喬亞俊，高婷婷，李岑，張明，魏立新，畢宏濤

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室，青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評價研究重點實驗室，青海 西寧 810001；2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院心理學(xué)系，廣東 廣州 510515；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

隨著生活方式和社會心理環(huán)境的改變，抑郁癥的發(fā)病率逐年增加.Ali等[1]預(yù)測，2020年抑郁癥將成為全球疾病負(fù)擔(dān)的第二大誘因.世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，目前全球約有3.5億人遭受抑郁癥的折磨，預(yù)計到2030年將成為全球首要疾病負(fù)擔(dān)[2].

目前，臨床使用的抗抑郁藥物主要有4類：三環(huán)類藥物(TCAs)、五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)、選擇性五羥色胺去甲腎上腺素再攝取抑制劑(SNRIs)和單胺氧化酶抑制劑(MAOIs)，此外還有安非他酮、奈法唑酮、曲唑酮、米氮平等其他類藥物[3].盡管治療抑郁癥臨床用藥諸多，但抑郁癥的防治仍缺乏快速及長期有效的干預(yù)策略[4].因此，現(xiàn)有抗抑郁藥的輔助治療藥物研發(fā)成為抑郁癥藥物治療的研究熱點之一.

丙咪嗪(imipramine，IMI)是世界第一種三環(huán)類抗抑郁藥物，1957年成功合成至今，被廣泛用于治療內(nèi)因性抑郁癥，也可用于治療官能性或反應(yīng)性抑郁癥.丙咪嗪的研發(fā)成功在抗抑郁藥發(fā)展史上具有里程碑式的意義[5].藏藥“佐太”是藏語“仁青歐曲佐珠欽木”的簡稱，也叫“甘露精王”，始載于公元8世紀(jì)宇妥寧瑪·元丹貢布編著的《四部醫(yī)典》.佐太在藏藥中最為貴重，被藏族人民稱為“眾藥之王”，是生產(chǎn)“七十味珍珠丸”等名貴藏藥的主要原料.趙靜等[6]研究表明，佐太能夠通過抑制HPA軸亢奮和上調(diào)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，顯著改善小鼠抑郁樣行為.進(jìn)一步研究表明，佐太的主要成分β-HgS可以顯著增強(qiáng)抑郁模型小鼠的糖水偏愛率[7]和減少不動時間[6]，改善慢性束縛刺激(chronic restraint stress，CRS)造成的好感缺失和學(xué)習(xí)無助行為，且100倍臨床等效劑量時，β-HgS的抗抑郁效果最為顯著.因此，為了探尋臨床抗抑郁藥的輔助治療藥物，本研究選擇丙咪嗪和β-HgS聯(lián)合使用，通過糖水偏愛試驗、開場試驗、懸尾試驗和強(qiáng)迫游泳4個行為學(xué)試驗，觀察海馬組織切片，測定大腦皮層單胺神經(jīng)遞質(zhì)、海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)含量，研究二者聯(lián)用對慢性束縛刺激(CRS)小鼠的抗抑郁作用.

1 材料與方法

1.1 試驗動物

昆明種(KM)小鼠40只，SPF級，雄性，體質(zhì)量(35±2)g，購買于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(許可證號SYXK(甘)2015-0005)，飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，恒溫恒濕環(huán)境(濕度為50%～80%，溫度為21～23 ℃)人工光照晝夜循環(huán)12 h.

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為對照組、模型組、β-HgS組(338 mg/kg)、丙咪嗪組(15 mg/kg)和β-HgS+丙咪嗪(338 mg/kg+15 mg/kg).

1.2 藥物與試劑

鹽酸丙咪嗪(純度：98%)，購于中國食品藥品檢驗研究院；β-HgS(純度：98%)購于Alfa Aesar公司；5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒，購于上海江萊生物科技有限公司.

1.3 儀器與設(shè)備

束縛管(50 mL離心管，每管3～4個0.2 cm小孔，自制)；開放式現(xiàn)場試驗系統(tǒng)設(shè)備(OFT-100，中國泰盟公司)；懸尾試驗裝置(木架，高75 cm，自制)；強(qiáng)迫游泳試驗裝置(圓柱形玻璃缸，高25 cm、直徑10 cm，自制)；硬盤攝錄機(jī)(GZ-MG174AC，日本JVC公司)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3K-15，Sigma公司)；多功能酶標(biāo)儀(Enspire2300，Perkin Elmer公司)；高通量組織勻漿儀(Scientz-48，寧波新芝生物科技股份有限公司)；脫水機(jī)(JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司)；包埋機(jī)(JB-P5，武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(jī)(RM2016，上海徠卡儀器有限公司)；病理成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3，日本尼康).

1.4 試驗方法

1.4.1 動物給藥與處理 將丙咪嗪和β-HgS懸浮或溶解在2%淀粉水溶液中.對照組和模型組小鼠每天灌胃給予0.1 mL/kg的2%淀粉混懸液，β-HgS組、丙咪嗪組和β-HgS+丙咪嗪組每天灌胃給予338 mg/kg(劑量參考100倍的佐太成人臨床等效劑量)[8]的β-HgS、15 mg/kg(劑量參考成人臨床等效劑量)的丙咪嗪[9]，灌胃劑量為0.1 mL/kg.除空白組小鼠外，其余各組小鼠在給藥的同時給予慢性束縛刺激，具體操作為：將小鼠置于自制束縛管中，每日束縛3 h(9∶00～12∶00)[10-12].給藥和慢性束縛刺激持續(xù)21 d，每隔一周記錄一次動物體質(zhì)量.行為學(xué)試驗于應(yīng)激結(jié)束后第1天開始(即第22天)，為了避免行為學(xué)試驗之間互相影響，每組小鼠每天同步進(jìn)行一個行為學(xué)試驗.

1.4.2 開場試驗(OFT) 第22天進(jìn)行開場試驗，提前60 min將小鼠籠移動到設(shè)備房間中適應(yīng)環(huán)境，隨后將小鼠置于開場試驗裝置(長、寬、高分別為500 mm×500 mm×415 mm)中央，通過開場設(shè)備上方的攝像機(jī)及監(jiān)視器記錄5 min內(nèi)小鼠的活動情況并計算中央?yún)^(qū)停留時間百分率(中央?yún)^(qū)停留時間/300 s)、中央?yún)^(qū)水平運動百分率(中央?yún)^(qū)水平運動距離/水平運動距離).試驗結(jié)束后將小鼠放回籠內(nèi)，70%乙醇徹底擦拭試驗裝置并用紙巾擦干[13].

1.4.3 糖水偏愛試驗(SPT) 第19～22天進(jìn)行糖水適應(yīng)訓(xùn)練，3 d適應(yīng)訓(xùn)練結(jié)束后，禁食、禁水22 h.SPT于第23天19∶00開始，小鼠單籠喂養(yǎng)，同時給予一瓶1%蔗糖水和一瓶超純水，自由飲食、飲水2 h.2 h后記錄每只小鼠的糖水和超純水消耗量，計算小鼠的糖水偏愛率[14].

1.4.4 懸尾試驗(TST) 第24天進(jìn)行懸尾試驗，用醫(yī)用膠布纏繞在距離小鼠尾巴尖部2～3 cm處，然后將其固定在木板上，攝錄6 min內(nèi)小鼠的行為.所有試驗結(jié)束后，采用間隔觀察法，記錄最后4 min視頻小鼠被懸掛時的完全不動的時間[15].

1.4.5 強(qiáng)迫游泳試驗(FST) 第25天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗，將每只小鼠分別置于一個圓柱形玻璃缸中(高25 cm，直徑10 cm)，在室溫23～25 ℃的條件下加入10 cm高的等溫度的水，攝錄6 min內(nèi)小鼠的行為.使用雙盲定時器記錄試驗最后4 min內(nèi)小鼠的不動時間[16].

1.4.6 組織切片染色觀察 行為學(xué)試驗結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取2只小鼠斷頸取血，在冰板上迅速剝離腦組織，全腦置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，矢狀面切片(厚5 μm)，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，在顯微鏡下觀察海馬組織病理變化.

1.4.7 單胺神經(jīng)遞質(zhì)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素含量檢測 行為學(xué)試驗結(jié)束后，每組6只小鼠頸椎脫臼處死，在冰板上迅速剝離腦組織，分別取出皮層、海馬組織和下丘腦置于1.5 mL離心管中，分別加入20倍、10倍、10倍質(zhì)量的PBS緩沖液(pH7.0～7.2)，使用組織勻漿儀進(jìn)行組織勻漿(頻率60 Hz，轉(zhuǎn)速1 800次/min，2 min)，4 ℃條件下，分別5 000 r/min和4 000 r/min離心5 min后，取上清液置于1.5 mL離心管，采用ELISA試劑盒，按說明書方法測定上清液中5-HT、NE、BDNF和CRH的含量.

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠體質(zhì)量的影響

如圖1-A所示，0天各組小鼠體質(zhì)量均無明顯差異.與對照組相比，模型組小鼠在慢性束縛刺激第7天、14天和21天時，體質(zhì)量分別下降了12.02%、11.03%和13.44%.與模型組相比，β-HgS組小鼠第7天時體質(zhì)量明顯下降，14天與21天時體質(zhì)量逐漸增加，丙咪嗪及β-HgS+丙咪嗪組的小鼠體質(zhì)量均有增加.其中，β-HgS+丙咪嗪組的小鼠體質(zhì)量增加最多，在第7天、14天和21天時分別比模型組小鼠體質(zhì)量增加5.04%、3.03%和7.95%，且在第21天時存在顯著性差異(P<0.01).

2.2 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠開場試驗中心停留時間和中心運動距離的影響

如圖1-B所示，與對照組相比，模型組小鼠的中心停留時間百分比和中心運動距離百分比顯著降低(P<0.001、P<0.01).與模型組相比，丙咪嗪組小鼠的中心停留時間百分比顯著增加(P<0.05)，β-HgS+丙咪嗪組小鼠的中心停留時間百分比和中心運動距離百分比均顯著增加(P<0.01、P<0.01)，而β-HgS組小鼠的中心停留時間百分比和中心運動距離百分比均無顯著性差異.3個給藥組中，β-HgS+丙咪嗪組小鼠的中心停留時間百分比和中心運動距離百分比最高，較模型組分別增加了122.41%和112.75%.如圖1-C所示，與對照組小鼠相比，模型組小鼠的活動區(qū)域趨向于四周，而丙咪嗪組和β-HgS+丙咪嗪組小鼠的活動區(qū)域趨向于中心.

2.3 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠糖水偏愛率的影響

如圖1-D所示，與對照組比較，模型組小鼠糖水偏愛率顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，β-HgS組、丙咪嗪組和β-HgS+丙咪嗪組小鼠糖水偏愛率均顯著增高(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，其中β-HgS+丙咪嗪組小鼠糖水偏愛率最高，比模型組增高了47.35%.

2.4 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠懸尾試驗和強(qiáng)迫游泳試驗中不動時間的影響

如圖1-E所示，與對照組小鼠相比，模型組小鼠的懸尾試驗和強(qiáng)迫游泳試驗不動時間顯著增加(P<0.001、P<0.05).與模型組相比，3個給藥組小鼠的懸尾試驗和強(qiáng)迫游泳試驗不動時間均顯著減少(P<0.01或P<0.001).其中，β-HgS+丙咪嗪組小鼠的懸尾試驗和強(qiáng)迫游泳試驗不動時間最少，較模型組分別減少了41.67%和57.77%，而且顯著少于丙咪嗪組(P<0.05).

2.5 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，對照組小鼠海馬各亞區(qū)輪廓清晰，神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常，分布均勻.模型組與對照組相比，小鼠海馬DG亞區(qū)輪廓開始出現(xiàn)模糊，部分神經(jīng)元破裂浸潤、固縮；CA3亞區(qū)部分可見神經(jīng)元固縮、深染，神經(jīng)元間排列疏松，界限模糊；CA1區(qū)無明顯變化.與對照組比較，各給藥組小鼠海馬的CA1和CA3亞區(qū)未見明顯差異；海馬DG亞區(qū)部分可見神經(jīng)元固縮、深染.其中β-HgS組DG區(qū)神經(jīng)元固縮、深染較少.

2.6 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠大腦皮層中單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

如圖3-A～6-B所示，慢性束縛應(yīng)激刺激3周后，模型組小鼠大腦皮層中5-HT和NE含量顯著低于對照組(P<0.01、P<0.001).與模型組相比，3個藥物治療組小鼠大腦皮層中5-HT和NE含量均有不同程度增加.其中，丙咪嗪組小鼠大腦皮層的5-HT含量最高，與模型組相比增加了13.73%(P<0.05)，但與其他2個給藥組無顯著差異；β-HgS組小鼠大腦皮層的NE含量最高，與模型組相比增加了33.56%，且β-HgS組和β-HgS+丙咪嗪組小鼠的NE含量顯著高于丙咪嗪組(P<0.05).

2.7 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的影響

如圖3-C所示，應(yīng)激刺激3周后，模型組小鼠海馬中BDNF含量顯著低于對照組(P<0.01).與模型組相比，3個給藥組小鼠海馬中BDNF含量均不同程度增加.其中，β-HgS組小鼠的BDNF含量最高，與模型組對比增加了10.03%，且β-HgS組和β-HgS+丙咪嗪組小鼠的BDNF含量顯著高于丙咪嗪組(P<0.05).

A：體質(zhì)量；B：開場試驗中心區(qū)域停留時間和運動距離；C：開場試驗運動軌跡；D：糖水偏愛率；E：懸尾試驗和強(qiáng)迫游泳試驗不動時間.*表示與對照組比較差異顯著(** P<0.01、*** P<0.001)；#表示與模型組比較差異顯著(#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001)；$表示與丙咪嗪組比較差異顯著($P<0.05).A： Weight；B： The percentages of central residence time and center movement distance in the open-field test (OFT)；C：Motion trajectory map of each group of mice in the OFT；D：Sucrose preference ratio；E：Immobility time in the tail suspension test (TST) and forced swimming test (FST) of mice.Compared with the control group.* means significant difference (** P<0.01,*** P<0.001)；Compared with the model group,# means significant difference (#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)；compared with the IMI group,$ means significant difference ($P<0.05).圖1 各處理對慢性束縛刺激小鼠的體質(zhì)量和抑郁行為的影響Figure 1 Effects of different treatments on weight and depression behaviors of chronic restraint stress (CRS) stimulated mice

HE染色、放大倍數(shù)400倍.HE staining,magnification:400.圖2 各處理對慢性束縛刺激小鼠的海馬關(guān)鍵亞區(qū)結(jié)構(gòu)的影響Figure 2 Effects of different treatments on structure of key hippocampal subregions of chronic restraint stress (CRS) stimulated mice

2.8 β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用對CRS小鼠海馬促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素含量的影響

如圖3-D所示，應(yīng)激刺激3周后，模型組小鼠海馬中CRH含量顯著高于對照組(P<0.01).與模型組相比，β-HgS組小鼠海馬中CRH含量升高，但無顯著差異；丙咪嗪組和β-HgS+丙咪嗪組顯著減少(P<0.001、P<0.001)，但二者之間無顯著差異.

3 討論

隨著社會的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，人們通常處于一種長期固定的壓力刺激中，對于壓力刺激，應(yīng)激反應(yīng)能夠調(diào)動機(jī)體，重建機(jī)體的穩(wěn)態(tài)[17].體質(zhì)量變化是抑郁癥發(fā)生、發(fā)展的一個重要特征，特別是與重度抑郁癥(MDD)密切相關(guān)[18].本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性束縛刺激過程中模型組小鼠體質(zhì)量顯著下降，然而第21天時β-HgS+丙咪嗪組小鼠體質(zhì)量顯著高于模型組.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，β-HgS+丙咪嗪組小鼠的OFT中心運動距離和中心停留時間百分比顯著減少，糖水偏愛率、FST和TST不動時間顯著增加，表明β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用能夠顯著提高CRS小鼠的自主活動能力[19]，顯著改善其快感缺乏[20]和絕望狀態(tài)[21]，顯示出良好的抗抑郁作用.與丙咪嗪組相比，β-HgS+丙咪嗪組小鼠的體質(zhì)量更高，自主活動能力更強(qiáng)，絕望狀態(tài)改善更明顯，表明β-HgS對丙咪嗪緩解小鼠抑郁具有增效作用.

小鼠海馬組織病理觀察結(jié)果，進(jìn)一步說明了β-HgS對丙咪嗪緩解小鼠抑郁具有增效作用.抑郁癥會導(dǎo)致大腦組織實質(zhì)性損害，與情緒、記憶密切相關(guān)的大腦組織，尤其是海馬最易受到損害[22].抑郁癥患者的海馬結(jié)構(gòu)存在萎縮，且海馬萎縮程度與抑郁癥病情正相關(guān)[23].小鼠海馬組織病理切片分析結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠海馬DG區(qū)和CA3區(qū)均有明顯損傷.與模型組相比，各給藥組小鼠海馬DG區(qū)與CA3區(qū)結(jié)構(gòu)損傷程度顯著減輕，其中DG區(qū)結(jié)構(gòu)：各給藥組與對照組均無明顯差別；CA3區(qū)結(jié)構(gòu)：β-HgS組和β-HgS+丙咪嗪組的損傷程度均明顯小于丙咪嗪組，推測β-HgS可以增強(qiáng)丙咪嗪對CRS小鼠海馬DG區(qū)結(jié)構(gòu)損傷的保護(hù)作用.

隨著對抑郁癥研究的不斷深入，學(xué)者們提出了一系列關(guān)于抑郁癥發(fā)病機(jī)制的假說，包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說[24]、神經(jīng)營養(yǎng)缺乏假說[25]、下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)功能障礙假說[26]等.其中，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類與人的精神情感活動密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，如5-HT不足可引起抑郁癥及其相關(guān)癥狀，包括自殺、強(qiáng)迫、慢性疼痛和睡眠障礙等；NE水平低下，可引發(fā)嗜睡、精神運動性阻滯、認(rèn)知障礙和快感缺失等抑郁癥相關(guān)癥狀[4,27].BDNF能夠影響突觸結(jié)構(gòu)的重塑，對維持神經(jīng)元正常的生理功能起關(guān)鍵的作用，神經(jīng)營養(yǎng)缺乏假說主要基于BDNF的3個現(xiàn)象：海馬BDNF信號受損會誘發(fā)抑郁樣行為；提高海馬BDNF的蛋白水平會產(chǎn)生抗抑郁效果；BDNF作為神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)制器，在神經(jīng)元生長和存活扮演主要角色，并導(dǎo)致神經(jīng)可塑性[28].人類尸檢顯示，抑郁病人海馬BDNF 表達(dá)水平顯著降低[29].HPA軸控制著機(jī)體對應(yīng)激的反應(yīng)并調(diào)控體內(nèi)多種生理過程，近年來的研究顯示抑郁癥與HPA軸功能失調(diào)之間存在一定的關(guān)系，主要表現(xiàn)為HPA軸功能的亢進(jìn)，包括中樞CRH分泌增多，外周血ACTH和皮質(zhì)酮CORT水平升高等[30].

A：5-羥色胺(5-HT)；B：去甲腎上腺素(NE)；C：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)；D：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH).*表示與對照組比較差異顯著(**P<0.01、*** P<0.001)；#表示與模型組比較差異顯著(#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001)；$表示與丙咪嗪組比較差異顯著($P<0.05).A：5-HT；B：NE；C：BDNF；D：CRH.Compared with the control group,* means significant difference (** P<0.01,*** P<0.001)；compared with the model group,# means significant difference (#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)；compared with the IMI group,$ means significant difference ($P<0.05).圖3 各處理對慢性束縛刺激小鼠的大腦皮層單胺神經(jīng)遞質(zhì)、海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素含量的影響Figure 3 Effects of different treatments on monoamine neurotransmitter content in cortex,BDNF and CRH content in hippocampus of chronic restraint stress (CRS) stimulated mice

本研究結(jié)果顯示，21 d的慢性束縛刺激顯著降低小鼠大腦皮層5-HT、NE和海馬BDNF含量，顯著增加海馬CRH含量，而β-HgS與丙咪嗪聯(lián)用能夠顯著提高CRS小鼠大腦皮層5-HT、NE和海馬BDNF含量，降低海馬CRH含量(P<0.05或P<0.001).特別是，與丙咪嗪組相比，β-HgS+丙咪嗪組小鼠大腦皮層NE含量和海馬BDNF含量更高(P<0.05).推測，β-HgS對丙咪嗪緩解小鼠抑郁的增效作用可能是通過單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子途徑來實現(xiàn)的.

綜上所述，β-HgS對丙咪嗪緩解小鼠抑郁具有增效作用，β-HgS能夠增強(qiáng)丙咪嗪對CRS小鼠自主活動能力和絕望狀態(tài)的改善作用，以及海馬DG區(qū)結(jié)構(gòu)損傷的保護(hù)作用.此外，其增效作用可能是通過提高CRS小鼠大腦NE和BDNE含量，即通過單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子途徑來實現(xiàn)的.