羅梅 陰偉曉 羅朝喜

摘要 由于殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用，植物病原菌對(duì)殺菌劑抗性問題日趨突出，嚴(yán)重影響病害防治的效果。褐腐病是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生和流行的重要果樹病害。本文以桃褐腐病菌Monilinia fructicola為例，基于已知的多菌靈抗性機(jī)理，即靶標(biāo)β微管蛋白基因TUB2的點(diǎn)突變E198A，建立了一種桃褐腐病菌對(duì)多菌靈抗性的等位基因?qū)；訮CR檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果表明，堿基錯(cuò)配、內(nèi)參引物、退火溫度、dNTPs、Taq DNA聚合酶、?；砸餄舛燃芭浔鹊纫蛩鼐鶎?duì)檢測(cè)效率有影響。經(jīng)過對(duì)以上因素的優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行?；约办`敏度評(píng)價(jià)，證實(shí)該檢測(cè)技術(shù)能特異性地鑒別桃褐腐病菌M.fructicola對(duì)多菌靈抗性基因型E198A，且檢測(cè)靈敏度可達(dá)到4.342 pg/μL病菌DNA，有望在實(shí)踐中推廣使用。

關(guān)鍵詞 桃褐腐病菌; AS-PCR; 抗藥性; 多菌靈

中圖分類號(hào)： S 436.621.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019503

Abstract With the increasing use of fungicides， the fungicide resistance has become a serious problem that affects the effect of fungicides in practice. Brown rot caused by the ascomycete fungus Monilinia fructicola is an important fruit disease that occurs and spreads worldwide. In this study， based on the known resistance mechanism to carbendazim， i.e.， the point mutation E198A of the target β-tubulin gene （TUB2）， an allele-specific PCR （AS-PCR） was developed to detect the carbendazim resistance in M.fructicola. The results showed that the detection efficiency was influenced by mismatch of nucleotides， internal reference gene primer， annealing temperature， dNTPs， Taq DNA polymerase， specific primer concentration and ratio etc. After these factors were optimized， the specificity and sensitivity of the developed AS-PCR were evaluated. The results showed that the AS-PCR could specifically identify the carbendazim-resistant genotype E198A at a sensitivity of 4.342 pg/μL of M.fructicola genomic DNA， which may be widely used in practice.

Key words Monilinia fructicola; allele-specific PCR; fungicide resistance; carbendazim

由褐腐病菌Monilinia spp.引起的桃褐腐病在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，常對(duì)桃產(chǎn)量及品質(zhì)造成重大影響，嚴(yán)重時(shí)造成毀滅性損失。在我國(guó)引起褐腐病的病原菌主要有3個(gè)種，分別為美澳型核果鏈核盤菌Monilinia fructicola、云南叢梗孢M(jìn)onilia yunnanensis和梅生叢梗孢M(jìn)onilia mumecola。2005年，M.fructicola第一次在我國(guó)報(bào)道[1]，之后在北京、浙江、福建、陜西、云南等省市相繼報(bào)道，是引起我國(guó)桃褐腐病的優(yōu)勢(shì)種[2-3]。目前化學(xué)防治仍然是防控該病害的主要手段。

苯并咪唑類殺菌劑（MBC類）是20世紀(jì)60-70年代開發(fā)出來的一類以苯并咪唑環(huán)為母體的高效廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，在褐腐病的防治中被廣泛使用[4]。其作用機(jī)理是與微管蛋白的β亞基結(jié)合，干擾微管的組裝，從而破壞紡錘體的形成，影響有絲分裂的進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞畸形死亡[5]。但由于其作用位點(diǎn)專一，活性較高，極易產(chǎn)生抗性。目前已發(fā)現(xiàn)β-微管蛋白多個(gè)氨基酸突變，如第6位（H6Y）和第198位（E198A）突變分別導(dǎo)致了M.fructicola對(duì)MBCs的低抗性（苯菌靈）和高抗性（甲基硫菌靈）[6];E198K[7]，E198Q和F200Y[8]等點(diǎn)突變也能引起M.fructicola對(duì)MBCs的高抗性（甲基硫菌靈）[9];第240位突變（L240F）則導(dǎo)致了核果鏈核盤菌Monilinia laxa對(duì)MBCs的低抗性（多菌靈）[6]。多菌靈抗性菌株的產(chǎn)生主要是由于靶標(biāo)β微管蛋白基因TUB2上E198A的點(diǎn)突變所導(dǎo)致，主要表現(xiàn)為第931位核苷酸A突變?yōu)镃[10]。我國(guó)關(guān)于褐腐病菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑抗性的研究不多，目前僅在北京、山東、云南等省市發(fā)現(xiàn)M.fructicola對(duì)甲基硫菌靈和多菌靈產(chǎn)生了抗性（E198A）[10-12]。

單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphisms，SNP）主要是指由于單個(gè)核苷酸變異引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性。等位基因?qū)；訮CR（allele-specific PCR，AS-PCR）是一種簡(jiǎn)單、高效的檢測(cè)SNP的高通量檢測(cè)技術(shù)[13]。它主要根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，其中一條鏈（特異鏈）的3′末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)（或相同），另一條鏈（普通鏈）按一般的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。特異性引物在一種基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物，在另一種基因型中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，從而確定基因型的SNP[14]。AS-PCR操作簡(jiǎn)單，成本低，只需要一臺(tái)PCR儀和1%瓊脂糖凝膠電泳即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。經(jīng)過不斷地改進(jìn)與完善， 基于SNP的等位基因?qū)；訮CR已逐漸成為一種快速、簡(jiǎn)便、低成本、可靠、高通量的檢測(cè)基因型SNP的方法，被廣泛使用。

目前已有M.fructicola對(duì)MBCs類殺菌劑苯菌靈和甲基硫菌靈的低抗性（H6Y）和高抗性（E198A）的PCR檢測(cè)報(bào)道[6]。2013年，玉蜀黍赤霉Gibberella zeae對(duì)MBCs的抗性也是通過設(shè)計(jì)特異性AS-PCR引物得到了診斷[15]。尚未有M.fructicola對(duì)多菌靈抗性（E198A）的分子檢測(cè)報(bào)道。本文以桃褐腐病菌M.fructicola對(duì)多菌靈的E198A抗性菌株為研究材料，開發(fā)出一項(xiàng)能快速檢測(cè)桃褐腐病菌對(duì)多菌靈抗性的等位基因?qū)；訮CR技術(shù)，以期在實(shí)踐中對(duì)抗性群體進(jìn)行檢測(cè)，監(jiān)測(cè)抗性發(fā)生動(dòng)態(tài)，及時(shí)指導(dǎo)病害的防治。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性（E198A）的桃褐腐病原菌M.fructicola菌株（3株）：YHC11-8c、YHC11-15c、YHC11-17c，均來自中國(guó)云南省紅河哈尼族彝族自治州。對(duì)多菌靈敏感的M.fructicola菌株（12株）：ZM09-1a、BM09-4a、HG12-4b、FJC10-7a、HG12-9a、HG12-14b、HG12-20a、HG12-10b、HN13-1a、Bmpc7、MD1-7、MD1-5。其中Bmpc7、MD1-7、MD1-5來自美國(guó)南卡羅萊納州，其他菌株來自中國(guó)浙江杭州、福建莆田、湖北武漢、北京平谷、云南紅河等不同桃產(chǎn)區(qū)。菌株在PDA培養(yǎng)基上于22℃培養(yǎng)。

DNA聚合酶（Easy Taq DNA polymerase），高純度dNTPs（2.5 mmol/L High Pure dNTPs），10×Easy Taq Buffer，DNA Marker（Trans 2K， Trans 2K Plus）均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 基因組DNA提取

采用快速提取的方法。取1.5 mL EP管加0.5 mL DNA提取液（1 mol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA）。挑20～40 mm2菌絲塊于DNA提取液中，用細(xì)胞破碎儀破碎4 min。具體可根據(jù)菌絲生長(zhǎng)程度延長(zhǎng)破碎時(shí)間。12 000 r/min離心10 min，吸上清加入0.3 mL異丙醇。輕輕搖晃混勻幾次，出現(xiàn)絮狀沉淀，12 000 r/min離心10 min。去上清，用0.8 mL 70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心10 min，去上清。37℃開口放15 min，使乙醇揮發(fā)。最后加50 μL ddH2O或1×TE溶解DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)野生型及抗性突變型菌株的β-微管蛋白基因DNA序列差異，第931位核苷酸堿基的不同（抗性菌株為C，敏感菌株為A），通過Oligo7引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物（specific primers，以下簡(jiǎn)稱SP）進(jìn)行抗性區(qū)分（表1）。選用M.fructicola一個(gè)非靶標(biāo)基因MfCCG8設(shè)計(jì)內(nèi)參引物（internal reference primers，以下簡(jiǎn)稱IP），作為PCR擴(kuò)增陽性對(duì)照。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物公司合成，濃度為10 μmol/L。

1.4 AS-PCR反應(yīng)程序

以敏感菌株和抗性菌株的基因組DNA為模板，ddH2O為空白對(duì)照配制25 μL的PCR反應(yīng)體系。10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Primer F/R（SPs）各1 μL，Primer F/R（IPs）各1 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，基因組DNA 1 μL （434.2 ng），ddH2O 15.25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min;94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，16℃ 1 min。結(jié)束后，PCR產(chǎn)物立即用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.5 反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化

為了充分提高檢測(cè)的特異性及靈敏度，對(duì)反應(yīng)條件及體系充分優(yōu)化。退火溫度：52、54、56、58、60、62℃;dNTPs：0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L;Taq DNA聚合酶（5 U/μL）：0.5、0.75、1、1.25、15、1.75 U（25 μL體系）。反應(yīng)體系中各個(gè)因素每次只優(yōu)化一個(gè)因素，依次進(jìn)行。優(yōu)化某一因素時(shí)，已優(yōu)化參數(shù)參照優(yōu)化后最佳用量，其他參數(shù)設(shè)置同1.4。

引物之間會(huì)存在模板競(jìng)爭(zhēng)、試劑競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不一致。通過正交試驗(yàn)法評(píng)價(jià)內(nèi)參引物和特異引物不同濃度梯度以及不同配比對(duì)PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的影響。引物濃度梯度：0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L;引物配比（IP∶SP）：分別為4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8。

1.6 AS-PCR的靈敏度及?；詸z測(cè)

通過Nanodrop 2000測(cè)定抗性菌株（YHC11-8c）的DNA濃度，然后將DNA分別稀釋為原濃度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，得到10個(gè)DNA濃度梯度進(jìn)行AS-PCR反應(yīng)的靈敏度評(píng)價(jià)。另外選取不同來源的桃褐腐病抗性及敏感菌株，以其基因組DNA用于AS-PCR的?；詸z測(cè)。

1.7 AS-PCR的實(shí)用性檢驗(yàn)

2×Taq PCR Mix是目前流行的PCR擴(kuò)增預(yù)混液，是將除了模板、引物以外的其他組分按照最佳配比混合在一起的混合液，使用時(shí)直接加入模板和引物即可，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間。本文以2×HieffTM PCR Master Mix（YEASEN）替代Taq DNA聚合酶和dNTPs，以優(yōu)化的退火溫度，最佳引物濃度及比例進(jìn)行PCR反應(yīng)，與本文建立的檢測(cè)體系作比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物對(duì)AS-PCR結(jié)果的影響

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)出的針對(duì)SNP位點(diǎn)的特異性引物為8CF911和8CR1394。同時(shí)為了增強(qiáng)引物的特異性，在特異性引物3′端倒數(shù)第二位/第三位引入不同的錯(cuò)配堿基，以避免非特異性延伸（表1）。

不同的錯(cuò)配類型對(duì)PCR反應(yīng)的結(jié)果有影響，說明錯(cuò)配堿基的引入有利于提高引物特異性。引入G-A錯(cuò)配和G-T錯(cuò)配的引物無法實(shí)現(xiàn)抗/感菌株的區(qū)分且在反復(fù)驗(yàn)證的過程中不穩(wěn)定。引入G-C錯(cuò)配的引物能夠很好地?cái)U(kuò)增出抗性菌株基因型，而無法擴(kuò)增出敏感菌株基因型，條帶亮，結(jié)果穩(wěn)定。引入TG-CA錯(cuò)配的引物組同樣能實(shí)現(xiàn)抗性菌株與敏感菌株的區(qū)分，但條帶亮度較弱，擴(kuò)增效率不高。經(jīng)比較，選取引入G-C錯(cuò)配的引物組作為特異性引物（圖1）。

2.2 內(nèi)參引物對(duì)AS-PCR的影響

為指示PCR反應(yīng)成功與否，特引入了內(nèi)參PCR引物，擴(kuò)增片段大小為1 020 bp。測(cè)試的兩組內(nèi)參引物都能較好地?cái)U(kuò)增出抗性菌株和敏感菌株的DNA，但5-For-MfCCG8/5-Rev-MfCCG8引物組，空白對(duì)照和敏感菌株均出現(xiàn)了微弱的假陽性非特異性條帶，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果相同。故選擇結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰，在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的引物組3-For-MfCCG8/3-Nest-MfCCG8作為內(nèi)參引物（圖2）。

2.3 AS-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。理想狀態(tài)下，退火溫度要足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合，因此需確定最佳的退火溫度。結(jié)果顯示，不同溫度梯度下，52～58℃均能實(shí)現(xiàn)抗性區(qū)分，60～62℃因?yàn)闇囟冗^高，模板與引物無法有效退火而無法實(shí)現(xiàn)抗性區(qū)分。56℃和58℃條帶亮度很暗，擴(kuò)增效率較低。52℃和54℃條帶很亮，54℃更接近于兩對(duì)引物的Tm值。為保持一致性，保證引物與模板很好地結(jié)合以及提高擴(kuò)增效率，選擇54℃作為最適的退火溫度（圖3）。

2.4 AS-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

反應(yīng)體系中包含dNTPs、Taq DNA聚合酶等試劑，其質(zhì)量及濃度是影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率以及避免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的重要因素。dNTPs的優(yōu)化結(jié)果表明在設(shè)置的各個(gè)濃度梯度下反應(yīng)均能發(fā)生，但特異性引物擴(kuò)增的效率略有不同。0.2～0.3 mmol/L濃度擴(kuò)增效率相對(duì)較高（圖4a）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系中推薦的dNTPs濃度為0.2 mmol/L，本著效率優(yōu)先，節(jié)約為輔的原則，確定dNTPs的最佳濃度為0.2 mmol/L。Taq DNA聚合酶的優(yōu)化，在不同的Taq DNA聚合酶濃度下反應(yīng)均能發(fā)生，但特異性引物擴(kuò)增的條帶亮度隨濃度增加大致呈依次遞增的關(guān)系（圖4b）。結(jié)果顯示在Taq DNA聚合酶濃度為1.25 U下擴(kuò)增的效率已較高，且接近推薦的濃度，故確定Taq DNA聚合酶的用量為1.25 U（25 μL體系）。

2.5 AS-PCR引物比例及引物濃度的優(yōu)化

不同引物的濃度及配比影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，不同引物對(duì)反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系存在不同程度的相互競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致擴(kuò)增效率不一致。以抗性菌株YHC11-8c為例，利用正交試驗(yàn)測(cè)試了內(nèi)參引物和特異引物不同濃度和不同配比下PCR的擴(kuò)增效率變化。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在引物總濃度≥2.4 μmol/L（圖5c）時(shí)，兩種引物對(duì)間的相互競(jìng)爭(zhēng)作用明顯減弱，在不同配比濃度下擴(kuò)增效率達(dá)到了一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在特異性引物與內(nèi)參引物的比值為4時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)作用基本被消除。另外通過觀察比較以及計(jì)算，發(fā)現(xiàn)內(nèi)參引物的濃度≥0.266 7 μmol/L（圖5a 4泳道）時(shí)，擴(kuò)增的效率已較高，趨近飽和。特異性引物的濃度≥0.48 μmol/L（圖5c 1泳道）時(shí)也能夠達(dá)到很高的擴(kuò)增效率，但容易受到引物間相互競(jìng)爭(zhēng)作用以及總濃度的限制（圖5a和圖5b）。本著效率優(yōu)先，節(jié)約為輔的原則，確定引物最佳總濃度1.6 μmol/L，IP∶SP的最佳比值為1∶4（25 μL體系）。

2.6 AS-PCR?；詸z測(cè)

本試驗(yàn)使用3個(gè)由β-微管蛋白的E198A突變引起的抗性菌株YHC11-8c、YHC11-15c、YHC11-17c和來自不同地理區(qū)域的12個(gè)敏感菌株評(píng)價(jià)建立的AS-PCR檢測(cè)方法的?；?。由圖6可見，該檢測(cè)技術(shù)可以專一性地從不同來源的敏感菌株群體中檢測(cè)出抗性菌株，證明該檢測(cè)技術(shù)具有較高的特異性，在實(shí)踐中有很強(qiáng)的實(shí)用性。

2.7 AS-PCR靈敏度檢驗(yàn)

通過Nanodrop 2000測(cè)定抗性菌株YHC11-8c的DNA濃度為434.2 ng/μL，將DNA分別稀釋為原濃度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，得到10個(gè)DNA濃度梯度，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)技術(shù)的靈敏度很高，最低可從稀釋為10-5（4.342 pg/μL）的病原菌DNA中檢測(cè)出抗性菌株，完全可用于生產(chǎn)實(shí)踐（圖7）。

2.8 AS-PCR的實(shí)用性

如圖8所示，使用Mix體系擴(kuò)增的PCR反應(yīng)能夠?qū)Ｒ恍缘財(cái)U(kuò)增抗性菌株基因型，實(shí)現(xiàn)抗性區(qū)分，但特異性引物擴(kuò)增效率偏低，目標(biāo)條帶較暗（圖8b）?？赡苡捎贛ix是一種混合液，無法針對(duì)性地對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行優(yōu)化。因此，使用Mix的PCR擴(kuò)增技術(shù)雖然簡(jiǎn)單方便，但存在局限性，在生產(chǎn)實(shí)踐上不及經(jīng)過充分優(yōu)化開發(fā)出的抗性檢測(cè)技術(shù)。

3 結(jié)論與討論

本研究成功建立了應(yīng)用于桃褐腐病菌M.fructicola對(duì)多菌靈抗性的等位基因?qū)；訮CR檢測(cè)技術(shù)。研究對(duì)反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，充分提高了該檢測(cè)技術(shù)的特異性以及擴(kuò)增效率。最后對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，證明其穩(wěn)定，可靠性強(qiáng)，應(yīng)用前景廣闊。

桃褐腐病菌對(duì)MBCs類殺菌劑產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象非常普遍[9]。病原菌在自然界中數(shù)量龐大，抗藥性個(gè)體在群體中的比例達(dá)到3%時(shí)，即可引起抗藥性群體流行，導(dǎo)致藥劑防治失敗。因此開展植物病原菌的抗藥性檢測(cè)，能為植物病害的有效防治和抗藥性治理提供實(shí)際指導(dǎo)[16]。2013年，Liu等開發(fā)出了玉蜀黍赤霉Gibberella zeae對(duì)多菌靈的多個(gè)抗性點(diǎn)突變的AS-PCR分子檢測(cè)技術(shù)[15]。該技術(shù)在生產(chǎn)上抗藥性檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。近年來，已在不同植物病原真菌中建立了針對(duì)MBCs類殺菌劑抗性的相關(guān)分子檢測(cè)技術(shù)[17-18]。同時(shí)，也有褐腐病菌M.fructicola對(duì)三唑類殺菌劑抗性的分子檢測(cè)技術(shù)報(bào)道[19]。然而到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有桃褐腐病菌對(duì)多菌靈抗性的相關(guān)分子檢測(cè)報(bào)道。

PCR技術(shù)作為一項(xiàng)基本分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到各研究領(lǐng)域中，且隨著發(fā)展需要衍生出各種各樣的PCR方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）等，大多比較繁瑣耗時(shí)，且價(jià)格昂貴，在生產(chǎn)實(shí)踐中并不適用[20]。本研究中開發(fā)的等位基因?qū)；訮CR方法， 成本低易操作，僅一臺(tái)PCR儀和一對(duì)特異性引物即可實(shí)現(xiàn)SNP的檢測(cè)。與已開發(fā)M.fructicola對(duì)MBCs類的苯菌靈和甲基硫菌靈的低抗性（H6Y）和高抗性（E198A）的PCR檢測(cè)技術(shù)相比，對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了充分優(yōu)化，大大提高了靈敏度（4.342 pg/μL），可以在生產(chǎn)實(shí)踐中使用。

通常情況下，對(duì)許多聚合酶（包括 Taq DNA聚合酶）來說，引物的3′末端必須與模板完全互補(bǔ)才能產(chǎn)生有效的聚合反應(yīng)。但在某些情況下，即使引物的3′末端堿基與模板不互補(bǔ)，延伸仍然可以進(jìn)行，只是延伸效率僅有前者的10-6.6～10-3倍[21]。為避免這種非匹配延伸，引起假陽性，需要在突變點(diǎn)前第二或第三位引入錯(cuò)配堿基[12]。一個(gè)堿基有三種替換方式，不同的替換對(duì)PCR的結(jié)果有不同影響。參考Little等[21]引入錯(cuò)配堿基的原則，把堿基之間錯(cuò)配的不穩(wěn)定性分為4類：T/T、C/T、G/A之間的錯(cuò)配最不穩(wěn)定，C/C之間錯(cuò)配的不穩(wěn)定性次之，A/A、G/G 之間錯(cuò)配的不穩(wěn)定性居中，C/A， G/T 之間的錯(cuò)配不穩(wěn)定性最弱。引物3′末端堿基的錯(cuò)配如果是強(qiáng)不穩(wěn)定性，則引入的第二個(gè)堿基錯(cuò)配類型應(yīng)該用弱不穩(wěn)定性;反之， 則用強(qiáng)不穩(wěn)定性;引物3′末端的錯(cuò)配如果是中等不穩(wěn)定性，則引入的錯(cuò)配類型也應(yīng)用中等不穩(wěn)定性。本研究中引物3′末端的錯(cuò)配為強(qiáng)錯(cuò)配（A-C），需引入弱的錯(cuò)配（G/A）或者不引入錯(cuò)配。從試驗(yàn)結(jié)果來看，引入G-A錯(cuò)配（弱錯(cuò)配）和G-T錯(cuò)配（強(qiáng)錯(cuò)配）的引物均無法實(shí)現(xiàn)抗性的區(qū)分，敏感菌株和抗性菌株基因型均有條帶出現(xiàn)（圖1）。前者可能是由于A堿基的引入導(dǎo)致引物間Tm值（520℃）差異較大的緣故，以致出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增;后者或許是不滿足引入錯(cuò)配的原則，強(qiáng)強(qiáng)錯(cuò)配反而不穩(wěn)定。引入G-C錯(cuò)配的引物能夠?qū)Ｒ恍缘財(cái)U(kuò)增出抗性菌株且結(jié)果很穩(wěn)定，G-C錯(cuò)配的引入對(duì)Tm值沒有影響，GC含量沒有變化，推測(cè)G-C錯(cuò)配可能是一種中等錯(cuò)配（圖1，12泳道）。倒數(shù)第三位和第二位分別引入T-C和G-A錯(cuò)配（均為弱錯(cuò)配）的引物能實(shí)現(xiàn)抗性菌株與敏感菌株的區(qū)分，但條帶亮度較弱，擴(kuò)增效率不高（圖1，15泳道），符合Little等提出的引入錯(cuò)配原則。

dNTPs以及Taq DNA聚合酶的各個(gè)濃度處理間擴(kuò)增效率差別并不大，多次重復(fù)結(jié)果相同（圖4）。用Nanodrop 2000對(duì)反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的核酸濃度進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨dNTPs濃度增加，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度呈線性遞增的趨勢(shì)，說明擴(kuò)增的效率與dNTPs濃度呈正相關(guān)。隨Taq DNA聚合酶濃度增加，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.25 U時(shí)達(dá)到峰值（圖4）。優(yōu)化過程中擴(kuò)增效率差別不大的原因或許是dNTPs和Taq DNA聚合酶對(duì)擴(kuò)增效率影響較小。

內(nèi)參引物和特異引物濃度配比及其他因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在影響。復(fù)合擴(kuò)增中存在的模板競(jìng)爭(zhēng)以及試劑競(jìng)爭(zhēng)等會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增的不平衡。隨著復(fù)合擴(kuò)增位點(diǎn)的增加，引物數(shù)量越來越多， 引物間的相互作用也會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增， 引物間的最佳濃度配比就成為擴(kuò)增體系的關(guān)鍵因素之一。本實(shí)驗(yàn)通過正交試驗(yàn)確定了最佳濃度配比（IP∶SP為1∶4）以及最佳濃度用量（1.6 μmol/L）[13]，且發(fā)現(xiàn)引物濃度配比存在某種飽和度，在達(dá)到某個(gè)值時(shí)，將不受競(jìng)爭(zhēng)作用以及濃度變化的影響，擴(kuò)增效率達(dá)到一致（圖5）。

?；约办`敏度檢測(cè)表明，該檢測(cè)技術(shù)可以專一性地從不同來源的群體中檢測(cè)到抗性菌株，且可檢測(cè)到DNA的最高稀釋限度為皮克級(jí)別，具有很高的特異性及靈敏度，實(shí)際生產(chǎn)中適用性強(qiáng)。與使用Mix混合液的PCR反應(yīng)比較，本試驗(yàn)建立的高通量AS-PCR檢測(cè)技術(shù)顯示出更優(yōu)越的適用性及特異性（圖8）。

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