李丹丹 何婷 王夢(mèng)可

摘要 為了篩選小麥光腥黑粉菌轉(zhuǎn)化子最適培養(yǎng)基，以提高小麥光腥黑粉菌轉(zhuǎn)化子生長速度，選取了3個(gè)菌落形態(tài)不同的轉(zhuǎn)化子（ZHZ-1， ZHZ-2， ZHZ-3）進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。用6 mm打孔器打取菌餅，將菌餅置于9種培養(yǎng)基上16℃避光培養(yǎng)。觀察、測(cè)量小麥光腥黑粉菌轉(zhuǎn)化子的菌絲生長情況、菌落直徑等主要指標(biāo)，結(jié)果表明，9種培養(yǎng)基中，3種轉(zhuǎn)化子都是在完全培養(yǎng)基（complete medium，CM）上生長狀況最好，菌絲生長速度最快。ZHZ-1轉(zhuǎn)化子在CM培養(yǎng)基上菌落圓形，有褶皺，產(chǎn)生大量白色菌絲，生長速度快。ZHZ-2轉(zhuǎn)化子菌落圓形，產(chǎn)生大量白色菌絲，生長速度快。ZHZ-3轉(zhuǎn)化子菌落云紋狀，有褶皺，產(chǎn)生大量白色菌絲，生長速度快。

關(guān)鍵詞 小麥光腥黑粉菌; 轉(zhuǎn)化子; 菌落直徑; 培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)： S 435.121.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019444

Abstract In order to screen the optimum medium for transformants of Tilletia foetida， to increase the growth rate of transformants of T.foetida， three transformants with different colony morphology， namely ZHZ-1， ZHZ-2 and ZHZ-3， were selected for culture experiment. The 6 mm colony was obtained with a puncher， and was cultured on nine kinds of media at 16℃in the dark. The mycelial growth of the transformants was determined with the colony diameter as the main indicator. The results showed that the three transformants have better mycelium growth rate on complete medium （complete medium， CM） than on the other eight media. Growth pattern of ZHZ-1 transformant on CM medium was as follows： the colony is round and wrinkled， producing a large number of white hyphae， and ZHZ-1 grows fast. The colony of ZHZ-2 transformant is round， producing a large number of white hyphae， and ZHZ-2 grows fast. The ZHZ-3 transformant colonies are irregular， cloud-like and wrinkled， producing a large number of white hyphae， and ZHZ-3 grows fast.

Key words Tilletia foetida; transformant; colony diameter; medium

小麥光腥黑粉菌Tilletia foetida（Wall.）Liro.引起的小麥光腥黑穗病 （common bunt of wheat）是一種全球性、毀滅性的麥類病害[1]。該病害危害嚴(yán)重、分布廣泛、流行性強(qiáng)，對(duì)小麥的安全生產(chǎn)有破壞性的影響[2-4]。受T.foetida侵染的小麥，在抽穗之前無明顯的癥狀，在小麥生長后期，穎殼向外張開，感病麥粒小且硬，里面充滿黑粉狀的厚垣孢子，感染T.foetida的小麥麥粒散發(fā)臭魚腥味，并且釋放出有毒的三甲胺類物質(zhì)[5-6]。小麥品質(zhì)降低，產(chǎn)量遭受巨大損失[7-9]。

在南非、美洲和阿富汗等小麥產(chǎn)區(qū)，小麥光腥黑穗病的發(fā)生對(duì)小麥品質(zhì)造成嚴(yán)重影響[10-11]。20世紀(jì)50年代初，小麥光腥黑穗病在我國各地都有發(fā)生，主要集中在華北和西南部分冬小麥產(chǎn)區(qū)，西北和東北地區(qū)的春小麥區(qū)域[12-13]。小麥光腥黑粉菌屬于擔(dān)子菌門Basidiomycotina，冬孢菌綱Teliomycetes，黑粉菌目Ustilaginales，腥黑粉菌科Tilletiaceae，腥黑粉菌屬Tilletia[14]。T.foetida的冬孢子呈褐色，球形或近球形，在土壤中能夠存活多年，一旦條件適宜并遇到大面積的適宜寄主，便會(huì)引起發(fā)病[15]。國內(nèi)外主要集中研究小麥光腥黑穗病的病原菌檢測(cè)[16-19]，對(duì)其致病機(jī)制研究較少，該菌自身特性限制了對(duì)該菌的研究。

本實(shí)驗(yàn)室前期已獲得58個(gè)小麥光腥黑粉菌轉(zhuǎn)化子，但是由于該菌自身的特性，菌絲生長速度較慢，不利于后續(xù)研究。本文隨機(jī)挑選3個(gè)不同形態(tài)的轉(zhuǎn)化子ZHZ-1， ZHZ-2， ZHZ-3（圖1），分別在9種不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以篩選出最適合轉(zhuǎn)化子生長的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物保護(hù)研究所保存的小麥光腥黑粉菌3個(gè)轉(zhuǎn)化子ZHZ-1， ZHZ-2， ZHZ-3，均為前期通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）獲得的小麥光腥黑粉菌轉(zhuǎn)化子。

固體培養(yǎng)基：水瓊脂（water agar， WA），瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。察氏培養(yǎng)基（Czapek-Dox medium， CDA），NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基（malt extract agar， MEA），麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar， PDA），馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（corn meal agar， CMA），玉米粉30 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。基本培養(yǎng)基（minimal medium， MM），NH4NO3 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，Na2HPO4 1.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。YEPSA培養(yǎng)基，酵母提取物10 g，胰蛋白胨4 g，蔗糖4 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（comprehensive potato glucose agar medium， CPDA），馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4 ·7H2O 3.0 g，VB1 0.1 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。完全培養(yǎng)基（complete medium，CM），酵母浸粉1 g，酶水解干酪素0.5 g， 酸水解干酪素0.5 g，葡萄糖10 g，Ca（NO3）2·4H2O 1 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaCl 0.15 g，瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。以上培養(yǎng)基均在121℃高壓滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)6個(gè)月后，將3種轉(zhuǎn)化子菌種用6 mm的打孔器打取菌餅，將菌餅放到9種不同的固體培養(yǎng)基上，為了防止產(chǎn)生雜菌，并篩選出含有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)基中加入300 mg/mL青霉素-鏈霉素雙抗和100 μg/mL潮霉素B，置于16℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔一天測(cè)量1次菌落直徑，每5 d記錄1次菌落生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種轉(zhuǎn)化子在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)6個(gè)月的菌落形態(tài)

由于轉(zhuǎn)化子形態(tài)各異，所以3種轉(zhuǎn)化子采用不同的轉(zhuǎn)接方式，ZHZ-1用打取菌餅的方式轉(zhuǎn)接，ZHZ-2，ZHZ-3采用劃線的方式轉(zhuǎn)接，3種轉(zhuǎn)化子形態(tài)如圖1所示。ZHZ-1轉(zhuǎn)化子菌落圓形，菌落內(nèi)層有褶皺，菌落分3層，內(nèi)層白色，外層淺灰色，菌絲白色。ZHZ-2菌落圓形，菌絲白色，毛狀。ZHZ-3菌落圓形，菌落外層有淺棕色暈圈，菌絲白色。

2.2 3種轉(zhuǎn)化子在9種培養(yǎng)基上的生長情況

2.2.1 3種轉(zhuǎn)化子在9種培養(yǎng)基上的長勢(shì)

試驗(yàn)結(jié)果表明：不同培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化子菌絲生物量有較大影響。3種轉(zhuǎn)化子在9種培養(yǎng)基上的生長情況差異明顯，但均在CM培養(yǎng)基上長勢(shì)最好，菌絲生長速度最快。ZHZ-1轉(zhuǎn)化子在WA、CDA、MEA、PDA、CMA和MM培養(yǎng)基上生長速度極慢，只長出少量菌絲，相比之下，在YEPSA、CPDA和CM培養(yǎng)基上生長速度較快。ZHZ-2轉(zhuǎn)化子在WA、CDA培養(yǎng)基上生長出少量白色菌絲，但是，在MEA、PDA、CMA培養(yǎng)基上菌絲幾乎不生長，在MM培養(yǎng)基上生長出少量稀疏的菌絲，與其他6種培養(yǎng)基相比，在YEPSA、CPDA、CM培養(yǎng)基上生長速度較快，菌落圓形，菌絲白色。ZHZ-3轉(zhuǎn)化子在WA、CDA、MEA培養(yǎng)基上幾乎不生長，且在CDA培養(yǎng)基上菌落呈褐色，在PDA、CMA、MM培養(yǎng)基上生長出少量白色菌絲，與其他兩個(gè)轉(zhuǎn)化子相同的是在YEPSA、CPDA、CM培養(yǎng)基上生長速度較快。3個(gè)轉(zhuǎn)化子生長形態(tài)如圖2a～c。

2.2.2 3種轉(zhuǎn)化子在9種培養(yǎng)基上生長速度

以菌落直徑為指標(biāo)，明顯看出3種轉(zhuǎn)化子在9種培養(yǎng)基上生長速度差異很大，共同點(diǎn)為3種轉(zhuǎn)化子在CM培養(yǎng)基上生長速度最快，明顯快于其他8種培養(yǎng)基，ZHZ-1轉(zhuǎn)化子在CMA上菌落直徑?jīng)]有增長。 ZHZ-2 轉(zhuǎn)化子在WA、CDA、MEA、PDA、CMA、MM培養(yǎng)基上生長曲線較平滑，生長速度緩慢。ZHZ-3轉(zhuǎn)化子在WA、CDA、MEA、PDA、CMA、MM培養(yǎng)基上生長30 d后，菌落直徑相差不多（圖3a～c）。

2.3 3種轉(zhuǎn)化子在9種不同培養(yǎng)基上菌落性狀

ZHZ-1在CDA培養(yǎng)基上生長15 d后菌落沒有擴(kuò)展，在MEA、PDA、CMA培養(yǎng)基上，ZHZ-1轉(zhuǎn)化子生長30 d沒有明顯變化，與其他9種培養(yǎng)基相比，在CM培養(yǎng)基上生長速度最快（表1）。ZHZ-2在PDA培養(yǎng)基上15 d以后才出現(xiàn)明顯的生長，在其他8種培養(yǎng)基上，5 d以后就出現(xiàn)明顯的增長（表2）。ZHZ-3在PDA、CMA培養(yǎng)基上20 d后有明顯的增長，在CDA、MEA培養(yǎng)基上15 d有明顯增長，在其他5種培養(yǎng)基上5 d后菌落直徑開始擴(kuò)大（表3）。

生長緩慢菌落生長緩慢菌落生長緩慢菌絲褐色，菌落褐色圓形，生長緩慢MEA-菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長速度慢

PDA---菌絲白色，菌落點(diǎn)狀分布菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，菌落白色，生長緩慢CMA-菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，菌落圓形，生長速度慢MM-菌絲白色，稀疏，菌落圓形菌落生長慢，菌絲白色菌落生長緩慢，菌絲白色菌落生長緩慢，菌絲白色菌落生長慢，圓形，菌絲白色，YEPSA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，厚重，菌落圓形有褶CPDA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，菌落平滑CM-菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快產(chǎn)生大量白色菌絲，生長較快WA-菌絲褐色，生長較慢菌絲稀疏，生長較慢菌絲稀疏，生長較慢菌絲稀疏，生長較慢菌絲稀疏，生長緩慢CDA---菌絲白色，生長緩慢菌絲白色生長緩慢菌絲白色，菌落厚重，生長緩慢MEA---菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌落白色，生長緩慢，菌落厚重PDA----菌落白色，生長緩慢菌落白色，生長緩慢CMA----菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，菌落白色，生長緩慢MM-菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，點(diǎn)狀分布菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，稀疏，生長緩慢YEPSA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，菌落有褶皺菌絲白色，菌落有褶，菌絲白色，菌落有褶，生長較快CPDA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，菌落平滑，生長較快CM-菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快產(chǎn)生大量白色菌絲，菌落有褶，生長速度快

3 討論

研究表明，3種轉(zhuǎn)化子在CM培養(yǎng)基上的生長速度明顯高于在PDA上的生長速度，用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d，ZHZ-1在CM培養(yǎng)基上菌落直徑增長了2.07 cm，在PDA培養(yǎng)基上直徑增長了0.06 cm， ZHZ-2在CM培養(yǎng)基上菌落直徑增長了3 cm，在PDA培養(yǎng)基上直徑增長了0.2 cm。ZHZ-3在CM培養(yǎng)基上菌落直徑增長了2.45 cm，在PDA培養(yǎng)基上直徑增長了0.33 cm。

本試驗(yàn)研究了小麥光腥黑粉菌3種轉(zhuǎn)化子在9種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和生長速度，結(jié)果表明，小麥光腥黑粉菌3種轉(zhuǎn)化子在CM培養(yǎng)基上生長速度最快，菌絲生長較好。該培養(yǎng)基最適宜3個(gè)轉(zhuǎn)化子的生長，且CM培養(yǎng)基成分價(jià)格便宜，來源廣泛，容易獲得，因而是較為理想的培養(yǎng)基，在擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)可以考慮作為首選培養(yǎng)基，以獲得高質(zhì)量和高數(shù)量的小麥光腥黑粉菌轉(zhuǎn)化子，為后續(xù)對(duì)該菌致病機(jī)制的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）