馮 超 張成省 張家韜 周本國 王衛(wèi)民 譚效磊 崔志燕

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所 煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點實驗室，青島 266101；2.陜西省煙草公司，西安 710000；3.安徽省農(nóng)科科學院煙草研究所，合肥 230001；4.浙江中煙工業(yè)有限責任公司，杭州 310000；5.山東省煙草公司臨沂市公司，臨沂276000)

根系分泌物是指植物正常生長過程中向外界環(huán)境中釋放的一系列化學物質(zhì)，如質(zhì)子、低分子量有機酸、氨基酸、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、黏膠質(zhì)、細胞脫落物等[1]。根系分泌物對于植物緩解外界脅迫、促進養(yǎng)分有效性以及土壤與植物之間的物質(zhì)交流等具有重要作用。在植物生長發(fā)育過程中，根系作為植物與土壤的接觸部分，不僅從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，而且通過根分泌的方式向根周圍釋放一些無機離子和有機化合物，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為根系分泌物[2]。有大量研究表明[3,4]，根系分泌物影響到土壤生物學環(huán)境變化和化感作用，不同作物對土壤微生物群落影響不同，同種作物受病原菌侵染后根系分泌物的成分含量不同，從而改變了土壤微生物群落的生長代謝。然而，要了解根系分泌物的功能，必須先得到根系分泌物。

目前，收集植物根系分泌物一般采用溶液收集法，即將生長在營養(yǎng)液或營養(yǎng)土中的根系轉(zhuǎn)入處理溶液中，一段時間后，收集處理溶液即為根系分泌物。這一方法存在的缺點是：生長在營養(yǎng)液或營養(yǎng)土中的植物取出后缺少自然條件選擇，無土壤脅迫很難反映土壤條件下根系分泌的實際情況，這是因為土壤成分復雜、養(yǎng)分存在形式多樣化[5,6]。因此，尋找一種在自然條件下，土壤脅迫過程中植物根系分泌物的收集方法很重要。為研究無外界干擾根系分泌物的有效表達，不擾動根系生長，不破壞根際環(huán)境，監(jiān)測根際病原菌侵染后根系分泌物的變化具有重要意義。本研究以感染/未感染煙草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)的小黃金1025為材料，采用試驗室自制根系分泌物收集裝置獲得根系分泌物，并通過LC-MS分析其差異性代謝物。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料：高感煙草疫霉菌品種小黃金1025，由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所煙草種質(zhì)資源庫提供。

菌株材料：煙草疫霉菌Phytophthora nicotianae 0號生理小種，由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所植物保護研究室分離純化。

藥劑：KNO3為分析純，購自上?；瘜W試劑公司。

儀器：LCMS-Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；真空冷凍干燥機(德國Christ公司)。

栽培基質(zhì)：滅菌土壤、草炭和珍珠巖(V/V/V=2∶2∶1)。

根系分泌物收集裝置(圖1)：以小黃金1025根系分泌物為例，說明根系分泌物收集裝置的操作方法。一種根系分泌物發(fā)生及收集裝置由植物生長器(圖1 a)，根系生長引導裝置(圖1 b、圖1c)，根系洗脫及分泌物收集裝置(圖1 d)(下簡稱收集裝置)組成，根系生長引導裝置由網(wǎng)狀結構(圖1 b)和塑料隔板(圖1 c)組成。具體操作步驟為：將根系生長引導裝置裝入植物生長器中，高溫滅菌(120℃，20min)后，將滅菌營養(yǎng)土倒入植物生長器中，預先培育好的小黃金1025定植于營養(yǎng)土中，根據(jù)煙株大小確定定植數(shù)目。將整個裝置放入人工氣候室培養(yǎng)。在重力作用下，植物根系向下生長，穿過根系生長引導裝置。20～30d后待植物根系到達網(wǎng)狀結構，取下塑料隔板，鏈接收集裝置，內(nèi)置石英沙等，用鋁箔紙包裹收集裝置。待小黃金1025根系在收集裝置中積聚一定量后，將石英沙去除，收集裝置滅菌后裝入無菌水，收集根系分泌物。

圖1 根系分泌物發(fā)生及收集裝置

1.2 方法

1.2.1滅菌處理

種子消毒：將煙草種子裝入滅菌紗布中，放入10% H2O2液中消毒10 min后取出，用無菌水沖洗5 次，每次1min即可獲得無毒種子[7-9]。

栽培基質(zhì)消毒：高溫滅菌120℃，30min。

收集裝置消毒：高溫滅菌120℃，20min。

1.2.2游動孢子懸浮液制備[10]

將供試煙草疫霉菌置于28℃、12 h光暗交替的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14d，待大量產(chǎn)孢后，在培養(yǎng)皿中加入滅菌0.1%KNO3溶液(剛好沒過菌絲)。隨后將培養(yǎng)皿置于4℃冰箱20 min，再轉(zhuǎn)至 25 ℃光照培養(yǎng)箱中放置 25 min，誘導孢子囊釋放游動孢子，鏡檢，吸出懸浮液并用血球計數(shù)板觀測濃度，稀釋為106孢子/mL 的游動孢子懸浮液。

1.2.3植物材料的培育及試驗處理

將消毒后的煙草種子直接播種于沙土中萌發(fā)。待20d后獲得幼苗，選取大小一致的幼苗轉(zhuǎn)移到假植盤中，采用常規(guī)栽培方法待幼苗長至4葉期時移栽到1.1中所述的植物生長器中。每個植物生長器中種植2行，每行6株煙草。放于人工氣候室，條件為白天30℃，晚25℃，連續(xù)培養(yǎng)。試驗設2個處理，處理1為感染組，即感染煙草疫霉菌的小黃金1025根系分泌物收集：根系分泌物收集前3d在煙株根部注射煙草疫霉菌孢子懸浮液，每株接煙草疫霉菌孢子懸浮液500μL；處理2為未感染組，即未感染煙草疫霉菌的小黃金1025根系分泌物收集：即為常規(guī)培養(yǎng)。每個試驗處理設6次重復。

1.2.4根系分泌物的收集

植物生長器中的小黃金1025連續(xù)培養(yǎng)8周后。其根系在收集裝置中積聚一定量，將石英沙去除，收集裝置滅菌后裝入無菌水繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集根系分泌物。將收集液過濾(濾膜孔徑：0.22um，尺寸：φ25mm)，濾液冷凍干燥。稱量所有根系鮮重，用滅菌去離子水溶解根系分泌物凍干物，定容至每毫升根系分泌物母液為1克根分泌而成，即1g根分泌/mL。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5根系分泌物的LC-MS分析

定容后的根系分泌物利用LC-MS進行成分分析。本實驗的儀器分析平臺為LC-Q/TOF-MS(Thermo, Ultimate 3000 LC, Orbitrap Elite)，分離色譜柱為C18色譜柱(Hypergod C18(100×4.6mm 3μm))。

色譜條件：柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸。進樣量為4μL，自動進樣器溫度4 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI源)，同時采用正、負兩種離子化模式檢測：正模式，離子源溫度300 °C，鞘氣，45arb，輔助氣，15 arb吹掃氣，1arb，噴霧電壓，3.0KV毛細管溫度，350 °C，碰撞誘導解離能量為30%；負模式，離子源溫度300 °C，鞘氣，45arb，輔助氣，15 arb吹掃氣，1arb，噴霧電壓，3.2KV毛細管溫度，350 °C，碰撞誘導解離能量為60%。

數(shù)據(jù)處理：應用SIVE軟件(Thermo公司)對LC/MS數(shù)據(jù)進行預處理及歸一化，并在Excel2007軟件中進行編輯，將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導入Simca-P軟件(版本13.0)進行主成分分析(PCA)。

2 結果與分析

2.1 煙草根系在收集裝置中的生長情況

煙草植株在植物生長器內(nèi)定植20～30d后，根系充分分散在生長器內(nèi)，在重力作用下，煙草根系向下生長，20d后根系通過固體培養(yǎng)基到達根系生長引導裝置的網(wǎng)狀結構，取下塑料隔板，鏈接上收集裝置。在收集裝置中裝滿石英沙等，用鋁箔紙包裹收集裝置。8周后取下鋁箔紙發(fā)現(xiàn)，煙草根系完全分散于收集裝置中，且生長良好，積聚一定量，將石英沙去除，收集裝置滅菌后裝入無菌水，根系分散在無菌水中，1d后收集根系分泌物。

2.2 感染/未感染組成分分析

為獲得感染/未感染組根系分泌物的代謝物信息，采用多元統(tǒng)計分析，即PLS-DA和OPLS-DA分析[11]，最終獲得差異性代謝物。

2.2.1PLS-DA分析[12]

采用監(jiān)督性的多維統(tǒng)計方法即偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)對兩組樣本進行分析，并使用得分圖進行可視化(圖2、圖3)，圖中每一個點代表一個樣本，兩個處理組均未觀察到離群值；感染組和未感染組樣本可以通過主成份t[1]分開，說明兩組根系分泌物樣本在代謝物方面具有較為明顯差異；圖中兩組樣本間有一定的存在距離，同樣說明兩組樣本的代謝物存在變化。判別模型質(zhì)量好壞的主要參數(shù)為R2Y及Q2值，本模型正模式下R2Y=0.983，Q2=0.929；負模式下R2Y=0.992，Q2=0.964。正模式下和負模式下兩者均趨于1，表明該模型能夠真實反映樣本狀態(tài)。另外我們對模型進行排序驗證，檢驗模型是否“過擬合”，從圖4和圖5可見，模型未出現(xiàn)“過擬合”。因此，該模型對于解釋兩組之間差異及尋找差異物質(zhì)是可靠的。

圖2 正模式感染組(X)未感染組(CKX)PLS-DA得分圖

圖3 負模式感染組(X)未感染組(CKX)PLS-DA得分圖

圖4 正模式PLS-DA下排序驗證圖

圖5 負模式PLS-DA下排序驗證圖

2.2.2OPLS-DA分析

進一步使用OPLS-DA進行建模分析并使用得分圖進行可視化(圖6,圖7)，由圖可見未發(fā)現(xiàn)各組存在離群值。t[1]將感染組和未感染組明顯分開，這種明顯的分離趨勢說明兩組根系分泌物在代謝物方面具有明顯差異。結果表明在正模式下得到4個主成分和1個正交成分，R2X=0.9，R2Y=0.997，Q2=0.945；負模式下得到2個主成分和1個正交成分，R2X=0.73，R2Y=1，Q2=0.984。表明建立數(shù)學模型較可靠。

圖6 正模式感染組(X)未感染組(CKX)OPLS-DA得分圖

圖7 負模式感染組(X)未感染組(CKX)OPLS-DA得分圖

2.2.4感染/未感染組之間差異性代謝產(chǎn)物的篩選和鑒定

使用2.2.3構建的OPLS-DA模型計算根系分泌物樣本中各變量的VIP(Variable Importance in the Projection)值(閾值>1)，并結合t-test的p值(p<0.05)，分別篩選鑒定正負模式下差異性表達代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索在線數(shù)據(jù)庫(http://metlin.scripps.edu/)(比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass)。差異性代謝物數(shù)據(jù)如表1、表2所示。

表1 正模式下未感染/感染根系分泌物差異性代謝物

表2 負模式下未感染/感染根系分泌物差異性代謝物

在健康小黃金1025接種煙草疫霉菌后，根系分泌物代謝物單體含量發(fā)生變化。主要為有機酸、堿、烯、醇、酯、酮、醛、胺等物質(zhì)。未感染組和感染組相比，根系分泌物化合物單體Fold change值呈負數(shù)時表明感染組含量升高，正數(shù)時表明感染組含量下降。Fold change值為未感染組與感染組均值之比以2為底對數(shù)值，其絕對值為3時，表明均值比為8。若絕對值大于3表明均值比大于8，即變化為8倍以上，被認為含量有較大變化，可作為研究對象繼續(xù)研究。共發(fā)現(xiàn)17種差異顯著的物質(zhì)，分別是：正模式下三丙酸甘油酯(Glycerine tripropionate，-8.5511)、9-芴醇(9-Fluorenol，-5.8092)、荷哈默辛(Horhammericine，-4.1023)、肉桂酸異戊酯(Isoamyl cinnamate)，-3.3714)、4-正庚氧基苯甲酸(4-Heptyloxybenzoic acid，-3.2930)、蓖麻烯(Casbene，7.0232)；負模式下，茉莉酮(Prohydrojasmon，-11.5744)、野罌粟堿(Nudicauline，-8.1470)、對香豆?；鶡晒馑?p-Coumaroylagmatine，-6.6767)、石蒜堿(Lycaconitine，-5.3806)、維生素C(Acoric acid，-3.7204)、4-羥苯丙酮酸(4-Hydroxyphenylpyruvic acid，7.2620)、油酸(Oleic Acid，6.3313)、4-羥基苯乙醛(4-Hydroxyphenylacetaldehyde，5.6158)、海綿堿(Caaverine，4.4791)、肉桂酸(ferulic acid，3.4298)、二硝托胺(Dinitolmide，3.2196)。

在兩種模式下，絕大多數(shù)單體物質(zhì)Fold change值呈負數(shù)，說明感染組含量升高，即接種煙草疫霉菌后大部分代謝物單體含量升高，分析原因可能與侵染后寄主植物產(chǎn)生的抗體物質(zhì)，或是侵染后煙草疫霉菌孢子萌發(fā)時產(chǎn)生的代謝物質(zhì)有關，這部分物質(zhì)是否誘發(fā)病害發(fā)生還需進一步研究。部分代謝物單體Fold change值呈正數(shù)，說明感染組含量降低，分析原因可能與煙草疫霉菌生理過程中能量消耗有關。

3 討論

研制了一種在自然條件下，不擾動根系生長、不破壞根際環(huán)境、土壤脅迫過程中植物根系分泌物的收集裝置及方法，可實現(xiàn)無外界干擾單一病原菌侵染后，根系分泌物的有效表達，監(jiān)測根際病原菌侵染后根系分泌物的變化?？朔F(xiàn)有方法中根系易腐爛、易受微生物污染、取樣易傷害根系、不能連續(xù)取樣等弊端。

煙草品種小黃金1025是對煙草疫霉菌高感品種，在生產(chǎn)上常用作鑒定抗感品種的感病對照。接種煙草疫霉菌后，伴隨著疫霉菌對小黃金1025的侵染過程，其根系分泌物發(fā)生變化，為獲得這一變化結果，采用試驗室自制裝置收集到感染組和未感染組根系分泌物樣本，并采用LC-MS方法獲得了代謝物變化。

在煙草疫霉菌侵染后，未感染組和感染組表現(xiàn)出不同的代謝特征。接種煙草疫霉菌后，病原菌與寄主植物煙草小黃金1025發(fā)生相互識別，識別發(fā)生在互作的最早階段，有啟動或引發(fā)寄主和病原物一系列病理反應的功能。病原物對寄主植物周圍的根部作出反應到侵染，仍需要一段較長的時間[13]，在此期間根部微生物群落發(fā)生變化，造成根系分泌物代謝物發(fā)生變化。大量研究證實，土壤病原菌對寄主植物根部的定殖被認為與寄主植物的根系分泌物有關[14]。病原微生物對根系分泌物具有趨向性，致使其逐漸在根際和根表群集[15]。根系分泌物中含有大量與微生物定殖有關的糖類、氨基酸、有機酸以及其它化學物質(zhì)。分泌物成分因植物品種、生理狀態(tài)、發(fā)育時期、病原菌的侵染而不同，分泌物的成分導致根系周圍微生物群落差異，進而影響根系周圍微生物種群的生物活性和病原微生物的定殖過程[16,17]。Rudrappa[18]等研究表明，在擬南芥-青枯病害系統(tǒng)中，病原物侵染后，根圍蘋果酸分泌物顯著增加。蘋果酸分泌物能吸引有益枯草芽孢桿菌在根系周圍定殖，組成生物膜保護根系受到病原物的進一步侵染。該研究證明了根系分泌物對植物和不同微生物互作有重要作用。Deacon等[19]研究表明根系分泌物影響病原菌和寄主互作的早期識別過程，寄生疫霉侵染寄主植物后，寄生疫霉游動孢子可以被氨基酸(特別是谷氨酸和天冬氨酸)、有機酸、糖類、次生代謝物和揮發(fā)物吸引。

綜上所述，煙草根系分泌物種類復雜，收集和分離過程差異較大，利用有機溶劑提取只能獲取其中一部分，有機溶劑還將影響鑒定結果，因此研究一種適合煙草根系分泌物的收集裝置及方法尤為重要。LC-MS分析結果表明煙草小黃金1025根系分泌物的主要提取物有烴類、苯、噻唑、酸、酮、酰胺、酯、醇和酚，在感染疫霉菌后，代謝物含量發(fā)生較大變化。為后期研究根系分泌物與疫霉菌互作識別提供重要的理論依據(jù)。