解衛(wèi)方 沈洪艷 郭志

(1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 石家莊050018； 2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050018； 3.華北制藥集團(tuán)先泰藥業(yè)有限公司 石家莊 052165)

0 引言

隨著近年來我國制藥行業(yè)不斷快速地發(fā)展，相對(duì)應(yīng)的制藥行業(yè)廢水排放量也在一直增加，在世界各國工業(yè)廢水排放量中，我國的廢水排放量占比高于工業(yè)生產(chǎn)占有率，占比為6%，而且我國大量生產(chǎn)使用抗生素，是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國[1]。相關(guān)研究表明，生產(chǎn)出1 t抗生素藥品就會(huì)產(chǎn)生150～200 m3的制藥廢水[2]?？股仡愃幤飞a(chǎn)廢水中殘存大量的有機(jī)溶劑、微量元素以及殺菌、抑菌等有毒物質(zhì)，影響水中水生生物的正常代謝和一系列的生理功能[3]。

近年來國內(nèi)外研究者已在抗生素對(duì)水生生物的影響方面做了全面而深刻的研究，尤其是水生生態(tài)系統(tǒng)受抗生素影響的研究報(bào)道不斷增多。李偉民等[4]首先報(bào)道了氯代苯胺對(duì)斑馬魚的急性毒性；吳志剛等[5]基礎(chǔ)性地報(bào)道了青霉素廢水會(huì)對(duì)斑馬魚機(jī)體造成了一定的氧化損傷；因此，本論文所研究的毒理實(shí)驗(yàn)有實(shí)際意義，并且可為后期阿莫西林制藥廢水的深度處理技術(shù)提供毒理學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)使用的廢水來自石家莊市開發(fā)區(qū)某制藥廠污水處理廠的進(jìn)水(車間排放的廢水)，選用斑馬魚為受試生物，進(jìn)行制藥廢水對(duì)斑馬魚的毒性實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了阿莫西林廢水對(duì)斑馬魚肌肉組織細(xì)胞中T-AOC、CAT活性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)實(shí)驗(yàn)：隨機(jī)取6條斑馬魚放入5 L的魚缸中，根據(jù)查閱文獻(xiàn)的記載，初步設(shè)定廢水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行31 min時(shí)，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的暴露組實(shí)驗(yàn)中觀察到斑馬魚開始死亡，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行36 min后，觀察到實(shí)驗(yàn)所用的斑馬魚全部出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的現(xiàn)象，預(yù)實(shí)驗(yàn)又增加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、5%、10%的暴露組。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行96 h，最終得出24 h斑馬魚全部死亡的實(shí)驗(yàn)所用阿莫西林制藥廢水的濃度和96 h內(nèi)斑馬魚未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象的阿莫西林制藥廢水濃度。

急性實(shí)驗(yàn)：按照上述進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的暴露組進(jìn)行急性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)定5個(gè)暴露組和1個(gè)對(duì)照組，每組隨機(jī)同時(shí)取10條健康的斑馬魚放入實(shí)驗(yàn)所用魚缸中，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行96 h，觀察斑馬魚所出現(xiàn)的癥狀及不同時(shí)間的死亡條數(shù)，最終得出斑馬魚的24 h半數(shù)致死濃度。

亞急性實(shí)驗(yàn)：依據(jù)上述急性實(shí)驗(yàn)所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，亞急性實(shí)驗(yàn)同樣分別設(shè)置對(duì)照組1組和暴露組5組，選用廢水體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)、同時(shí)選14條健康外觀正常的斑馬魚放入實(shí)驗(yàn)所用魚缸中，實(shí)驗(yàn)總進(jìn)行15 d，分別在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第3、6、9、12、15 d時(shí)，隨機(jī)撈取2條斑馬魚，用消毒的醫(yī)用剪刀對(duì)實(shí)驗(yàn)組中的斑馬魚進(jìn)行解剖并取其肌肉組織部分，用生理鹽水進(jìn)行浸泡，在放進(jìn)冷卻的玻璃勻漿器中，在冷卻條件下研磨搗碎，再用離心機(jī)進(jìn)行分離，取上清液再按照試劑盒使用方法對(duì)上清液進(jìn)行配制，最后用紫外分光光度計(jì)對(duì)斑馬魚肌肉組織的T-AOC和CAT活性進(jìn)行測(cè)定分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)廢水

阿莫西林廢水呈黃色，無刺鼻性氣味，取來后放在0～4 ℃的冰柜中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前對(duì)水樣的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 阿莫西林廢水水質(zhì)測(cè)定結(jié)果 mg/L(pH值除外)

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)生物、數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)備有酸度計(jì)(FE20)、UV2550紫外分光光度計(jì)、5 L魚缸、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、曝氣泵；不同量程的設(shè)備有移液槍、分析天平、電熱恒溫水浴鍋、玻璃勻漿器、量筒、溫度計(jì)、溶解氧測(cè)定儀(JPBJ-608)、水質(zhì)硬度計(jì)(YD300)等。

受試生物斑馬魚來源于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，體長為25±3 mm，體重0.20±0.05 g，實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)1周，斑馬魚的自然死亡率應(yīng)小于5%。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表現(xiàn)。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行空白組和暴露組的顯著性分析[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿莫西林制藥廢水水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前對(duì)廢水的COD、TOC、氨氮、pH值等常規(guī)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果及所用儀器見表1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除氨氮外，阿莫西林廢水中COD、TOC均超標(biāo)，與限定值對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為限定值的150倍和169倍，廢水pH值為4.46，為酸性溶液，實(shí)驗(yàn)時(shí)需將溶液的pH值調(diào)至中性。

2.2 阿莫西林制藥廢水對(duì)斑馬魚T-AOC活性的影響

T-AOC在生物體內(nèi)的活性水平大小代表著生物機(jī)體的代謝退化與生命衰亡[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)對(duì)斑馬魚T-AOC活性影響

第3天，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.4%、0.5%的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，未呈現(xiàn)出顯著性差異(p>0.05)，可能由于第3天實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，明顯的中毒跡象還未在斑馬魚機(jī)體中表現(xiàn)出來；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、0.5%的暴露組的脅迫已經(jīng)使得斑馬魚抗氧化防御系統(tǒng)受到了不可逆的變化，從而破壞了受試生物機(jī)體內(nèi)的抗氧化平衡狀態(tài)[8]。質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%暴露組與對(duì)照組相比，斑馬魚肌肉組織中的T-AOC活性呈現(xiàn)出了顯著性誘導(dǎo)的現(xiàn)象(0.01

第6天，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.5%實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較并未呈現(xiàn)出顯著性差異的現(xiàn)象(p>0.05)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與第3天質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.5%暴露組對(duì)照組對(duì)比無顯著性差異原因相同，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%暴露組斑馬魚機(jī)體還未做出應(yīng)激反應(yīng)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%暴露組已超過斑馬魚機(jī)體可承受的范圍；第6天，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%、0.4%實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較表現(xiàn)出了顯著性差異(0.01

第9天和第12天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較并未呈現(xiàn)出顯著性差異的現(xiàn)象(p>0.05)，可能是機(jī)體內(nèi)總抗氧化能力在此時(shí)處于動(dòng)態(tài)平衡，體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基能夠及時(shí)被抗氧化酶進(jìn)行消除[10]。

第15天，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%暴露組同對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著性誘導(dǎo)(0.010.05)，可能由于暴露時(shí)間較長，斑馬魚的抗氧化平衡狀態(tài)已經(jīng)受到毀壞，抗氧化酶也已失去活性。

2.3 阿莫西林制藥廢水對(duì)斑馬魚CAT活性的影響

CAT可與谷胱甘肽過氧化物酶等一起清除機(jī)體內(nèi)H2O2，減緩自由基對(duì)生物體的氧化傷害[7]，因而其在生物體抗氧化防御系統(tǒng)中占有很重要位置[12]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)對(duì)斑馬魚CAT活性影響

第3天和第6天，實(shí)驗(yàn)組中CAT活性與對(duì)照組比較未呈現(xiàn)顯著差異(p>0.05)，可能在實(shí)驗(yàn)初期(第3天、第6天)，污染物質(zhì)脅迫還未使得斑馬魚機(jī)體出現(xiàn)中毒跡象。

第9天和第12天，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，CAT活性未呈現(xiàn)顯著性變化，因?yàn)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的廢水濃度較低，還未使斑馬魚產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%、0.4%暴露組與對(duì)照組相比，CAT活性有所上升，斑馬魚體內(nèi)活性氧原本的平衡狀態(tài)被外源物質(zhì)的進(jìn)入所破壞，從而受刺激的機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一些自主的氧化應(yīng)激反應(yīng)；產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)就會(huì)消耗機(jī)體內(nèi)的CAT物質(zhì)，進(jìn)而加快斑馬魚體內(nèi)的過氧化氫分解，從而可以消除受試生物體內(nèi)的氧自由基，使機(jī)體免受過氧自由基的損傷[12]；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，CAT活性未呈現(xiàn)顯著差異，可能由于外援物質(zhì)的刺激清除了機(jī)體內(nèi)抗氧化自由基[13]，使機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)處于一個(gè)平衡狀態(tài)。

第15天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比未呈現(xiàn)出來一些顯著性差異(p>0.05)，可能實(shí)驗(yàn)第15天斑馬魚體內(nèi)CAT代謝H2O2能力達(dá)到飽和狀態(tài)，H2O2的積累量促使魚體細(xì)胞產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，使得其清除活性氧的性能丟失[5]。

2.4 阿莫西林制藥廢水對(duì)斑馬魚T-AOC和CAT活性影響對(duì)比

斑馬魚暴露在阿莫西林廢水中T-AOC和CAT活性變化呈現(xiàn)“抑制—誘導(dǎo)—抑制”的變化趨勢(shì)；T-AOC、CAT活性在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%暴露組時(shí)達(dá)到最大；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%、0.4%暴露組與對(duì)照組比較，T-AOC的活性呈現(xiàn)顯著性誘導(dǎo)(0.01

3 結(jié)論

阿莫西林廢水脅迫下斑馬魚肌肉組織內(nèi)T-AOC和CAT活性發(fā)生了變化，表明斑馬魚機(jī)體已經(jīng)對(duì)阿莫西林廢水的刺激做出了應(yīng)激反應(yīng)。

斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)可承受的最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%，超過0.3%斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)就會(huì)遭到影響。

斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)指標(biāo)T-AOC和CAT活性之間成協(xié)同作用，且在受到相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的阿莫西林廢水脅迫時(shí)，與CAT活性與T-AOC的活性比較變化較為顯著，可以較好地反映斑馬魚在阿莫西林廢水中所遭到的氧化脅迫狀態(tài)。