 3-二油?；?丙基）-三甲胺和乳液佐劑MF59制備陽離子納米乳。該CNE在小鼠體內(nèi)遞送編碼呼吸道合胞病毒融合糖蛋白的mRNA，在新西蘭白兔體內(nèi)遞送編碼HIV gp140包膜糖蛋白的mRNA，在非人類靈長動物體內(nèi)遞送編碼人巨細胞病毒包膜糖蛋白B的mRNA。這些mRNA在體內(nèi)都表現(xiàn)出良好的免疫原性。

2.2 多聚物

自1987年多聚賴氨酸（Polylysine，PLL）被報道作為首個陽離子多聚物非病毒載體成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA后，精胺、聚乙烯亞胺、殼聚糖、聚胺基脂等多聚物類非病毒載體相繼問世。

聚氨基脂〔Poly(b-amino)ester，PBAE〕是一類聚胺類陽離子聚合物，通常由兩步反應生成。第一步為胺與二丙烯酸酯通過邁克爾加成聚合，第二步用二元胺進行末端封閉。核心胺除了親水性胺類，也會有親脂性胺類，比如C12烷基胺，以提高PBAE的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。PBAE的可降解性、高轉(zhuǎn)染效率和合成路徑簡單使PBAE十分具有前景，在早期被成功用于DNA的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染[12]。隨后研究人員對PBAE進行修飾，成功在體內(nèi)完成mRNA的遞送。Anderson[13-14]等人以7mol%聚乙二醇-脂質(zhì)（PEG-lipid）修飾PBAE，提高其在體外的血清穩(wěn)定性，并通過靜脈注射成功將mRNA遞送到小鼠的肺中。轉(zhuǎn)染效率高的PBAE甚者超過了商業(yè)使用的jetPEI的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。需要注意的是，PEG-lipid修飾與體外血清穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率并非完全呈正相關(guān)，優(yōu)化程度取決于原PBAE的化學結(jié)構(gòu)，并且體外血清穩(wěn)定性并不是唯一的指標，它更適合作為療效篩選后的二級標準。隨后的兩年，Anderson[15]等人再次用聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）修飾PBAE，完成了mRNA到脾臟的高效遞送，打開了用生物可降解載體遞送編碼抗原的mRNA的可能性。研究人員對傳統(tǒng)二丙烯酸酯進行改造或?qū)郯被M行整體修飾，使PBAE更多功能化、更低毒性、更高效。

聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）也是一種非常有前景的陽離子多聚物遞送載體，最初作為非病毒載體遞送DNA進入小鼠大腦[16]。PEI豐富的仲胺、叔胺基團在一定PH條件下呈正電性，具有高密度電荷和緩沖能力。同時，以上特有的理化性質(zhì)讓PEI有獨特的方式保護核酸免于溶酶體降解[17]。雖然PEI作為基因遞送載體有其獨特的優(yōu)勢，但其嚴重的細胞毒性限制了應用。隨著PEI分子量的增加，雖然轉(zhuǎn)染效率提高，但毒性也隨之增大。為了克服限制，研究人員對PEI進行了各種結(jié)構(gòu)的改造與修飾，如用多糖、聚乙二醇修飾PEI以提高生物相容性和轉(zhuǎn)染效率，用陰離子脂質(zhì)體或中性脂質(zhì)體包裹PEI/核酸聚合物，可以減少聚合物的非特異性粘附。此外，研究人員還通過制備低分子量PEI衍生物，在保證其低細胞毒性的同時提高轉(zhuǎn)染效率。

2.3 樹形分子及其衍生物

聚酰胺-胺（Polyamidoamine，PAMAM）和聚丙烯亞胺（Polypropyleneimine，PPI）是研究最廣泛的兩類樹形分子。在結(jié)構(gòu)上，樹形分子一般具有規(guī)整的分子結(jié)構(gòu)，高度支化的分子內(nèi)有許多空腔，末端含有豐富的官能團。Chahal[18]等人開發(fā)一個快速反應，完全合成，單一劑量，無需佐劑的樹狀大分子納米粒子疫苗平臺，以更好應對突發(fā)疫情，持續(xù)發(fā)展的病原體以及特殊需求的病人?？呻婋x的樹狀大分子納米材料結(jié)合上PEG修飾的脂質(zhì)，最后包封mRNA復制子得到疫苗。疫苗通過肌內(nèi)注射可以檢測到相應RNA的成功表達以及抗原特定T細胞的激活。在另一份報道中，Siegwart[19]等人從可以有效遞送siRNA/miRNA到肝臟的樹狀大分子脂質(zhì)納米粒（Dendrimer lipid nanoparticle，DLNP）中得到靈感，設計出一種優(yōu)化的DLNP，用于遞送編碼延胡索酸水解酶的mRNA。使用優(yōu)化的DLNP，在低劑量mRNA下，>44%的肝細胞可以被轉(zhuǎn)染并且高產(chǎn)延胡索二酰乙酰乙酸水解酶蛋白。

2.4 細胞穿透肽

細胞穿透肽（Cell-penetrating peptide，CPP）發(fā)現(xiàn)于1988年，是一種短序列多肽，能幫助細胞攝取多種分子。Frankel和Pabo的研究[20]表明HIV-1的反轉(zhuǎn)錄激活因子（Trans-activator of transcription，Tat）能進入組織培養(yǎng)中的細胞，并最終定位于細胞核；1990年P(guān)rochiantz[21]等人根據(jù)果蠅同源異型觸角基因的序列合成了有60個氨基酸的多肽（pAntp）。該多肽不僅可以進入哺乳動物神經(jīng)細胞促進神經(jīng)元分化，還可以增強已分化神經(jīng)細胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變。雖然CPP的跨膜機制仍不清楚，但人工合成設計CPP的大門已經(jīng)開啟。CPP具有低毒性和無細胞限制的優(yōu)勢，已被用于成功遞送寡肽、蛋白質(zhì)、pDNA等。

目前，CPP在mRNA遞送領(lǐng)域的研究相對較少，但依舊具有較大潛力。Koker[22]研究團隊設計了一種具有雙親性RALA基序的CPP，可以將編碼抗原的mRNA遞送到免疫系統(tǒng)。在酸性條件下，該細胞穿透肽帶有低密度正電荷，雙親性的RALA基序也幫助包裹mRNA進入胞漿，編碼抗原，促進CD8 T細胞分化。此外，該研究團隊還嘗試將修飾的mRNA（假尿苷和5-甲基胞苷修飾的mRNA）與CPP聯(lián)合。修飾后的mRNA在促進T細胞分化方面得到提升，并且這種優(yōu)化只發(fā)生在CPP介導的載體，并不發(fā)生在以脂質(zhì)為基礎的載體。

2.5 其他

最近，Wang[23]等以聚乙二醇-聚乙丙交酯嵌段聚合物為主要原料，輔以陽離子脂質(zhì)BHEMChol，制備陽離子脂質(zhì)-聚合物雜化納米顆粒（Cationic lipid-assisted nanoparticle，CLAN）。CLAN能將Cas9 mRNA和引導RNA（guide RNA，gRNA）遞送入巨噬細胞，用于治療NLRP3依賴的炎癥性疾病。Hammond[24]等人通過將多聚腺苷酸結(jié)合蛋白（Poly A binding protein，PABP）與mRNA協(xié)同組裝以提高mRNA在小鼠體內(nèi)的表達。

3 結(jié)語

相比于傳統(tǒng)疫苗，mRNA疫苗可應對多種新型病毒，甚至癌癥。為了將mRNA疫苗更好地應用于臨床，研究人員聚焦于增強mRNA疫苗的穩(wěn)定性、降低其免疫原性、優(yōu)化和完善其遞送系統(tǒng)。以往的遞送載體開發(fā)進程慢，現(xiàn)在研究人員會利用計算機，采用可控的開環(huán)反應、平行合成等方法在短時間內(nèi)合成大量遞送載體，再通過有效的篩選技術(shù)得到轉(zhuǎn)染效率高的遞送載體，大大節(jié)約了時間和成本[25]。但目前實現(xiàn)了從實驗室到臨床試驗的mRNA疫苗只有一小部分。遞送載體的穩(wěn)定性、細胞毒性、包封率等問題還有待解決。為了研發(fā)出符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范要求、能最終應用于臨床的mRNA疫苗，基因遞送材料尤其是非病毒遞送材料領(lǐng)域仍待更深的開拓。