陳達，周明武，楊瑞甫，宋立，幸超峰，李士民

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南 鄭州 450042；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第988醫(yī)院 全軍創(chuàng)傷骨科中心，河南 鄭州 450042）

目前，骨缺損的治療一直是骨科領域研究的熱點，臨床對于骨缺損的治療方法主要為自體骨移植、組織工程骨移植、同種異體骨移植等[1]。同種異體骨來源廣，有骨誘導、骨傳導等優(yōu)點，臨床上應用已經(jīng)比較普遍[2]。但在骨缺損的修復過程中同種異體骨要伴隨著血管化和骨重建等問題，針對這些問題，很多學者進行了深入的研究。其中，周明武等[3]通過把同種異體骨異位于兔股直肌與股內側肌間隙內近隱動脈處，10周后同種異體骨轉變?yōu)榛罨?。周立[4]采取外源VEGF復合BMP能加快同種異體脫鈣骨轉變?yōu)榛罨牵铀傺芘佬刑娲迯瓦M程，減少預構骨瓣時間。蔣大偉[5]采用體外沖擊波（ESW）加速兔跟腱重建后腱骨愈合速度。本實驗中，我們設想通過體外沖擊波（ESW）加快同種異體骨轉變?yōu)榛罨堑乃俣取?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗動物及器材

選用健康成年中國白兔120只為研究對象 (雌雄不限，體質量為2.5～3.0 kg，鄭州大學基礎醫(yī)學院提供)；兔多克隆抗體(美國 Santa Cruz公司)；體外沖擊波疼痛治療儀器（瑞士 STORZ MP100）；擺鋸（上海博進醫(yī)療器械）；DAB試劑盒(北京中杉生物工程公司)；S-P9000免疫組化試劑盒 (北京中杉生物工程公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(鄭州博興生物科技有限公司)；石蠟切片機(德國Lecia，RM，2235)；醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(上海山富科學儀器有限公司，Biosens Digital Imaging System v1.6)；鈷-60輻射源(河南省同位素研究所)；分析天枰(型號AEL-160-21)；溫箱(上海秣馬恒溫設備廠，型號DHG-9031)；冰箱(海爾)；照相顯微鏡(Olympus，型號BX63)等。

1.2 實驗方法

實驗動物分組：從120只健康白兔中隨機選取20只作為供體制備同種異體骨。其余100只按隨機數(shù)字表法分為觀察組50只，給予沖擊波（ESW）治療；對照組50只，未給予沖擊波（ESW）治療。

同種異體骨制備：隨機挑選20只白兔經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死，在無菌操作下取出雙脛骨，去除骨膜及周圍軟組織，擺鋸鋸成1.5 cm長的骨段并徹底去除骨段中的骨髓，用生理鹽水沖洗干凈后裝入無菌袋中密封保存，經(jīng)鈷-60照射滅菌1 d后放入-70℃深低溫冰箱去抗原3周，用生理鹽水沖洗干凈后留置備用。

手術方法：兩組均用濃度為10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量2.0～3.0 mL/kg，追加劑量0.5 mL/kg。麻醉成功后，右大腿內側脫毛備皮后，取仰臥位固定于兔板，手術區(qū)消毒、鋪無菌單。沿白兔大腿內側伴隱動脈走行做一約4.0 cm長的手術切口，鈍性分離軟組織并注意保護隱動脈。將同種異體骨段放置在股直肌與股內側肌間并用兩根0.8 mm的克氏針固定在股骨上，隨后逐層縫合肌肉、肌膜、皮膚。

術后處理：所有動物均單籠喂養(yǎng)，慶大霉素肌注8萬U/次，2次/d，連續(xù)注射3 d預防切口感染。術后第2周手術切口愈合良好給予拆線處理。觀察組造模動物第2周起于右側后腿術區(qū)周圍行體外沖擊波干預。操作時耦合劑盡量避開切口，設置頻率4 Hz，壓力1 bar，能量輸出為0.16 mJ/mm2，予以單次沖擊1 500次，1次/周，共10次，整個干預過程中不予麻醉。在喂養(yǎng)過程中，未發(fā)生感染、死亡現(xiàn)象。

1.3 觀察指標

大體標本觀察：兩組白兔分別于術后第2、4、8、10、12周各取10只白兔耳緣靜脈空氣栓塞后，沿原手術切口進入。觀察異位同種異體骨段生長情況。然后剝離骨段周圍軟組織，進一步觀察骨段表面變化。

免疫組織化學染色及免疫熒光檢測：取出標本后即用10%甲醛溶液固定24 h。脫水、脫鈣、石蠟包埋、切片、HE染色，每組任取10切片。常規(guī)脫蠟脫水，通過免疫熒光染色法對特異性標記物Ⅰ型膠原蛋白進行原位熒光標記。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。分析數(shù)據(jù)結果采用均數(shù)±標準差(±s)表示；對同一組內各觀察指標在不同時間點和兩組間觀察指標在同一時間點的比較采用獨立樣本t檢驗。若P＜0.05認為兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

術后14 d兩組動物切口均愈合良好，無紅腫，無炎性滲出，給予拆線處理。術后第2周，沿原切口逐層切開皮膚、肌肉后觀察到兩組同種異體骨骨段表面較光滑，無明顯變化。術后第4周觀察組同種異體骨骨段表面開始覆蓋少許結締組織，與第2周骨段相比出現(xiàn)少量骨吸收陷窩；對照組觀察到同種異體骨骨段與周圍組織粘連疏松，同種異體骨骨段表面仍較光滑，吸收陷窩不明顯。術后第8周，兩組同種異體骨骨段與周圍組織貼附緊密，同種異體骨骨段表面有較多結締組織覆蓋并且觀察組骨段表面陷窩較對照組多且深。術后第10周，兩組同種異體骨骨段與周圍組織貼附緊密，同種異體骨骨段表面陷窩進一步加深。術后第12周，兩組同種異體骨骨段均被結締組織嚴密包裹，不易分離，同種異體骨表面陷窩深度及個數(shù)差別較小，但相比第10周時同種異體骨骨段表面陷窩加深。

2.2 組織學觀察

從圖1中看出，第2周時，觀察組和對照組哈弗管周圍出現(xiàn)少許肉芽組織；第4周時，觀察組哈弗管內出現(xiàn)較多新生微血管和一些新生的骨質，對照組哈弗管內新生微血管增多，有少許類骨質不規(guī)律的分布在管腔旁，較觀察組少；第8周時，觀察組哈弗管腔周圍可見較多骨細胞，新生骨組織成熟、致密，對照組有部分成骨細胞分布在哈弗管周圍，新骨生成較觀察組少且不規(guī)律；第10周時，觀察組和對照組管腔周圍骨細胞均較前期增加，新生骨組織均成熟致密；第10至第12周，觀察組新生骨組織規(guī)律地分布在管腔周圍，變化與第10周不明顯；對照組與觀察組第10周相似。

2.3 免疫熒光檢測結果

從圖2和表1可以看出兩組Ⅰ型膠原蛋白整體變化趨勢：觀察組在第8周前Ⅰ型膠原蛋白吸光度值一直在緩慢上升，第8周至第12周Ⅰ型膠原蛋白吸光度值呈下降趨勢；前8周每次觀察點Ⅰ型膠原蛋白吸光度值與上一觀察點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，第8周與第10周和第12周比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。對照組從第2周至第10周Ⅰ型膠原蛋白吸光度值一直處于上升狀態(tài)，每次觀察點Ⅰ型膠原蛋白吸光度值與上一觀察點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，第10周至第12周出現(xiàn)下降趨勢，第10周與第12周比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

圖 1 術后不同時間點標本異體骨的組織學觀察（HE×200），A1-A5 為對照組第 2、4、8、10、12 周；B1-B5 為觀察組第 2、4、8、10、12 周

圖 2 術后同種異體骨標本Ⅰ型膠原蛋白（免疫熒光染色×200），A1-A5 為對照組第 2、4、8、10、12 周；B1-B5為觀察組第 2、4、8、10、12 周

表1 觀察組與對照組I型膠原蛋白吸光度值比較(±s)

表1 觀察組與對照組I型膠原蛋白吸光度值比較(±s)

注：a：組內第4周與第2周比較，P＜0.05；b：組內第8周與第4周比較，P＜0.05；c：組內第10周與第8周比較P＜0.05；d：同一時間點組間比較，P＜0.05

組別 n 第2周 第4周 第8周 第10周 第12周對照組 50 12.16±1.06 18.92± 4.33a 34.73±8.41b 45.07±6.02c 43.76± 7.81觀察組 50 12.31±1.10 24.02±10.28ad 47.57±3.50bd 45.89±5.10d 44.04±12.27

3 討論

由感染、腫瘤、創(chuàng)傷、骨髓炎手術清創(chuàng)等導致的骨缺損，一直是骨科研究的熱點[6-7]。同種異體骨移植具有來源豐富、使用方便、骨細胞已被滅活、免疫原性低、具有結構支持等諸多優(yōu)點。但同種異體骨在修復骨缺損時，需經(jīng)過血管再生及骨再生[8]。李揚等[9]證實兔大段感染脛骨經(jīng)煮沸滅菌后異位于肌肉豐富的知名血管處，使其再血管化，轉化為血管化骨是可行的。但人的皮質骨更厚、骨密度更高，同種異體骨變成活化骨所需的時間更長。因此，加快同種異體骨活化進程，縮短預構骨皮瓣形成時間尤為重要。

隨著對體外沖擊波（ESW）研究的不斷深入，梁斌等[10]認為體外沖擊波治療骨不連是一種創(chuàng)傷小、效果確切的較理想的治療方法。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)沖擊波可以促進各種促血管生成和促骨生長因子的表達，促進了骨折的愈合，為沖擊波治療骨缺損、骨不連、骨壞死提供了有力證據(jù)。因此，本實驗選擇體外沖擊波（ESW）促進同種異體骨骨活化進程。

對于同種異體骨，采用鈷-60輻射，凍干處理降低免疫原性，明顯降低排斥反應[12]。Wei等[13]使用了兩種凍干同種異體骨治療大鼠股骨骨缺損，通過micro-CT掃描和組織學分析，凍干同種異體骨均持續(xù)形成新骨，具備良好的骨誘導和成骨能力。因此異體骨采用凍干處理、鈷-60輻射后可被廣泛應用于各種病因導致的骨缺損，為預構骨皮瓣創(chuàng)造條件。

Ⅰ型膠原蛋白作為骨基質中主要的有機成分，可間接地反應出異位的同種異體骨的成骨細胞和骨細胞的數(shù)量及同種異體脫鈣骨的骨活性程度[14]。在同種異體骨骨活化過程中成骨細胞的增殖和分化非?；钴S，合成和分泌Ⅰ型膠原蛋的能力也隨之增強，有效地促進新骨形成。

本實驗中我們將同種異體骨埋于兔右側大腿的股直肌與股內側肌之間，術后給予體外沖擊波（ESW）輔助治療。第2、4、8、10、12周通過測量同種異體骨內的Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光強度值顯示：觀察組和對照組分別在第8周和第10周Ⅰ型膠原蛋白免疫熒光強度達到峰值。觀察組的骨活化速度快于對照組，達到峰值時，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。主要因為體外沖擊波（ESW）不僅具有誘導成骨細胞的生成，并且具有促進骨組織的新陳代謝作用。當體外沖擊波遇到骨組織時，形成的壓力波作用于細胞膜，導致細胞膜的離子通道微觀極性變化，加速細胞內外離子交換過程，骨組織的新陳代謝加快[15]，減少骨活化時間；骨折端會形成類似新鮮骨折血管反應，成骨細胞被激活，局部微血管會逐步增多；促進周圍組織釋放大量具有多種活性的生物調節(jié)因子和細胞因子，直接誘導多種細胞分化并形成成骨細胞[16]。

綜上所述，體外沖擊波（ESW）可明顯加快異位兔同種異體骨骨活化進程，縮短其完成骨活化時間，為臨床加速預構同種異體骨骨皮瓣修復骨缺損提供理論依據(jù)。