蒲俊安 張思敏 劉夢(mèng)嬌 肖望重 楊磊

摘 要 目的：建立測(cè)定何首烏中二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚和總多糖含量的方法，并優(yōu)化何首烏傳統(tǒng)九蒸九曬的炮制工藝。方法：采用高效液相色譜法檢測(cè)二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量;采用紫外分光光度法檢測(cè)總多糖的含量。以蒸制時(shí)間、烘制時(shí)間、烘制溫度為自變量，二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚和總多糖含量為指標(biāo)，結(jié)合加權(quán)綜合評(píng)分法和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化何首烏九蒸九曬的炮制工藝并驗(yàn)證。結(jié)果：二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚檢測(cè)進(jìn)樣量的線性范圍分別為0.27～2.7 ?g（r=0.997 1）、0.063～0.63 ?g（r=0.999 9）、0.038～0.38 ?g（r=0.990 9），總多糖檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2.07～12.42 ?g/mL（r=0.999 6）;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%;加樣回收率分別為99.43%～101.06%（RSD=0.63%，n=6）、98.74%～120.33%（RSD=1.34%，n=6）、98.39%～102.44%（RSD=1.49%，n=6）、99.51%～101.98%（RSD=0.87%，n=6）。最優(yōu)炮制工藝為蒸制時(shí)間4.5 h、烘制時(shí)間9 h、烘制溫度66 ℃，反復(fù)炮制9次。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，最優(yōu)炮制工藝的平均綜合評(píng)分為35.69分，與預(yù)測(cè)值（36.90分）的相對(duì)誤差為3.30%。結(jié)論：所建含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好;優(yōu)化所得炮制工藝預(yù)測(cè)性良好且穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 何首烏;九蒸九曬;星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法;高效液相色譜法;紫外分光光度法;炮制工藝;含量測(cè)定;工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào) R283.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）22-2713-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish methods for the content determination of stilbene glycoside， emodin， emodin methyl ether and total polysaccharide in P. multiflorum， and to optimize the processing technology of traditional nine-time repeat steaming and sun-drying process of P. multiflorum. METHODS： HPLC method was adopted to determine the contents of stilbene glycoside， emodin， and emodin methyl ether. The content of total polysaccharide was determined by UV spectrometry. With steaming time， drying time and drying temperature as independent variables， the contents of stilbene glycoside， emodin， emodin methyl ether and total polysaccharide as indexes， the processing technology of nine-time repeat steaming and sun-drying process of P. multiflorum was optimized by weighted comprehensive score method and central composite design-response surface method， and the validation tests were conducted. RESULTS： The linear range of sample size of stilbene glycoside， emodin and emodin methyl ether were 0.27-2.7 ?g（r=0.997 1）， 0.063-0.63 ?g（r=0.999 9）， 0.038-0.38 ?g（r=0.990 9）， respectively. The linear range of mass concentration of total polysaccharide was 2.07-12.42 ?g/mL（r=0.999 6）， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 99.43%-101.06%（RSD=0.63%，n=6）， 98.74%-120.33%（RSD=1.34%，n=6）， 98.39%-102.44%（RSD=1.49%，n=6）， 99.51%-101.98%（RSD=0.87%，n=6）， respectively. The optimal processing technology was steaming time for 4.5 h， drying time for 9 h， drying temperatrue for 66 ℃ and repeat processing for 9 times. Results of 3 times of validation tests showed that the comprehensive score of optimal technology was 35.69， relative error of which to predicted value （36.90） was 3.30%. CONCLUSIONS： Established method is simple and reproducible， and the optimal processing technology is predicive， stable feasible.

KEYWORDS? ?Polygonum multiflorum; Nine-time repeat steaming and sun-drying process; Central composite design- response surface methodology; HPLC; UV spectrometry; Processing technology; Content determination; Technology optimization

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，其生品具有解毒、消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便的功效，炮制品則具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁、降脂等作用[1]，臨床應(yīng)用廣泛。近年來(lái)，有關(guān)何首烏肝毒性的不良反應(yīng)報(bào)道日益增多[2-4]，使其用藥安全受到質(zhì)疑，因此何首烏的炮制方法受到學(xué)者普遍關(guān)注。九蒸九曬是何首烏的傳統(tǒng)炮制方法[5]，該炮制方法較2015年版《中國(guó)藥典》（一部）收載的制何首烏蒸法（清蒸或黑豆汁拌勻后蒸至內(nèi)外均為棕褐色）[1]更加細(xì)致、復(fù)雜。本課題組前期研究以及相關(guān)文獻(xiàn)均初步證實(shí)，經(jīng)九蒸九曬后，何首烏的肝毒性較生品降低[6-7]，但這一炮制工藝尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，炮制流程有待規(guī)范。何首烏成分較復(fù)雜，主要含有蒽醌類、黃酮類、甾體類、二苯乙烯苷等成分[8]?，F(xiàn)代研究表明，二苯乙烯苷、游離蒽醌類及多糖類成分均具有抗衰老、抗氧化等藥理作用[8]，且多糖類成分還具有調(diào)劑免疫的作用[9]，故其炮制工藝研究多以二苯乙烯苷、游離蒽醌或多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)[10-11]，但鮮有將3者同時(shí)作為炮制工藝考察指標(biāo)的報(bào)道。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法因具有精密度好、可信度高、試驗(yàn)次數(shù)少、應(yīng)用方便等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于中藥炮制工藝的篩選研究[12-14]。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量，采用紫外分光光度法（UV）測(cè)定總多糖的含量;以蒸制時(shí)間、烘制時(shí)間、烘制溫度為自變量，二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚和總多糖含量為指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合加權(quán)綜合評(píng)分法和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)何首烏九蒸九曬的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為該炮制工藝的科學(xué)化與規(guī)范化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity Ⅱ型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、LC1260色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）;UV-9000S型UV計(jì)（上海元析儀器有限公司）;XMTB-8000型干燥箱（余姚市金宏儀器廠）;AR2140型萬(wàn)分之一電子分析天平（上海海鴻儀器有限公司）;SK5200H型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：53 kHz）;TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）;DMD-J-24型經(jīng)濟(jì)型節(jié)能蒸柜（廣州市多美多廚房設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

何首烏藥材（湖南南國(guó)藥都中藥飲片有限公司，批號(hào)：20180285）、黑豆飲片（湖南三湘中藥飲片有限公司，批號(hào)：20180613）經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部張志國(guó)教授鑒定分別為何首烏P. multiflorum Thunb.的干燥塊根、黑豆Glycine max（L.） Merr.的干燥成熟種子;二苯乙烯苷對(duì)照品（批號(hào)：110844-201915，純度：≥98%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201913，純度：≥98%）、D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833- 201908，純度：≥98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201817，純度：≥98%）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司;乙腈、甲醇、乙醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 何首烏九蒸九曬樣品的制備

參考前期試驗(yàn)方法[6]，取何首烏藥材10 kg，加入黑豆汁2.5 kg（取黑豆1 kg，加水5 kg，置于節(jié)能蒸柜中煎煮所得）攪拌均勻，待黑豆汁全部吸收，平均分成20份，分別按后續(xù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法設(shè)計(jì)相應(yīng)試驗(yàn)條件重復(fù)蒸制9次，即得樣品20批（編號(hào)：S1～S20）。

2.2 二苯乙烯苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-水（25 ∶ 75，V/V）;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取二苯乙烯苷對(duì)照品2.7 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入50%乙醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.27 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品，粉碎后取粉末0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 空白對(duì)照溶液 以50%乙醇為空白對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述空白對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，二苯乙烯苷對(duì)應(yīng)色譜峰的分離度為4.71，理論板數(shù)為8 366，與其余成分均基線分離，且空白對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入50%乙醇稀釋并定容，制得不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以二苯乙烯苷進(jìn)樣量（X，?g）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，二苯乙烯苷的回歸方程Y=256.45X+1 364.9（r=0.997 1），表明二苯乙烯苷檢測(cè)進(jìn)樣量的線性范圍為0.27～2.7 ?g。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）粉末0.2 g，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，二苯乙烯苷含量的RSD為0.99%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，二苯乙烯苷峰面積的RSD為1.08%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）粉末0.2 g，共6份，加入二苯乙烯苷對(duì)照品2.230 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取20批“2.1”項(xiàng)下九蒸九曬樣品粉末適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。

2.3 游離蒽醌的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（80 ∶ 20，V/V）;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇溶解并定容，制成大黃素、大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為63.0、38.4 ?g/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品粉末1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液 以甲醇為陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述陰性對(duì)照溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖2。由圖2可知，大黃素對(duì)應(yīng)色譜峰的分離度為2.32，理論板數(shù)為13 513;大黃素甲醚對(duì)應(yīng)色譜峰的分離度為20.33，理論板數(shù)為16 212;與其余成分均基線分離，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.3.6 線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋并定容，制得不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 “2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以各待測(cè)成分進(jìn)樣量（X，?g）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，大黃素、大黃素甲醚的回歸方程分別為Y=202.04X-0.652 2（r=0.999 9），Y=56.176X+0.311 9（r=0.990 9），表明大黃素、大黃素甲醚檢測(cè)進(jìn)樣量的線性范圍分別為0.063～0.63、0.038～0.38 ?g。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.19%、0.99%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）粉末1 g，共6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，大黃素、大黃素甲醚含量的RSD分別為1.62%、1.31%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.51%、1.27%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）粉末1 g，共6份，加入大黃素對(duì)照品1.290 mg、大黃素甲醚對(duì)照品0.890 mg，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.3.11 樣品含量測(cè)定 取20批“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品粉末適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。

2.4 總多糖的含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取干燥至恒定質(zhì)量的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水稀釋，制成質(zhì)量濃度為0.207 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品粉末1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入95%乙醇20 mL，加熱回流2 h，濾過(guò)，濾渣經(jīng)95%乙醇洗滌3次并揮干，加水25 mL，于70 ℃超聲提取50 min，放冷，以2 000 r/min離心5 min，取上清液，重復(fù)超聲提取2次，合并上清液，取1 mL，加水定容至100 mL量瓶中，即得。

2.4.3 陰性對(duì)照溶液 取6%苯酚溶液1 mL、硫酸5 mL，置于10 mL具塞比色管中，加水至刻度，混勻，即得。

2.4.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密吸取上述對(duì)照品溶液0.5 mL、供試品溶液1.0 mL，分別置于10 mL具塞比色管中，精密加入6%苯酚溶液1 mL，混勻;加入硫酸5 mL，混勻;加水至刻度，混勻。另取陰性對(duì)照溶液10 mL。將上述溶液分別置于水浴中顯色15 min后，于300～700 nm全波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果，對(duì)照品與供試品在490 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，陰性對(duì)照無(wú)干擾，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm，詳見圖3。

2.4.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，按“2.4.4”項(xiàng)下方法顯色后，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度（X，?g/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，D-無(wú)水葡萄糖的回歸方程為Y=1.225 3X+0.074（r=0.999 6），表明D-無(wú)水葡萄糖檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為2.07～12.42 ?g/mL。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取“2.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5 mL，按“2.4.4”項(xiàng)下方法顯色后，于490 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果，D-無(wú)水葡萄糖吸光度的RSD為1.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）粉末1 g，共6份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.4”項(xiàng)下方法顯色后，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，總多糖含量（以D-無(wú)水葡萄糖計(jì)）的RSD為1.52%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）適量，按“2.4.4”項(xiàng)下方法顯色，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，D-無(wú)水葡萄糖吸光度的RSD為0.82%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的“2.1”項(xiàng)下何首烏九蒸九曬樣品（編號(hào)：S5，星點(diǎn)設(shè)計(jì)序號(hào)：5）粉末1 g，共6份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液;取1 mL，置于具塞比色管中，加入D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液適量，按“2.4.4”項(xiàng)下方法顯色后，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.5 炮制工藝的優(yōu)化

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理[15-16]，并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以蒸制時(shí)間（A）、烘制時(shí)間（B）、烘制溫度（C）為自變量，二苯乙烯苷、游離蒽醌（大黃素、大黃素甲醚含量合計(jì)值）、總多糖含量為指標(biāo);同時(shí)，結(jié)合加權(quán)評(píng)分法，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7，9]及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行權(quán)重處理，最終確定綜合評(píng)分計(jì)算公式為：Y=Y1×30/Y（1max）+Y2×30/Y（2max）-Y3×40/Y（3max）。式中，Y為綜合評(píng)分，Y1為各樣品檢測(cè)所得游離蒽醌含量，Y2為各樣品檢測(cè)所得多糖含量，Y3為各樣品檢測(cè)所得二苯乙烯苷含量，Y（nmax）為檢測(cè)所得相應(yīng)成分含量的最大值;綜合評(píng)分越高表示主要藥效成分（游離蒽醌、總多糖）含量越高、毒性成分（二苯乙烯苷）含量越低[8]。采用Design-Expert 7.0.1.0軟件進(jìn)行3因素5水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)（α=1.732），因素與水平見表4，試驗(yàn)方案與結(jié)果見表5。

2.5.2 模型擬合 根據(jù)表5結(jié)果，以綜合評(píng)分（Y）為因變量，采用Design-Expert 7.0.1.0軟件進(jìn)行多元非線性回歸擬合，得二次多項(xiàng)式方程為Y=21.68+3.26A+2.95B+3.50C-1.80AB+2.53AC-1.56BC+2.75A2+2.00B2+0.77C2。該模型的擬合決定系數(shù)（R2）為0.811 6，模型的P<0.05，說(shuō)明模型具有顯著性;失擬項(xiàng)P>0.05，說(shuō)明模型擬合良好。對(duì)響應(yīng)值作用顯著性順序依次為C>A>B;交互項(xiàng) AB、AC、BC及二次項(xiàng) B2、C2的影響不顯著（P>0.05），二次項(xiàng)A2影響顯著（P<0.05），提示該模型中各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。方差分析結(jié)果見表6。

2.5.3 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert 7.0.1.0.軟件繪制因變量隨自變量變化的響應(yīng)面圖，詳見圖4。由圖4可知，隨著蒸制時(shí)間、烘制時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合評(píng)分呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì);隨著烘制溫度的升高，綜合評(píng)分逐漸升高，且3個(gè)因素間交互作用不顯著。

2.5.4 最優(yōu)炮制工藝的確定 采用Design-Expert 7.0.1.0.軟件求解二次多項(xiàng)式方程，得到最佳理論炮制工藝為蒸制時(shí)間4.58 h、烘制時(shí)間8.85 h、烘制溫度65.77 ℃，炮制9次，理論預(yù)測(cè)綜合評(píng)分為36.90分。為了滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，得最優(yōu)炮制工藝為蒸制時(shí)間4.5 h、烘制時(shí)間9 h、烘制溫度66 ℃，炮制9次。

2.5.5 最優(yōu)工藝驗(yàn)證 取何首烏藥材10 kg按“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)炮制工藝制備何首烏九蒸九曬樣品，平行操作3次;分別按“2.2”“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、總多糖的含量，再按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見表7。由表7可見，3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均綜合評(píng)分為35.69分，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3.30%，提示優(yōu)化所得何首烏九蒸九曬炮制工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

九蒸九曬是古代何首烏常用的炮制方法之一，首載于《本草圖經(jīng)》，曰“采時(shí)乘濕以布帛拭去土，后用苦竹刀切，米泔浸一宿，曝干，九蒸九曝，乃可服”[17]，其“九蒸九曝”即九蒸九曬。古代九蒸九曬主要有兩種，一種為蒸曬各9次，另一種為蒸曬多次[18]。經(jīng)文獻(xiàn)分析得知，古人炮制何首烏的蒸曬次數(shù)多為7～12次，以炮制9次居多[19]，故本研究選擇蒸曬9次。

本研究試驗(yàn)前期，二苯乙烯苷定量分析時(shí)對(duì)乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液及游離蒽醌定量分析時(shí)的甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液不同流動(dòng)相體系進(jìn)行了比較。結(jié)果，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水或甲醇-0.1%磷酸水溶液時(shí)，對(duì)應(yīng)各組分峰型較好，且分離度達(dá)到所需要求，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

本研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)影響何首烏炮制前后成分含量變化的蒸制時(shí)間、烘制時(shí)間、烘制溫度等3個(gè)因素進(jìn)行考察，獲得了最優(yōu)理論炮制工藝;采用響應(yīng)面法建立質(zhì)控指標(biāo)與關(guān)鍵工藝參數(shù)的數(shù)學(xué)模型，對(duì)最佳理論工藝的結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的偏差在5%以內(nèi)，表明兩者相關(guān)性良好。但是，模型所得理論最優(yōu)工藝中的蒸制時(shí)間（4.85 h）、烘制時(shí)間（8.85 h）以及烘制溫度（65.77 ℃）不適用于現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)，故最終確定最優(yōu)炮制工藝為蒸制時(shí)間4.5 h、烘制時(shí)間9 h、烘制溫度66 ℃，炮制9次。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，二苯乙烯苷與游離蒽醌含量均符合藥典要求[1]，表明該工藝炮制所得何首烏飲片含量合格。后續(xù)，本課題組用此最優(yōu)工藝投產(chǎn)3批（每批15 kg），測(cè)得二苯乙烯苷含量為1.04%～1.09%，游離蒽醌含量為0.19%～0.21%，總多糖含量為36.73%～37.89%，表明該炮制工藝穩(wěn)定、可行。

有研究指出，何首烏中二苯乙烯苷與蒽醌類成分在抗衰老、保護(hù)神經(jīng)、促進(jìn)骨形成等方面具有顯著療效，但二苯乙烯苷則是何首烏致肝損傷發(fā)生的主要原因[20]。多糖類成分能調(diào)節(jié)免疫活性、提高機(jī)體免疫力[21]，這與何首烏的補(bǔ)益功能相符。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著何首烏炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，二苯乙烯苷含量整體呈下降趨勢(shì)，偶見含量上升，這可能與生何首烏中含有的反式二苯乙烯苷穩(wěn)定性差、不耐熱，在炮制過(guò)程中受熱轉(zhuǎn)化為順式二苯乙烯苷并水解成相應(yīng)苷元有關(guān)[22]。同時(shí)，本研究在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，游離蒽醌和總多糖含量均有所增加，其中游離蒽醌含量增加可能與結(jié)合蒽醌在高溫蒸曬過(guò)程中分解為游離蒽醌有關(guān)[23]，總多糖含量增加可能與炮制過(guò)程中黑豆汁所含糖分滲入有關(guān)[24]。二苯乙烯苷、游離蒽醌和總多糖的含量變化是否為何首烏九蒸九曬增效減毒的主要物質(zhì)基礎(chǔ)還有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，所建含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好;優(yōu)化所得炮制工藝預(yù)測(cè)性良好且穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2020-07-20 修回日期：2020-10-19）

（編輯：陳 宏）