姚強(qiáng) 宮志遠(yuǎn) 司洪宇 黃春燕 韓建東 梁曉輝 張元祺 李瑾 謝紅艷

摘要：針對山東地區(qū)金針菇工廠化、規(guī)?；a(chǎn)實際，以當(dāng)?shù)刂髟园咨疳樄狡贩N為供試菌株，以菌絲球直徑、密度及菌絲體干重為檢測指標(biāo)，以不同材料的碳源、氮源、維生素為影響因素，研究篩選適合本地生產(chǎn)的金針菇液體菌種培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明：適宜金針菇栽培的最佳液體菌種培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉3%、豆奶寶0.33%、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.080%、硫酸鎂（MgSO4）0.075%和VB2? 50 mg/L。

關(guān)鍵詞：白色金針菇;液體菌種;培養(yǎng)基

中圖分類號：S646.1+5? 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A? 文章編號：1001-4942（2020）11-0134-04

Formula Development and Application of Liquid Strain of

〖WTHX〗Flammulina velutipes in Factory Production

Yao Qiang1，Gong Zhiyuan1，Si Hongyu2，Huang Chunyan1，Han Jiandong1，

Liang Xiaohui2，Zhang Yuanqi1，Li Jin1，Xie Hongyan1

（1.Institute of Agricultural Resources and Environment， Shandong Academy of Agricultural

Sciences/ Key Laboratory of Wastes Matrix Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Jinan 250100， China;

2.Energy Research Institute of Shandong Academy of Sciences/ Shandong Key

Laboratory of Biomass Gasification Technology， Jinan 250000， China）

Abstract Aiming at the factory and large-scale production of Flammulina velutipes in Shandong area， the local main cultivated white Flammulina velutipes variety was used as test strain， the diameter， density and dry weight of mycelium were used as detection indicators， and the carbon source， nitrogen source and vitamins were as the influencing factors to screen out the formula of Flammulina velutipes liquid culture medium suitable for local production. The results showed that the best liquid culture medium formula for Flammulina velutipes was 3% of soluble starch，0.33% of soy milk treasure， 0.080% of potassium dihydrogen phosphate （KH2PO4），0.075% of magnesium sulfate （MgSO4） and 50 mg/L VB2 .

Keywords White Flammulina velutipes; Liquid strain; Culture medium

我國是最早人工栽培金針菇的國家。傳統(tǒng)的固體栽培模式受各方面條件和季節(jié)性限制較強(qiáng)，生產(chǎn)周期長，操作步驟繁瑣，難以大規(guī)模機(jī)械化生產(chǎn)，制約著整個金針菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，食用菌工廠化生產(chǎn)以金針菇發(fā)展最為迅速[1-3]。白色金針菇（Flammulina velutipes）是一種低溫型、含鋅等微量元素高的優(yōu)質(zhì)食用菌[4，5]，屬真菌門擔(dān)子菌亞門蘑菇目口蘑科類火菇屬，又有冬菇、金菇、構(gòu)菌、毛柄類火菇、樸菇、智力菇之稱，也是一種多糖類物質(zhì)豐富、高蛋白低熱量的保健性食品，具有食療及藥用效果[6-10]。

目前金針菇生產(chǎn)主要為液體菌種栽培模式，具有生長周期短、出菇整齊、產(chǎn)量穩(wěn)定、成本低廉、效率高等優(yōu)點而被廣泛認(rèn)可[11-13]。此外液體菌種有發(fā)育菌齡一致、操作便利、分散性強(qiáng)等特點，為金針菇規(guī)模化、機(jī)械化生產(chǎn)提供了良好條件[14，15]。液體菌種栽培模式是金針菇產(chǎn)業(yè)一個重要應(yīng)用[16]，如何給予菌絲體最適生長環(huán)境、最適營養(yǎng)配比，使菇產(chǎn)量、菇品質(zhì)達(dá)到理想狀態(tài)，是金針菇精準(zhǔn)化生產(chǎn)的重要研究方向之一。本試驗針對山東地區(qū)金針菇工廠化、規(guī)?；a(chǎn)實際，以當(dāng)?shù)刂髟园咨疳樄狡贩N為供試菌株，以菌絲球直徑、密度及菌絲體干重為檢測指標(biāo)，以不同材料的碳源、氮源、維生素為影響因素，研究篩選適合本地生產(chǎn)的金針菇液體菌種培養(yǎng)基配方，以期為金針菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019年在山東省友碩生物科技股份有限公司進(jìn)行。

1.1.1 菌種 白色金針菇（Flammulina velutipes）SDM-12，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所保藏并提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①斜面培養(yǎng)基[17]：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。②碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：豆粕0.33%，硫酸鎂0.075%，磷酸二氫鉀0.080%，VB1 50 mg/L，pH自然。③氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：白砂糖3%，硫酸鎂0.075%，磷酸二氫鉀0.080%，VB1 50 mg/L，pH自然。④維生素篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：白砂糖3%，豆粕0.33%，硫酸鎂0.075%，磷酸二氫鉀0.080%，pH自然。所用原料均為普通市售原料。

1.1.3 儀器設(shè)備 主要有超凈工作臺、生化恒溫培養(yǎng)箱、全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、500 mL三角瓶若干、試管若干、電子分析天平。

1.2 培養(yǎng)方法

取出試驗所用菌種，無菌條件下轉(zhuǎn)接試管，25℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，挑選菌絲濃密、粗壯、無污染的試管種備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同碳源液體培養(yǎng)基對金針菇菌絲生長的影響 在各供試碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加3%的葡萄糖、麥芽糖、白砂糖、可溶性淀粉、乳糖，試驗設(shè)置3個平行。置往復(fù)式搖床20℃、190 r/min培養(yǎng)7 d后，檢測菌絲球干質(zhì)量，確定最適碳源。

1.3.2 不同氮源液體培養(yǎng)基對金針菇菌絲生長的影響 在各供試氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.33%的豆面、豆粕、豆奶寶、蛋白胨、玉米粉，試驗設(shè)置3個平行。置往復(fù)式搖床20℃、190 r/min培養(yǎng)7 d后，檢測菌絲球干質(zhì)量，確定最適氮源。

1.3.3 添加不同維生素的液體培養(yǎng)基對金針菇菌絲生長的影響 在各供試維生素篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加30 mg/L的VB1、VB2、VB6，試驗設(shè)置3個平行。置往復(fù)式搖床20℃、190 r/min培養(yǎng)7 d后，檢測菌絲球干質(zhì)量，確定最適維生素。

1.4 指標(biāo)檢測[18，19]

菌絲球密度計數(shù)法：取培養(yǎng)液1 mL，用無菌水稀釋至10 mL，均勻后取1 mL平涂于平皿中，平皿底部襯深色背景計數(shù)。

菌絲球干重法：取培養(yǎng)液100 mL，經(jīng)80目網(wǎng)篩過濾，洗滌至水變清后把菌絲放置在恒重過的定性濾紙上面，再置于80℃恒溫干燥箱中烘至恒重稱重（期間2～3次測重，直至各次測重相同或差別在允許誤差范圍內(nèi)達(dá)標(biāo)）。

pH值用pH計測定。

生長指標(biāo)觀測：培養(yǎng)7 d后觀察各搖瓶中菌絲球大小、密度。菌絲球密集、體積多為5 mm以下均勻分布者菌絲生長情況則為良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對菌絲生長的影響

由表1、圖1可知，不同碳源對于菌絲生長的影響差異明顯。其中可溶性淀粉作為培養(yǎng)基碳源時菌絲干重為0.0167 g/mL，pH為6.30，菌絲球小、密度大，菌液清亮，生長快;麥芽糖和白砂糖作為培養(yǎng)基碳源時效果相近，菌絲干重分別為0.0136、0.0122 g/mL，pH分別為6.44、6.58;乳糖和葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源時菌絲干重分別為0.0094、0.0116 g/mL，pH分別為6.26、6.72。不同碳源對菌絲生長的影響大小依次為：可溶性淀粉>麥芽糖>白砂糖>葡萄糖>乳糖，其中白砂糖成本最低。因此，金針菇工廠化生產(chǎn)過程中液體菌種制備培養(yǎng)基碳源首選可溶性淀粉，其次為白砂糖。

2.2 不同氮源對菌絲生長的影響

由表2可知，豆奶寶作為培養(yǎng)基氮源效果最好，菌絲干重為0.0173 g/mL，且菌絲球小、密度大，菌液清，菌絲生長快;玉米粉作為培養(yǎng)基氮源，菌絲干重為0.0158 g/mL;豆面和豆粕作為培養(yǎng)基氮源，菌絲干重分別為0.0127、0.0155 g/mL;蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源，菌絲干重為0.0151 g/mL。不同氮源對于菌絲生長的影響大小依次為：豆奶寶>玉米粉>豆粕>蛋白胨>豆面。

豆奶寶是以大豆為原料，經(jīng)過粉碎、去皮、浸提、分離、洗滌、干燥等加工工藝，去除其油脂、低分子可溶性非蛋白組分后所制得的含有65%（干基）以上蛋白質(zhì)的產(chǎn)品。玉米粉內(nèi)含大量生物素，可為金針菇提供所需的維生素等。而豆粕因其來源及提取工藝差異影響，營養(yǎng)成分有所不同;豆面則由大豆直接粉碎而成，其成分最為復(fù)雜且蛋白質(zhì)含量最低。早期研究表明豆面和豆粕中含有能抑制菌絲生長的抗胰蛋白酶等物質(zhì)。本試驗經(jīng)對比分析，表明作為氮源以豆奶寶效果為佳，其次為玉米粉。

2.3 不同B族維生素對菌絲生長的影響

由表3可知，B族維生素中，VB2對金針菇菌絲生長效果最好，菌絲干重為0.0121 g/mL，且菌液中菌絲球小，密度大，菌液清亮，菌絲生長快;VB6同空白對照對菌絲生長效果不大。B族維生素對于菌絲生長的影響大小依次為：VB2>VB1>VB6。本試驗表明維生素添加以VB2效果為佳。

3 討論與結(jié)論

金針菇屬于低溫型木腐菌，不同的碳源、氮源種類包括環(huán)境條件等因素都對其良好生長發(fā)育有著直接影響。金針菇屬于B族維生素缺陷型菌株，B族維生素的補(bǔ)充對其菌絲生長發(fā)育有很大影響。本試驗基于金針菇菌株特殊營養(yǎng)需求所作研究表明，適宜金針菇栽培的最佳液體菌種培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉3%、豆奶寶0.33%、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.080%、硫酸鎂（MgSO4）0.075%、VB2 50 mg/L。此配方培養(yǎng)的液體菌種菌絲球大小適中、密度大，菌液清亮且菌絲生長快，有金針菇特有的清香氣息。按照本試驗所述培養(yǎng)環(huán)境條件培養(yǎng)6～7 d即可達(dá)到要求。該試驗培養(yǎng)1～2 d時菌絲生長緩慢，未見有特殊效果，屬于菌絲萌發(fā)期;2～4 d時菌絲生長進(jìn)入快速期，菌絲生長活力達(dá)到頂峰，5～7 d時隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗和生長空間等環(huán)境因素的影響，菌絲生長速率下降并且趨于穩(wěn)定，菌絲球密度達(dá)到最適。該結(jié)果與郭欣欣[20]、張怡[21]等的研究結(jié)果相吻合，也進(jìn)一步闡釋了本試驗結(jié)果的適宜性。此外，在工廠化生產(chǎn)過程中，由于配方成分對于無機(jī)鹽、維生素所需量較少，加上稱量儀器的準(zhǔn)確性有所不同等外在因素而導(dǎo)致存在偏差，可能對試驗結(jié)果也有一定影響。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Du H J，Hu Q H，Yang W J，et al. Development，physiochemical characterization and forming? mechanism of Flammulina velutipes polysaccharide-based edible films[J]. Carbohydrate Polymers，2016，152：214-221.

[2] 于淑艷，張莉弘，吳瓊，等. 金針菇渣粉雙螺桿擠壓膨化工藝[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35（5）：606-609.

[3] 張介馳，孔祥輝，張丕奇，等. 金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因克隆及其表達(dá)[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，29（5）：495-498.

[4] 張愛龍，趙飛，金周雨，等. 金針菇多糖抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2019，41（5）：521-525.

[5] 伍明，鄭林用，許曉燕，等. 金針菇活性物質(zhì)及其作用研究進(jìn)展[J]. 中國食用菌，2011（3）：6-8.

[6] 黃竹青，鄭劍玲，鄧鐵紅，等. 白色金針菇液體菌種制備及工廠化生產(chǎn)應(yīng)用初探[J].微生物雜志，2013，33（2）：75-79.

[7] 張丹，顏夢秋，劉建雨，等. 金針菇菌種中短期保藏因素的正交分析[J]. 微生物學(xué)通報，2018，45（6）：1375-1383.

[8] 胡忠玲. 生態(tài)環(huán)境保護(hù)對金針菇增產(chǎn)效應(yīng)的影響分析[J]. 中國食用菌，2019，38（9）：116-119.

[9] 鄭若男，邱東鳳，陳梁軍. 金針菇生產(chǎn)副產(chǎn)品功能性成分提取研究進(jìn)展[J]. 廣東化工，2019，46（16）：115-116，130.

[10]楊和川，譚一羅，蘇文英，等. 29株金針菇菌株菌絲生長特性比較[J]. 現(xiàn)代園藝，2019（21）：64-65，77.

[11]弓建國. 食用菌栽培技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2011.

[12]譚一羅，蘇文英，王朝暉，等. 工廠化金針菇菌株液體培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵科技，2019，55（1）：35-37，43.

[13]王玉，黃亮，彭明夢，等. 白色金針菇液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 北方園藝，2018（20）：148-153.

[14]徐磊. 適宜生產(chǎn)金針菇液體菌種的菌株培養(yǎng)及篩選研究[J]. 食品安全導(dǎo)刊，2017（36）：124.

[15]陳金花，張作法，呂國英，等. 金針菇液體菌種技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食藥用菌，2016，24（1）：38-40.

[16]徐學(xué)鋒，沈敏，譚明艷，等. 金針菇液體菌種培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 長江蔬菜，2013（16）：46-49.

[17]劉紅紅. 真姬菇SK-01胞外多糖與胞內(nèi)多糖的提取及其抗氧化活性[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[18]高淑敏. 金針菇液體菌種培養(yǎng)液配方篩選試驗[J]. 北方園藝，2011（12）：154-156.

[19]張鵬，許占伍，倪小軍，等. 金針菇工廠化生產(chǎn)液體菌種培養(yǎng)基的配方研究[J]. 食藥用菌，2012，20（5）：296-297.

[20]郭欣欣，樊淑華，王永立. 金針菇液體培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J]. 北方園藝，2014（2）：146-148.

[21]張怡，王玉，班立桐，等. 白色金針菇搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J]. 中國釀造，2016，35（11）：136-139.