楊曉賀 魏松紅 顧鑫

摘要 為明確東北地區(qū)水稻種質(zhì)資源對(duì)紋枯病的抗性，收集了本地區(qū)水稻種質(zhì)資源152份，在苗期和分蘗期進(jìn)行離體葉片接種;在分蘗末期對(duì)79份種質(zhì)進(jìn)行了牙簽嵌入法接種鑒定。結(jié)果表明，供試的152份稻種資源中，苗期離體葉片接種表現(xiàn)抗病的種質(zhì)有2份，中抗種質(zhì)有42份。分蘗期離體葉片接種表現(xiàn)抗病的種質(zhì)2份，中抗種質(zhì)8份;進(jìn)行牙簽嵌入法接種鑒定的79份種質(zhì)中，表現(xiàn)中抗的種質(zhì)16份。在苗期、分蘗期離體葉片接種、牙簽嵌入法接種鑒定中均表現(xiàn)為中抗以上的種質(zhì)僅有‘沈農(nóng)9819。分蘗期離體葉片接種和牙簽嵌入接種法所獲結(jié)果符合率最高，為77.22%。

關(guān)鍵詞 水稻紋枯病; 立枯絲核菌; 離體葉片接種法; 牙簽嵌入接種法

中圖分類號(hào)： S 435.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019435

Abstract In order to clear the resistance of rice germplasm in Northeast China to rice sheath blight （RSB） disease， 152 germplasm resources were collected and identified by detached leaf inoculation at seedling and tillering stage. Two germplasms showed resistance and forty eight germplasms showed middle resistance to RSB with detached leaf inoculation at seedling. Two germplasms showed resistance and eight germplasms showed middle resistance to RSB with detached leaf inoculation at tillering stage. 79 germplasms resources were identified by toothpick-inserting inoculation at late tillering stage， and 16 germplasms showed middle resistance. Among the three identification methods， only ‘Shennong 9819 showed moderate resistance or above. There were the highest coincidence rate of identification results between detached leaf inoculation at tillering stage and toothpick-inserting， with the coincidence rate of 77.22%.

Key words rice sheath blight disease; Rhizoctonia solani; detached leaf inoculation method; toothpick-inserting inoculation method

紋枯病是水稻三大病害之一，對(duì)水稻產(chǎn)量可造成10%～30%的損失，嚴(yán)重發(fā)病地塊損失高達(dá)50%[1]。該病的病原菌為立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kühn，其有性態(tài)為瓜亡革菌Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk，該菌具有較強(qiáng)的腐生性和廣寄主性。有關(guān)水稻種質(zhì)資源抗紋枯病的篩選，已有研究者做了大量工作。但抗病性鑒定的方法不盡相同。水稻紋枯病的抗病性鑒定可分為苗期鑒定和成株期鑒定。苗期鑒定多采用可控制溫度和濕度條件的霧室鑒定法[2]和微室接種鑒定[3]。其優(yōu)點(diǎn)是周期短、溫濕度可控、發(fā)病易于觀察。一些研究單位采用該方法進(jìn)行抗源篩選，但也有研究者認(rèn)為其鑒定結(jié)果與田間實(shí)際情況不符，所以放棄此種方法[4]。田間成株期接種方法主要有撒施法[5-6]、稻叢誘發(fā)法[7]、菌絲塊接種法[8]、牙簽嵌入接種法[5]、注射器接種法[9-10]。撒施法和稻叢誘發(fā)法的優(yōu)點(diǎn)是工作量小，操作簡(jiǎn)單，較適用于基于大田水平的品種選育和抗病性初篩鑒定。菌絲塊接種法、牙簽嵌入接種法和注射器接種法的鑒定結(jié)果重復(fù)性高、可靠性更高，適合對(duì)材料進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定以及紋枯病抗性遺傳的研究，其缺點(diǎn)是較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，當(dāng)鑒定材料數(shù)量較多時(shí)，需要的工作量大。現(xiàn)有的抗源篩選成果中，可供利用的抗源較少，無免疫種質(zhì)，抗病材料多為中抗品種[11-16]。我國水稻抗紋枯病抗源篩選研究多針對(duì)南方水稻種質(zhì)[17-18]，東北地區(qū)水稻抗紋枯病篩選亦有研究[19-20]，但較少。隨著東北地區(qū)水稻種植面積的擴(kuò)大、矮稈品種的推廣、種植密度及施肥量的增加，紋枯病的發(fā)病率呈逐年加重趨勢(shì)[21]。目前水稻紋枯病已逐漸成為東北地區(qū)水稻的主要病害。為明確東北地區(qū)水稻種質(zhì)對(duì)紋枯病的抗性水平，本研究收集東北地區(qū)水稻種質(zhì)資源，對(duì)其進(jìn)行苗期和分蘗期的離體葉片接種及分蘗末期牙簽嵌入法接種鑒定，對(duì)3種接種方法在抗源篩選中的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選適合東北地區(qū)水稻種植區(qū)的抗紋枯病品種，為東北地區(qū)水稻育種提供優(yōu)質(zhì)的抗紋枯病材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：東北地區(qū)水稻種質(zhì)152份。

供試菌株：水稻紋枯病菌強(qiáng)致病力菌株Y-36由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻病害研究室提供。

1.2 方法

材料種植：所有供試材料種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院水稻育秧棚及試驗(yàn)田內(nèi)。試驗(yàn)田內(nèi)每個(gè)水稻種質(zhì)種植2行，行長(zhǎng)5 m，田間管理同生產(chǎn)田。

菌種培養(yǎng)：將菌株接種于PDA平板上，28℃活化培養(yǎng)，用直徑5 mm打孔器取菌落邊緣新生菌絲菌餅，將菌餅放置于PDA平板上28℃培養(yǎng)48 h，用直徑5 mm打孔器取菌落邊緣新生菌絲菌餅用于離體葉片接種。將滅菌的長(zhǎng)1.0～1.5 cm短牙簽平鋪于未凝固的PDA平板上，待培養(yǎng)基凝固后，將活化后的菌餅接種于該培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)5 d，挑取長(zhǎng)有菌絲的短牙簽用于牙簽嵌入法接種。

1.2.1 離體葉片接種法[22]

苗期：水稻4葉期，選取健康葉片剪成6 cm長(zhǎng)小段，放置于覆有3層濾紙的直徑9 cm培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)基及濾紙經(jīng)高溫滅菌），每皿放置4個(gè)葉片。葉片中央接種直徑5 mm的菌餅，培養(yǎng)皿內(nèi)加入無菌水配制pH為7的40 mg/L 6-BA溶液保濕。接種后將培養(yǎng)皿置25℃恒溫，L∥D=12 h∥12 h的光照培養(yǎng)箱中。接種后24 h調(diào)查發(fā)病級(jí)別，以發(fā)病最嚴(yán)重的為最終發(fā)病級(jí)別，每份種質(zhì)設(shè)3次重復(fù)。

分蘗期：水稻分蘗盛期，選取健康葉片，方法同苗期離體葉片接種。接種溫度：28℃。接種后36 h調(diào)查發(fā)病級(jí)別，以發(fā)病最重的為最終發(fā)病級(jí)別。

病級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：參考周而勛等的[22]方法制定離體葉片抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

0級(jí)（免疫）：無病斑;1級(jí)（抗?。翰“呙娣e占葉片面積的1/8以下;2級(jí)（中抗）：病斑面積占葉片面積的1/8～1/4（不包括1/4）;3級(jí)（中感）：病斑面積占葉片面積的1/4～1/2（不包括1/2）;4級(jí)（感?。翰“呙娣e占葉片面積的1/2～3/4（不包括3/4）;5級(jí)（高感）：病斑面積占葉片面積的3/4以上。

1.2.2 牙簽嵌入接種法[23]

分蘗末期，將長(zhǎng)有菌絲的短牙簽接種于倒數(shù)第三葉葉鞘內(nèi)。接種時(shí)應(yīng)盡量保證不破壞葉鞘與莖稈的原有狀態(tài)。選取每個(gè)單株內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)且基本一致的3個(gè)分蘗，每份種質(zhì)選3株。接種后14、21、28 d調(diào)查發(fā)病級(jí)別。以發(fā)病最重的為最終發(fā)病級(jí)別。

病級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：參照Rush制定并經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院潘學(xué)彪研究組修改的0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[23]及陳宗祥等[24]抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

0級(jí)（免疫）：植株健康無病;1級(jí)（高抗）：病斑在倒6葉鞘上或更低;2級(jí)（抗病）：病斑擴(kuò)展至倒5葉鞘上;3級(jí)（中抗）：病斑擴(kuò)展至倒4葉鞘上;4級(jí)（中感）：病斑擴(kuò)展至倒3葉鞘長(zhǎng)度的一半以上;5級(jí)（中感）：病斑擴(kuò)展至倒2葉鞘長(zhǎng)度的一半以上;6級(jí)（感?。翰“邤U(kuò)展至倒1葉鞘長(zhǎng)度的1/4至1/2范圍內(nèi);7級(jí)（感?。翰“邤U(kuò)展至倒1葉鞘長(zhǎng)度的1/2以上;8級(jí)（高感）：病斑擴(kuò)展至劍葉長(zhǎng)度的1/2以上或死亡;9級(jí)（高感）：植株或植株中的多數(shù)莖稈因紋枯病而死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期及分蘗期離體葉片接種鑒定結(jié)果

2.2 分蘗末期牙簽嵌入法接種鑒定結(jié)果

2.3 離體葉片接種同牙簽嵌入法接種鑒定結(jié)果符合率

將苗期離體葉片接種鑒定結(jié)果、分蘗期離體葉片接種鑒定結(jié)果、牙簽嵌入法接種鑒定結(jié)果進(jìn)行符合率計(jì)算，將高抗、抗病、中抗種質(zhì)歸為抗病種質(zhì)，將高感、感病、中感種質(zhì)歸為感病種質(zhì)，結(jié)果表明，分蘗期離體葉片接種同牙簽嵌入法接種結(jié)果符合率最高，為77.22%（表3），其次是苗期離體葉片接種同分蘗期離體葉片接種，接種結(jié)果符合率為72.37%（表4），苗期離體葉片接種同牙簽嵌入法接種結(jié)果符合率最低，為64.56%（表5）。

3 結(jié)論與討論

進(jìn)行離體葉片接種鑒定的種質(zhì)共152份，在苗期離體葉片接種中，表現(xiàn)為抗病的種質(zhì)有2份，中抗種質(zhì)42份，在分蘗盛期離體葉片接種表現(xiàn)抗病的種質(zhì)有2份，中抗種質(zhì)有8份。在兩個(gè)時(shí)期的離體葉片接種鑒定中均表現(xiàn)為中抗以上的品種有6份，分別為‘鹽804‘生優(yōu)1號(hào)‘WY1368‘松粳19‘長(zhǎng)白20和‘沈農(nóng)9819。在兩個(gè)時(shí)期的離體葉片鑒定中均表現(xiàn)為中感、感病或高感的種質(zhì)有104份。

從離體葉片接種鑒定的152份種質(zhì)中挑選出79份種質(zhì)進(jìn)行牙簽嵌入法接種鑒定，表現(xiàn)中抗的種質(zhì)有16份，其中，僅有1份種質(zhì)在苗期和分蘗期的葉片接種鑒定中均表現(xiàn)為抗病，該種質(zhì)為‘沈農(nóng)9819。

本研究比較了水稻抗紋枯病鑒定的3種接種方法，分別為苗期離體葉片接種、分蘗盛期離體葉片接種和分蘗末期牙簽嵌入接種。將3種鑒定結(jié)果進(jìn)行符合率計(jì)算，結(jié)果表明，分蘗盛期離體葉片接種與牙簽嵌入法接種鑒定結(jié)果的符合率最高，為77.22%;其次是苗期離體葉片接種和分蘗盛期離體葉片接種，符合率為72.37%;符合率最低的是苗期離體葉片接種同牙簽嵌入接種法，為64.56%。由于牙簽嵌入接種法更接近水稻紋枯病的田間自然發(fā)病規(guī)律，在抗性鑒定中的可靠性更高，在水稻紋枯病抗性機(jī)理研究中被廣泛應(yīng)用。從本研究結(jié)果來看，分蘗盛期離體葉片接種法更為省時(shí)、省力，抗性結(jié)果也較為可靠，更適合工作量要求比較大的抗源初步篩選。

采用牙簽嵌入法接種進(jìn)行南方水稻紋枯病抗性鑒定時(shí)，通常在分蘗末期接種，抽穗后30 d調(diào)查病級(jí)來確定最終抗性鑒定結(jié)果[25-27]。但由于東北地區(qū)冷涼，水稻分蘗、孕穗和拔節(jié)等生育進(jìn)程有重疊，因此接種時(shí)間不好確定。此外，一些遼寧的種質(zhì)種植在黑龍江省佳木斯地區(qū)，由于日照變長(zhǎng)、溫度低，而使其生育期表現(xiàn)延遲，抽穗晚。有些品種甚至無法完成整個(gè)生育進(jìn)程。因此，本研究中采取的抗性鑒定時(shí)期并不是南方通用的抽穗后30 d調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，而是在接種后14、21 d和28 d分別進(jìn)行調(diào)查，最后以接種后28 d的調(diào)查結(jié)果為準(zhǔn)，同時(shí)參考其他研究者采用的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)[23-24]，確定供試種質(zhì)的抗性。在接種后28 d時(shí)，黑龍江本地品種生育期多為成熟期，病級(jí)較高，多表現(xiàn)為感病，僅‘龍稻16表現(xiàn)為中抗。這也表明，該方法中并沒有將所有的黑龍江品種淘汰掉，仍然有性狀良好的品種表現(xiàn)抗性，可以作為東北地區(qū)抗性評(píng)價(jià)的方法之一。

有研究者認(rèn)為水稻對(duì)紋枯病的抗性同水稻品種的株高、生育期等無顯著相關(guān)性[28-29]，另有研究者[30]在進(jìn)行抗紋枯病基因定位的研究中發(fā)現(xiàn)，抗性基因的置信區(qū)內(nèi)未檢測(cè)到株高、生育期等性狀的QTL，因此認(rèn)為水稻對(duì)紋枯病的抗性與生育期無關(guān)。也有研究者認(rèn)為[31-32]水稻對(duì)紋枯病的抗性可能與生育期有關(guān)。本研究中利用牙簽嵌入法進(jìn)行接種鑒定發(fā)現(xiàn)，發(fā)病重的水稻種質(zhì)其生育期普遍比發(fā)病輕種質(zhì)的生育期早。因此，水稻種質(zhì)對(duì)紋枯病的抗性可能與其生育期具有一定的相關(guān)性。所以，在以后利用牙簽嵌入法接種鑒定水稻對(duì)紋枯病的抗性時(shí)，不同地區(qū)水稻種質(zhì)應(yīng)在其相應(yīng)的適宜種植區(qū)內(nèi)進(jìn)行，以提高鑒定的準(zhǔn)確率。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）