常曉 張菊 張艷芹 閆保國(guó) 管越強(qiáng)

摘 要：暗溫室是中華鱉（Pelodiscus sinensis）人工養(yǎng)殖的主要方式之一。為闡明中華鱉暗溫室養(yǎng)殖過(guò)程中高氮水體和低氮水體中微生物多樣性及其與環(huán)境因子的關(guān)系，在河北省鹿泉中華鱉暗溫室養(yǎng)殖池挑選了總氮濃度較高的池塘和總氮濃度較低的池塘進(jìn)行了水體理化因子監(jiān)測(cè)和微生物多樣性對(duì)比分析。水體理化因子檢測(cè)結(jié)果顯示兩種水體的溫度均在30 ℃左右，pH值為7左右，符合中華鱉的養(yǎng)殖要求。兩種水體的溶解氧為0.25 mg/L左右。高氮水體的總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的濃度相較于低氮水體均比較高。高氮與低氮水體在各分類(lèi)水平上的優(yōu)勢(shì)菌群均存在差異，低氮水體綠屈擾菌門(mén)（Chloroflexi）占據(jù)主要優(yōu)勢(shì)，而高氮水體中變形菌門(mén)（Proteobacteria）占主要優(yōu)勢(shì)，屬水平層次上低氮水體中的優(yōu)勢(shì)菌為束縛桿菌屬（Haliscomenobacter）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）。高氮水體多核桿菌屬（Polynucleobacter）、亮桿菌屬（Leucobacter）占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，兩種水體物種豐富度及相似度存在差異。結(jié)果表明高氮與低氮水體不僅在總氮和無(wú)機(jī)氮濃度上差別較大，微生物多樣性也存在明顯差距，微生物區(qū)系不同可能是造成氮濃度差異的原因之一。

關(guān)鍵詞：中華鱉（Pelodiscus sinensis）;微生物多樣性;暗溫室養(yǎng)殖;理化因子;環(huán)境調(diào)控

中華鱉口感鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及微量元素，是一種高蛋白低脂肪的食物原料，長(zhǎng)期以來(lái)一直被視為珍品，市場(chǎng)需求高漲[1]。中華鱉現(xiàn)有養(yǎng)殖模式主要有日光棚集約化養(yǎng)殖、暗溫室高密度養(yǎng)殖、日光棚+暗溫室兩段式養(yǎng)殖、仿生態(tài)養(yǎng)殖等[2]。高密度的暗溫室養(yǎng)殖養(yǎng)殖密度大、產(chǎn)量高，優(yōu)點(diǎn)是光線(xiàn)較弱，中華鱉互相撕咬現(xiàn)象明顯減少，缺點(diǎn)是水體中殘餌和糞便積累，養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重，患病幾率增加。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)河北省鹿泉中華鱉暗溫室高氮和低氮養(yǎng)殖水體進(jìn)行水質(zhì)理化參數(shù)監(jiān)測(cè)和微生物多樣性分析，闡明水體環(huán)境參數(shù)和微生物區(qū)系組成，為改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)特別是減少氮源污染，實(shí)現(xiàn)中華鱉健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

分別取中華鱉良種場(chǎng)暗溫室兩個(gè)池塘養(yǎng)殖水體樣品，總氮濃度較高的養(yǎng)殖池塘，記為H-N，總氮濃度較低的養(yǎng)殖池塘，記為L(zhǎng)-N。分別在兩個(gè)池塘的左、中、右位置取水，每個(gè)池塘取3個(gè)水樣，用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)和微生物多樣性分析。

1.2 水體理化因子分析

現(xiàn)場(chǎng)采樣過(guò)程中，采用YSI pH100A便攜式酸度計(jì)測(cè)定pH值，采用YSI DO200便攜式溶氧儀測(cè)定溶解氧濃度。水樣帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定總氮、氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮等化學(xué)指標(biāo)?？偟捎脡A性過(guò)硫酸鉀消解-紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，氨氮采用納氏試劑-分光光度法進(jìn)行測(cè)定，亞硝酸鹽采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法進(jìn)行測(cè)定，硝酸鹽采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定[3]。

1.3 水體微生物多樣性分析

1.3.1 樣品處理 過(guò)濾前靜置分離懸浮顆粒，用20 μm大孔徑濾膜預(yù)過(guò)濾一遍，再用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行抽濾，水樣過(guò)濾之后，將微生物富集的濾膜裝在50 mL離心管中，在-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 DNA提取、PCR和高通量測(cè)序 水體微生物多樣性由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)定。提取總DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測(cè)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：520F：5-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3， 802R： 5-TACNVGGGTATCTAATCC-3擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V4區(qū) （C，T = Y; G，A，T = D; A，C，G = V; A，C，G，T =N） 。PCR產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行磁珠純化回收?；厥债a(chǎn)物采用酶標(biāo)儀Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）測(cè)定濃度，所用試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據(jù)測(cè)定的濃度，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需求，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，最后上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的篩查與處理 運(yùn)用QIIME 2軟件切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列。隨后，通過(guò)QIIME 2軟件調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體序列獲取高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

1.3.4 物種分類(lèi)學(xué)注釋 對(duì)于細(xì)菌或古菌的16S rRNA基因，默認(rèn)選用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于每個(gè)ASVs的特征序列或每個(gè)OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類(lèi)器進(jìn)物種注釋。

1.3.5 α-多樣性分析 多樣性是指局部均勻生境下的物種在豐富度（richness）、多樣性（diversity）和均勻度（evenness）等方面的指標(biāo)[4]，也被稱(chēng)為生境內(nèi)多樣性，反映的是單個(gè)樣品中的物種多樣性。采用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index）、辛普森多樣性指數(shù)（Simpson diversity index）、Chao1指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)（Pielou evenness index）和覆蓋率（Coverage）對(duì)6個(gè)樣品中微生物的α-多樣性進(jìn)行比較和分析[5]。樣品中的群落多樣性用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)[6]和辛普森指數(shù)估算，樣品中的物種總數(shù)（OTU數(shù)目的指數(shù)）用Chao1[7]算法估計(jì)，樣品中群落的均勻度用Pielou均勻度指數(shù)估算，用樣品文庫(kù)的覆蓋率[8]評(píng)價(jià)測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性。

1.3.5 物種差異分析及標(biāo)志物種 為了探究微生物群落組成上的差異（即β-多樣性），了解微生物群的差異主要是由哪些物種的差異分布所導(dǎo)致的，借助ASV/OTU維恩圖、物種組成熱圖、LEfSe分析等方法來(lái)進(jìn)行分析，進(jìn)一步展示樣品間的物種差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體理化因子檢測(cè)結(jié)果

水體的現(xiàn)場(chǎng)水質(zhì)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，低氮水體溫度為30.0 ℃，pH值為7，溶解氧為0.25 mg/L，高氮水體溫度為30.1 ℃，pH值為7，溶解氧為024 mg/L。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果顯示高氮水體總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的濃度均高于低氮水體（表1）。

2.2 微生物多樣性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 物種分類(lèi)學(xué)注釋 通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)Greengenes比對(duì)，進(jìn)行物種注釋?zhuān)傻玫椒诸?lèi)學(xué)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)表（表2）并對(duì)不同分類(lèi)層級(jí)統(tǒng)計(jì)，分別對(duì)應(yīng)各樣本中能分類(lèi)至界、門(mén)、綱、目、科、屬、種的OTU數(shù)。發(fā)現(xiàn)低氮養(yǎng)殖池中LN-1只能分類(lèi)到界的OTU數(shù)為11個(gè)，分類(lèi)到門(mén)的OTU數(shù)為4個(gè)，分類(lèi)到綱水平上的OTU數(shù)為55個(gè)，以此類(lèi)推。

2.2.2 物種組成分析 將每個(gè)注釋上的物種歸類(lèi)于不同的分類(lèi)水平，并將OTU在不同樣品中的序列數(shù)進(jìn)行整理分析，不同樣本在各分類(lèi)水平所含有的分類(lèi)單元的數(shù)目（表3）。LN-1樣本包含有22個(gè)門(mén)、43個(gè)綱、90個(gè)目、125個(gè)科、161個(gè)屬和47個(gè)種，以此類(lèi)推。

根據(jù)物種組成結(jié)果分析，可得到各樣本在門(mén)、綱、目、科、屬水平上最大豐度排名前二十的物種，生成物種組成柱狀圖（圖1，見(jiàn)封三）。以便直觀查看各樣本在不同分類(lèi)水平上，相對(duì)豐度較高的物種及其比例（表4）。2.2.3 α-多樣性分析

樣品的覆蓋度（Coverage）相同，均為0.99，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果能夠代表樣品的真實(shí)情況。低氮水體中香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannon-Weiner Index）和辛普森指數(shù)（Simpson index）相較于高氮池較高，即低氮池中的細(xì)菌群落多樣性更為豐富。高氮水體的均勻度指數(shù)（Pielou index）比低氮水體高，說(shuō)明高氮水體群落中個(gè)體分配上的均勻性比低氮水體高。低氮水體的Chao1指數(shù)相較于高氮水體較高，說(shuō)明低氮水體細(xì)菌群落豐富度較高（表5）。2.2.4 水體菌群差異分析 為了進(jìn)一步分析樣品間菌群群落復(fù)雜度的差異，分別做主坐標(biāo)分析（Principal coordinates analysis，PCoA）和 UPGMA 聚類(lèi)樹(shù)分析（如圖2和圖3）。由主坐標(biāo)分析可以看出代表低氮和高氮養(yǎng)殖水體平行樣品的三個(gè)點(diǎn)距離相近而兩組樣品間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明低氮池和高氮池中平行樣品間的群落組成相似，而低氮和高氮養(yǎng)殖池間群落組成差異較大。UPGMA 聚類(lèi)樹(shù)分支長(zhǎng)度越短代表兩樣品越相似，低氮和高氮養(yǎng)殖池三個(gè)平行樣品之間的相似度較高，而兩個(gè)養(yǎng)殖池間的群落差異較大。

2.2.5 基于OTUs的維恩圖分析 為了解不同的樣本組間有哪些物種是共有的，哪些是獨(dú)有的，分析不同樣本之間共有、特有的OTUs得到以下維恩圖（圖4）?？梢钥闯龅偷靥赜械? 776個(gè)OTUs，高氮池特有1 240個(gè)OTUs，低氮池和高氮池共有296個(gè)OTUs，表明低氮養(yǎng)殖池的物種豐富程度高，并且低氮養(yǎng)殖池與高氮養(yǎng)殖池的物種差異較大。2.2.6 物種組成熱圖 為了比較樣本間的物種組成差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)各樣本的物種豐度分布趨勢(shì)的了解，使用屬水平的分類(lèi)單元組成作為分析對(duì)象，使用平均豐度前20位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖（圖5，見(jiàn)封三）。紅色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本高，藍(lán)色色塊代表該屬在該樣本中的豐度較其他樣本低。結(jié)果顯示在屬水平上，高氮水體與低氮水體的前20位物種豐度差異較大。透明球菌屬（Perlucidibaca）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、纖毛菌屬（Leptothrix）等在低氮養(yǎng)殖池豐度較高，而在高氮養(yǎng)殖池豐度較低。亮桿菌屬（Leucobacter）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、多核桿菌屬（Polynucleobacter）等在高氮養(yǎng)殖水體中豐度較高。高氮與低氮兩種養(yǎng)殖水體的氮濃度存在差異可能與水體中某些微生物特別是具有硝化反硝化功能的微生物的豐度相關(guān)。

2.2.7 LEfSe分析 為了尋找分組之間穩(wěn)健的差異物種，即標(biāo)志物種（biomarker），采用LEfSe （LDA Effect Size）進(jìn)行分析，生成組間豐度柱狀圖（圖6），用以展示標(biāo)志物種在不同分組樣品中的具體分布情況。亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、Ellin6067、mle1_7均屬于亞硝化單胞菌科，并且都只在低氮池中有分布，在高氮養(yǎng)殖池中均未發(fā)現(xiàn)存在。芽孢桿菌屬（Bacillus）在低氮池中的豐度比在高氮池的豐度高。氣單胞菌屬（Aeromonas）在高氮池中的豐度比在低氮池中的豐度高，檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）只在高氮池中有分布，在低氮池中未發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的存在。

2.2.8 菌群謝功能預(yù)測(cè) PICRUSt能將16S rRNA基因序列在KEGG功能譜數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行預(yù)測(cè)。代謝水平的結(jié)果（圖7）所示6個(gè)分組，包括代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、細(xì)胞進(jìn)程（Cellular Processes）、生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）和人類(lèi)疾病（Human Diseases），每一類(lèi)代謝通路又被進(jìn)一步劃分為多個(gè)等級(jí)。所有樣品的平均豐度以新陳代謝（Metabolism）所集聚的菌群數(shù)量最多，而在該等級(jí)中又以碳水化合物（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）的菌群為主，說(shuō)明養(yǎng)殖池內(nèi)有比較多的微生物參與分解了養(yǎng)殖水體中的糖類(lèi)、有機(jī)氮等物質(zhì)。

2.2.9 代謝通路差異分析 為了找出組間具有顯著差異的代謝通路，構(gòu)建組間差異代謝通路圖。PWY-7084代謝通路在低氮池與高氮池兩個(gè)分組中具有顯著差異（P<0.001）。PWY-7084代謝通路為硝化與反硝化過(guò)程（圖8），在兩個(gè)養(yǎng)殖池中亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）對(duì)硝化與反硝化過(guò)程的貢獻(xiàn)最大，而縱坐標(biāo)為代謝通路的相對(duì)豐度，在低氮池的中亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）豐富度高于高氮池，硝化與反硝化過(guò)程主要發(fā)生在低氮池。3 討論

采用擴(kuò)增子高通量測(cè)序方法對(duì)暗溫室中的高氮和低氮兩種養(yǎng)殖水體細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，并對(duì)水質(zhì)理化參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。經(jīng)調(diào)查，低氮池患病率明顯低于高氮池，而產(chǎn)量高于高氮池。兩種養(yǎng)殖水溫較為恒定，均在30 ℃左右，pH 值為7左右，溶解氧僅為0.25 mg/L左右，高氮池中的各個(gè)含氮指標(biāo)均相對(duì)較高，氮含量較高是高氮池內(nèi)水體污染嚴(yán)重的重要體現(xiàn)，水中殘餌以及代謝廢物無(wú)法分解，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中的氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度不斷升高，養(yǎng)殖水體的水質(zhì)嚴(yán)重惡化[9]，進(jìn)而影響中華鱉進(jìn)行正常的代謝活動(dòng)，致使患病幾率增加。雖然低氮水體的氮濃度指標(biāo)相較于高氮池低，但與中華鱉溫室養(yǎng)殖正常水質(zhì)[10-11]相比仍偏高，推測(cè)是養(yǎng)殖密度大、換水率和頻次偏低，導(dǎo)致有機(jī)物積累過(guò)多，由于好氧微生物需消耗大量的溶解氧，導(dǎo)致水中供氧不足，影響了氨氮氧化為亞硝態(tài)氮，進(jìn)而氧化為硝態(tài)氮的需氧反應(yīng)過(guò)程。

低氮養(yǎng)殖池與高氮養(yǎng)殖池相比在微生物多樣性上存在差異，高氮池的微生物種數(shù)低于低氮池。暗溫室透氣性差且溫度高，高蛋白飼料殘余不能降解造成養(yǎng)殖水體發(fā)黑有臭味[12]，水體中富含有機(jī)氮和糖類(lèi)，結(jié)果顯示在低氮池中存在一些微生物起到降解有機(jī)氮和糖類(lèi)的作用，進(jìn)而起到降低水體含氮量和富營(yíng)養(yǎng)化的作用。低氮池Chao1、香農(nóng)威納指數(shù)和辛普森指數(shù)均較高，說(shuō)明低氮水體細(xì)菌群落豐富度較高，且微生物生物多樣性也較高。

龜鱉傳染病中危害最大的是紅（白）底板病、腸炎病、白斑病、腐皮病、肺出血、疥瘡病等細(xì)菌性傳染病[13]。目前已經(jīng)從患病中華鱉體內(nèi)分離出致病菌有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、普通變形桿菌（proteus vulgaris）等。在高氮池中發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬（Aeromonas）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的存在且豐度較高，在低氮池中未檢測(cè)到檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的存在，氣單胞菌屬（Aeromonas）的豐度也比高氮池中低。推測(cè)高氮池中的中華鱉患病率高可能與其水體中的條件致病菌豐度較高密切相關(guān)。

養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，導(dǎo)致溶氧含量少，進(jìn)而導(dǎo)致氨態(tài)氮無(wú)法轉(zhuǎn)化，水體氮含量不斷積累，造成水體嚴(yán)重惡化[14-15]。而微生物防治以其成本低，無(wú)再污染的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用甚廣[16]。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，在土壤、海底污泥、養(yǎng)殖池塘中通過(guò)分離和培養(yǎng)可得到具有硝化作用、反硝化作用以及同步硝化與反硝化過(guò)程的菌株，被應(yīng)用于污水中，降氮效果明顯[17-19]。越來(lái)越多具有降氮效果的細(xì)菌從環(huán)境中分離出來(lái)，李泳洪[20]等人分離出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌降氮效果明顯，該菌屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。芽孢桿菌屬（Bacillus）在低氮池中豐度較高，而在高氮池中豐度較低。亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）與硝化與反硝化過(guò)程密切相關(guān)，該屬在低氮池中豐度較高，在高氮池中未發(fā)現(xiàn)其存在。推測(cè)低氮養(yǎng)殖池的氮含量相較于高氮養(yǎng)殖池較低是由于水體中具有降氮效果的細(xì)菌。養(yǎng)殖生產(chǎn)中可投放具有降解氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的菌株，在暗溫室養(yǎng)殖水體里可減少氮源污染，達(dá)到凈化水質(zhì)的作用，實(shí)現(xiàn)中華鱉健康養(yǎng)殖。

參考文獻(xiàn)：

[1]

王先鋒.中華鱉生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（16）：216-223.

[2] 王佩，廖學(xué)敏，王曉清，等.中華鱉三種養(yǎng)殖模式效益比較[J].科學(xué)養(yǎng)魚(yú)，2016（12）：34-35.

[3] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M].4版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

[4] BOWMAN J S， RASMUSSEN S， BLOM N， et al. Microbial community structure of Arctic multiyear sea ice and surface seawater by 454 sequencing of the 16S RNA gene [J].The ISME Journal： Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology，2012，6 （9）：11-20.

[5] 齊寧利，陳吳海，葉劍芝，等.海南黎家山蘭酒發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性分析[J].廣東化工，2020，47（20）：29-31.

[6] SHANNON C E.A mathematical theory of communication[J]. The Bell System Technical Journal， 1948，27（4）：623-656.

[7] CHAO A.Nonparametric estimation of the number of classes in a population[J].Scand.J. Statist，1984，11（4）：265-270.

[8] PANDYA P R ，SINGH K M ， PARNERKAR S，et al.Bacterial diversity in the rumen of Indian Surti buffalo （Bubalus bubalis），assessed by 16S rDNA analysis[J].Journal of Applied Genetics，2010，51（3）：395-402.

[9] 張建人.中華鱉溫室養(yǎng)殖中高濃度亞硝酸鹽等的形成與控制[J].生物技術(shù)世界，2013（09）：35.

[10] 何偉亮，鄭善堅(jiān).中華鱉溫室養(yǎng)殖水質(zhì)的處理措施[J].當(dāng)代水產(chǎn)， 2013（03）：72-73.

[11] ZHANG J， WANG F， JIANG Y L，et al. Modern greenhouse culture of juvenile soft-shelled turtle， Pelodiscus sinensi[J]. Aquaculture International，2017，25（4）：1607-1624.

[12] 王彥波，許梓榮，鄧岳松.水產(chǎn)養(yǎng)殖中氨氮和亞硝酸鹽氮的危害及治理[J].飼料工業(yè)，2002（12）：46-48.

[13] 張磊.中華鱉養(yǎng)殖水體的環(huán)境因子調(diào)查與機(jī)體致病菌研究[D].河北大學(xué)，2009.

[14] 趙宗升，劉鴻亮，李炳偉，等.高濃度氨氮廢水的高效生物脫氮途徑[J].中國(guó)給水排水，2001，17（05）：24-28.

[15] DUAN J M，F(xiàn)ANG H D，SU B，et al.Characterization of a halophilic heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium and its application on treatment of saline wastewater[J].Bioresource Technology，2015，179：421-428.

[16] 朱日同.集約化養(yǎng)殖水體氨氮危害及調(diào)控措施[J].河南水產(chǎn)，2018（03）：5-7.

[17] SI W G， LV Z G， XU C.Isolation of heterotrophic nitrifiers which can tolerate high concentration of ammonia-nitrogen and the optimization of their nitrogen removal efficiency in wastewater[J].Environmental Science， 2011， 32（11）：3448.

[18] ZHANG J B， WU P X， HAO B，et al.Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001[J].Bioresource Technology， 2011， 102（21）：9866-9869.

[19] LEI Y， WANG Y Q， LIU H J， et al.A novel heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacterium， Zobellella taiwanensis DN-7， can remove high-strength ammonium[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2016， 100（9）：4219-4229.

[20] 李泳洪，陳小嵐，許旭萍.異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Bacillus sp.JB4的分離鑒定試驗(yàn)[J].綠色科技，2016（16）：23-25.

Physico-chemical factors and microbial diversity analysis of water body in Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis dark greenhouse culture

CHANG Xiao1，ZHANG Ju1，ZHANG Yanqin1，YAN Baoguo2，GUAN Yueqiang1

（1.College of life sciences，Hebei University，Baoding 071002，China;2.Shijiazhuang Fisheries Technology Promotion Station，Shijiazhuang 050091，China）

Abstract：Dark greenhouse farming is one of the main methods of culture of Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis. In order to clarify physico-chemical index and the microbial diversity of aquaculture water， the water body of the high nitrogen （H-N） and lower nitrogen pond （L-N） in the dark greenhouse turtle farm in Luquan， Hebei Province were sampled， and the physic-chemical factors and microbial diversity of the water body was analyzed. The results showed that the temperature of the water was about 30? ℃ and pH value was about 7， which met the requirements of the turtle culture. The dissolved oxygen of the two kinds of aquaculture water was about 0.25 mg/L. The concentrations of total nitrogen and inorganic nitrogen in H-N water were higher than those in L-N water. In term of microbial diversity， the dominant flora between H-N and L-N water were differences at different taxons. At the phylum level， Chloroflexi was dominant in L-N water， while Proteobacteria was dominant in H-N water. At the genus level， the dominant genus in L-N water were Haliscomenobacter and Nitrosomonas，while Polynucleobacterium and Leucobacter were dominant in H-N water. There were differences in species richness and similarity between the two kinds of water. The results showed that the difference of total nitrogen and inorganic nitrogen concentration was significant between H-N and L-N water， and there was also a significant difference in microbial diversity. The different microbial flora might be one of the reason of the difference of nitrogen concentration in these two kinds of ponds.

Key words：Chinese soft-shelled turtle（Pelodiscus sinensis）;microbial diversity;dark greenhouse farming;physico-chemical factors;environmental modulation

（收稿日期：2020-12-04）