郝紅英　于正花　詹海鵑　劉萬毅　畢淑嫻

摘要 主要制備海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料（Alg-HKUST-1）微球進(jìn)行果膠酶的固定化，將海藻酸鈉以注射的方式加入到含有Cu2+的溶液中，通過金屬離子誘導(dǎo)自組裝，制備了海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料，其中MOFs顆粒分布均勻，嵌入在復(fù)合材料的表面上。復(fù)合材料的形狀是通過控制相應(yīng)的水凝膠形狀來控制的。通過利用掃描電鏡、FT-IR等技術(shù)分別對微球的表觀及性質(zhì)進(jìn)行了分析。果膠酶的固定化試驗主要考察了底物濃度、pH、溫度、時間等對果膠酶的影響。將游離果膠酶和固定化果膠酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較，主要結(jié)論是酶的最佳催化條件為自由酶pH=3.0，固定化酶pH=3.5;自由酶的反應(yīng)溫度為40 ℃，固定化酶的反應(yīng)溫度為50 ℃;最佳反應(yīng)時間為60 min。酶經(jīng)過載體固定化后，其儲存穩(wěn)定性有所提高。

關(guān)鍵詞 海藻酸鈉水凝膠; MOFs;果膠酶;固定化

中圖分類號 Q 814文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）23-0006-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.002

Study on the Sodium Alginate and MOFs Composite for Immobilized Pectinase

HAO Hong-ying，YU Zheng-hua，ZHAN Hai-juan et al

（State Key Laboratory of High-efficiency Utilization of Coal and Green Chemical Engineering，National Demonstration Center for Experimental Chemistry Education，College of Chemistry and Chemical Engineering，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750021）

Abstract To mainly prepare sodium alginate and MOFs composite material （Alg-HKUST-1） microspheres for immobilization of pectinase.Sodium alginate was added to the solution containing Cu2+ by injection， self-assembly was induced by metal ions， the sodium alginate and MOFs composites were prepared， where MOFs particles are evenly distributed and embedded on the surface of the composite material.The macroscopic shape of the composite can be designed by controlling the shape of the corresponding hydrogel.The apparent and properties of microspheres were analyzed by SEM and FT-IR techniques.The immobilization experiments of pectinase mainly investigated the effects of substrate concentration，pH，temperature and time on pectinase.And the enzymatic properties of free pectinase and immobilized pectinase were compared. The optimal catalytic conditions for the enzyme are free enzyme pH=3.0 and immobilized enzyme pH=3.5.The reaction temperature of the free enzyme is 40 ℃ and the reaction temperature of the immobilized enzyme is 50 ℃.The best response time is 60 min. After the enzyme has been immobilized by the carrier，its storage stability has been improved.

Key words Alginate hydrogel;MOFs;Pectinase;Immobilization

果膠酶是指催化植物細(xì)胞壁中果膠聚合物水解的多種酶的總稱[1]，廣泛存在于高等植物和微生物中，在某些原生動物和昆蟲中也有發(fā)現(xiàn)。果膠酶是果蔬汁加工業(yè)中最重要的一類酶，它可以有效地提高果蔬出汁率，改善過濾效果，增強(qiáng)澄清作用[2]。大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，酶催化反應(yīng)通常是在溶液中進(jìn)行，會有回收困難以及產(chǎn)品生化分離提純操作上的困難，增加生產(chǎn)工藝步驟，提高生產(chǎn)成本。而使用游離酶，酶反應(yīng)只能分批進(jìn)行，難以連續(xù)化、自動化操作。這嚴(yán)重地阻礙了酶工程的發(fā)展應(yīng)用。將游離酶固定化是克服上述缺點的方法之一[3-6]。

海藻酸鈉是存在于褐藻類中的天然高分子，是從褐藻或細(xì)菌中提取出的天然多糖，海藻酸鈉分子鏈的G塊易與二價金屬離子Ca2+、Ba2+等作用交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，形成“蛋盒”模型，將酶固定在凝膠網(wǎng)絡(luò)中[7-8]。這種線性高分子化合物含有自由的羧基和羥基，作為固定化酶載體，具有良好的生物相容性、生物降解性，傳質(zhì)性能好，成本低以及操作簡單等優(yōu)點[9-10]。由于海藻酸鈉本身性質(zhì)很不穩(wěn)定，無法長期保存，故采取復(fù)合改性措施。

MOFs是由無機(jī)金屬中心與橋連的有機(jī)配體通過自組裝相互連接，形成的一類具有周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的晶態(tài)多孔材料。MOFs是一種有機(jī)-無機(jī)雜化材料，也稱配位聚合物，兼有無機(jī)材料的剛性和有機(jī)材料的柔性特征。它具有高孔隙率、低密度、大比表面積、孔道規(guī)則、孔徑可調(diào)以及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)多樣性和可裁剪性等優(yōu)點[11-12]。

該研究以海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料作為酶的固定化載體，固定果膠酶并研究其催化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉、99%三水合硝酸銅、99% 1，3，5-三苯甲酸、N，N-二甲基甲酰胺：阿拉丁試劑;戊二醛：上海中秦化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇：煙臺市雙雙化工有限公司;果膠、果膠酶：上海瑞永生物科技有限公司;檸檬酸：徐州天鴻化工有限公司;檸檬酸鈉：上海廣諾化學(xué)科技有限公司;酒石酸鈉、3，5-二硝基水楊酸：上海中秦化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;苯酚：煙臺市雙雙化工有限公司;無水亞硫酸鈉：上海廣諾化學(xué)科技有限公司。

1.2 儀器

85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市城東新瑞儀器廠;JD200-4電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司;D2F-6050真空干燥箱：上?；厶﹥x器制造有限公司;KA-1.0離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;PSHJ-5酸度計：西安精密儀器儀表有限公司;SHA-C數(shù)顯恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司;ETS-D5 S25數(shù)顯型磁力加熱攪拌器：上海普赫光電科技有限公司。

1.3 固定化酶的制備及其性能研究

1.3.1 固定化酶載體制備。先將3 mL海藻酸鈉溶液用注射器以液滴的形式，注射到15 mL三水合硝酸銅溶液中，攪拌18 h，攪拌之后用蒸餾水和乙醇各洗2次，以除去多余的Cu2+。制得的Cu2+凝膠轉(zhuǎn)入15 mL 30 mg/mL 1，3，5-三苯甲酸溶液中，在85 ℃下讓MOFs生長反應(yīng)18 h。所得的MOFs復(fù)合物用乙醇和熱乙醇各洗滌2次，80 ℃干燥。再稱取0.5 g海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料，加入4%的戊二醛溶液10 mL，磁力攪拌10 h，攪拌之后用蒸餾水洗3次，除去多余的戊二醛。過濾并晾干，即得交聯(lián)的海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料載體[13]。

1.3.2 固定化酶的制備。

1.3.2.1 DNS試劑的配制。稱取3，5-二硝基水楊酸10 g溶于蒸餾水中，加入20 g氫氧化鈉、200 g酒石酸鉀鈉和500 mL水加熱溶解。之后加入5 g苯酚、5 g無水亞硫酸鈉，待全部溶解后定容至1 000 mL，儲存于棕色瓶中，放置7 d后使用。

1.3.2.2 pH為3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液的配制。稱取檸檬酸21.01 g溶解后定容至1 000 mL容量瓶中。稱取29.41 g檸檬酸鈉溶解后定容至1 000 mL容量瓶中。取一定量的檸檬酸、檸檬酸鈉混合，用pH計測定pH為3.5。

1.3.2.3 1%果膠溶液的配制。用分析天平稱取果膠1 g，用pH為3.5的緩沖溶液溶解，定容至100 mL容量瓶中。

1.3.2.4 1%膠酶溶液的配制。同果膠溶液的配制方法相同。

將一定的海藻酸鈉微球加入一定比例稀釋后的戊二醛溶液中，并置于磁力攪拌器上攪拌10 h，交聯(lián)之后用去離子水洗至中性。將上述載體加入1%的果膠酶溶液。在37 ℃恒溫振蕩器上反應(yīng)4 h，4 h之后取出，倒出上清液置于冰箱中保存，備測載酶量。沉淀先用蒸餾水洗滌，再用pH=3.5緩沖溶液洗滌，除去多余的戊二醛和游離酶，抽濾即得固定化酶。

1.3.3 固定化果膠酶酶活力及載酶量的測定。

1.3.3.1 固定化果膠酶活力測定。取2支25 mL比色管，將其進(jìn)行1、2編號，向1號比色管中加入海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料固定化果膠酶0.05 g，在40 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1%的果膠溶液1 mL、pH=3.5的緩沖溶液2 mL，向2號試管加入pH=3.5的緩沖溶液4 mL，2支比色管在40 ℃反應(yīng)30 min，取出，分別加入1 mol/L NaOH溶液5 mL、DNS試劑1.5 mL，沸水中煮沸5 min，立即冷卻，定容至25 mL，搖勻，以2號比色管為空白調(diào)零。在540 nm下測其吸光度。

1.3.3.2 載體載酶量的測定。取2 mL未固定上的果膠酶，加入1 mL果膠溶液，40 ℃水浴反應(yīng)30 min，反應(yīng)完之后加入1.5 mL DNS溶液，并在沸水中煮沸5 min，立即冷卻，定容至25 mL。以測標(biāo)準(zhǔn)曲線時的參比溶液為參比，測其吸光度。

經(jīng)測定，固定化果膠酶的載酶量為225.38 mg/g，比酶活為239.04 U/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的表征

圖1為海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料交聯(lián)前后的掃描電鏡圖，通過掃描電鏡研究海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料的形態(tài)。通過在80 ℃下直接干燥得到的樣品，由于干燥后發(fā)生收縮，在干燥的Cu2+交聯(lián)水凝膠的表面上看到褶皺。海藻酸鈉與MOFs水凝膠的表面和內(nèi)部出現(xiàn)類似于水凝膠的多孔結(jié)構(gòu)。交聯(lián)之前，載體的表面結(jié)構(gòu)比較緊密，表面凹凸不平，可有效增大比表面積，是固定化酶的優(yōu)良載體。從圖中可以看到海藻酸鈉與MOFs復(fù)合微球呈規(guī)則的球形，單分散性較好。交聯(lián)之后，復(fù)合微球的表面結(jié)構(gòu)變得疏松，由交聯(lián)前的圖1b到交聯(lián)后的圖1g可知，復(fù)合微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)被打開。這說明交聯(lián)后的載體能更好地和酶結(jié)合。

從FT-IR譜圖可以看出復(fù)合材料的官能團(tuán)特征峰明顯，1 613 cm-1處為海藻酸鈉的—COOH伸縮振動吸收峰，在1 035 cm-1處是海藻酸鈉的—OH吸收峰。1 022 cm-1和1 091 cm-1處為海藻酸鈉的—CO鍵的伸縮振動峰，1 711 cm-1處為1，3，5-三苯甲酸中羧酸CO雙鍵伸縮振動峰。3 400～2 500 cm-1處為海藻酸鈉的O—H鍵的伸縮振動吸收峰。1 240 cm-1和1 361 cm-1處為有機(jī)配體1，3，5-三苯甲酸中苯環(huán)的骨架振動吸收峰。在1 565 cm-1處出現(xiàn)了新的特征吸收峰，并且吸收峰明顯加強(qiáng)，這是因為發(fā)生了Schiff反應(yīng)形成了Schiff堿鍵（CN）的吸收峰，這表明海藻酸鈉與MOFs復(fù)合微球成功與戊二醛發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)。FT-IR譜圖如圖2。

2.2 不同酶濃度對酶活的影響 試驗分2組，一組分別依次加入10、20、30、40、50、60、70 mg/mL的自由酶1 mL;另一組依次加入固定不同酶濃度后的固定化酶0.03 g。繼續(xù)向2組比色管中分別加入pH=3.5緩沖液2 mL、1%果膠溶液1 mL;在40 ℃水浴中加熱30 min，加熱之后向2組比色管分別加入1 mol/L NaOH溶液5 mL、DNS試劑1.5 mL，在沸水中加熱5 min滅活。

由圖3可知，自由酶的最佳酶濃度為10 mg/mL，而固定化酶的最佳酶濃度為20 mg/mL，酶是一種活性蛋白，當(dāng)酶的濃度較小，底物濃度大于酶時，酶濃度與反應(yīng)速度成正比;當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，酶濃度繼續(xù)增加到一定值以后，其反應(yīng)速度并不加快[14]。由于上述關(guān)系，過大地增加用酶量不能收到預(yù)期效果。若在載體上加過多的酶量，則酶在載體的結(jié)合點趨于飽和，會堵在載體的表面或網(wǎng)孔里，造成底物擴(kuò)散困難，難與活性中心接近，故酶活降低。

2.3 不同溫度對固定化酶活力的影響

分別在25、30、35、40、45、50、60 ℃時測定固定化酶和自由酶的酶活，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，游離果膠酶的最適溫度為40 ℃，固定化果膠酶的最適溫度提高到50 ℃，表明固定化后其耐熱性有所提高。酶對溫度很敏感，升高溫度可改變酶促反應(yīng)速度。在最適溫度時，酶活最高，而偏離此溫度時，酶活變小，且溫度過高會使酶變性失活。

2.4 不同pH對酶活力的影響

分別在pH為2.6、3.0、3.5、40、4.5、5.0、5.5時測定自由酶和固定化酶的活力，結(jié)果如圖5。

pH可改變底物的帶電狀態(tài)，從而影響底物分子與酶的結(jié)合。由圖5可以看出，游離果膠酶pH在2.5～3.0時，游離酶活力隨著pH的增加而增大;而最適pH為3.0，pH大于30時，酶活隨pH增加而下降。pH在2.6～3.5時，固定化果膠酶活力隨著pH的增大而增加，但在pH大于35時呈下降趨勢，故固定化果膠酶的最適pH為3.5。可以看出pH是果膠酶固定化的一個重要影響因素。

2.5 不同反應(yīng)時間對酶活力的影響

分別在反應(yīng)時間為15、30、45、60、90、120、150 min時測定其對酶活力的影響（圖6）。

由圖6可知，游離果膠酶和固定果膠酶的最佳反應(yīng)時間為60 min，反應(yīng)時間是對酶很重要的影響因素。固定化時間超過60 min時，酶活力呈下降趨勢。這是因為如果反應(yīng)時間過長酶會失去活性，結(jié)果是多余的酶會吸附在載體表面上，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)孔堵塞，酶蛋白分子相互屏蔽，酶與底物難契合，故而酶活力下降。

2.6 不同果膠濃度對酶活力的影響

配制0.2、0.5、0.8、10、1.2、1.5、2.0 mg/mL的果膠，測定固定化酶和自由酶的酶活，結(jié)果如圖7。

由圖7可知，對于自由酶，當(dāng)果膠濃度為1.5 mg/mL時，酶活最高;當(dāng)大于1.5 mg/mL時，酶活趨于穩(wěn)定。對于固定化酶，當(dāng)果膠濃度為1.0 mg/mL時，酶活最高;當(dāng)果膠濃度大于1.0 mg/mL時，酶活急劇下降。

2.7 固定化果膠酶的儲存穩(wěn)定性 將固定化酶和游離酶在4 ℃保存，經(jīng)1、5、10、15、20、25、30 d，測其酶活力（圖8）。

以第1天測得的酶活力為標(biāo)準(zhǔn)100%，由圖8可知，自由酶和固定化酶的酶活都隨天數(shù)的增加有所下降，固定化酶在

4 ℃保存30 d后，酶活力為85.16%，而自由酶活力為7602%，說明果膠酶經(jīng)過載體固定后，儲存穩(wěn)定性提高。

3 結(jié)論

以pH、溫度、時間、酶濃度和果膠濃度為因素進(jìn)行單因素試驗，探討了固定化酶的最佳催化條件。自由酶的最佳pH為3.0，而固定化酶相對于自由酶范圍變大，為3.5。這是因為酶是由酶蛋白組成的，其催化能力對外部環(huán)境尤其pH很敏感。酶固定化后，對底物作用的最適pH曲線會發(fā)生偏移。曲線偏移是因為微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響。一般來說，若固酶載體帶負(fù)電荷，則最適pH對于游離酶來說會偏高。而海藻酸鈉是帶負(fù)電荷，故最適pH發(fā)生偏移。自由酶的最佳反應(yīng)溫度為40 ℃，而固定化酶相對于自由酶反應(yīng)溫度提高到50 ℃，說明其耐熱性提高。最佳反應(yīng)時間為60 min。對于酶促反應(yīng)動力學(xué)，固定化酶的Km小于游離酶的Km，說明果膠酶經(jīng)海藻酸鈉與MOFs復(fù)合材料固定化后對底物的親和力增大。果膠酶經(jīng)過載體固定化后，其儲存穩(wěn)定性有所提高。

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基金項目 國家自然科學(xué)基金項目（21467022）;寧夏自然科學(xué)基金項目（NZ17048）;寧夏“化學(xué)工程與技術(shù)”國內(nèi)一流學(xué)科建設(shè)項目（NXYLXK2017A04）;寧夏大學(xué)西部一流大學(xué)建設(shè)項目（ZKZD2017003）。

作者簡介 郝紅英（1997—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士研究生，研究方向：利用復(fù)合材料固定酶。*通信作者，副教授，從事利用復(fù)合材料固定酶研究。

收稿日期 2020-09-07