顏春魯 安方玉 劉永琦 蘇 韞 張利英 李佳蔚王彩霞 王統(tǒng)香 王國文 李孟翰

1（甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 蘭州730000）

2（甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室 蘭州730000）

3（敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室 蘭州730000）

隨著重離子（12C6+）放療技術(shù)在臨床腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，其對腫瘤病灶周圍正常組織產(chǎn)生的輻射損傷效應(yīng)也日益受到研究者的關(guān)注。這種輻射損傷效應(yīng)主要表現(xiàn)為DNA 損傷、細(xì)胞增殖或凋亡、基因表達(dá)改變、表觀遺傳學(xué)改變、炎癥反應(yīng)、致瘤性轉(zhuǎn)化，甚至癌癥形成等［1-3］。因而探明重離子輻射旁效應(yīng)累及組織細(xì)胞、旁器官規(guī)律、發(fā)生機(jī)制及如何防治這種輻射損傷效應(yīng)等具有重要意義。中藥以低毒、高效、多靶點和整體調(diào)制等優(yōu)勢成為輻射防護(hù)研究的熱點［4-6］。摘自《醫(yī)學(xué)心悟》中的經(jīng)方黃芪湯，主要由黃芪、熟地、麥冬、人參、枸杞子和五味子組成，全方具有益氣滋陰，生津養(yǎng)血之效。本實驗旨在探討黃芪湯對12C6+離子束輻射所致大鼠腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床輻射損傷的防護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wister大鼠50只，體質(zhì)量（180±20） g雌雄各半，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心，實驗動物質(zhì)量合格證號為SCXK（甘）2018-0005，所有動物自由飲水、攝食1 周。本實驗經(jīng)通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心實驗動物倫理委員會的嚴(yán)格審查。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號分別為：H7806580、H7825350）；β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3等引物 基 因 序 列 為： β -actin 上 游 引 物 5'-TGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3'，Size：22，下游引物5'-GGCAGTAATCTCCTTCTGCATC-3'，Size：25，片段長度105 bp；Bcl-2 上游引物5'-CTTCTTCCAGATGGTGAGTGAG-3'， Size： 22，下游引物5'-GTGGATGACTGAGTACCTGAAC-3'，size：22，片段長度125 bp ；Bax 上游引物5'-GATGGCCTCCTTTCCTACTTC-3'，size：21，下游 引 物 5'-CTTCTTCCAGATGGTGAGTGAG-3'，size：22，片段長度96 bp；Caspase-3 上游引物5'-CTTGGAAAGCATCCAGCAATAG-3'， size： 22，下游引物5'-ACTCAGCACCTCCATGATTAAG-3'，size：22，片段長度122 bp（上述引物均由TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計并合成）；兔抗大鼠Bcl-2 抗體（美國Gene Tex 公司，批號：42970）；兔抗大鼠Bax 抗體（美國Gene Tex 公司，批號：39988）；兔抗大鼠Caspase-3 抗體（美國Gene Tex公司，批號：42753）；GAPDH抗體（美國Gene Tex公司，批號：41323）。

1.3 藥物及給藥劑量

黃芪湯方中的所有藥材均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，中藥原藥材均由本校甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究室進(jìn)行質(zhì)量鑒定。黃芪湯由30 g黃芪、15 g熟地、15 g麥冬、15 g人參、15 g枸杞子和10 g五味子組成，人的臨床用量為100 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法得出劑量（100 g×0.018×5=9.0 g/(kg·d)）作為中劑量，則黃芪湯高、中、低劑量分別為18.0 g/(kg·d)、9.0 g/(kg·d)、4.5 g/(kg·d)。

1.4 主要儀器

美國Q5000 超微量紫外可見分光光度計（上海在途生物科技有限公司）；PCR熱循環(huán)儀（上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司）；7500 型實施熒光定量PCR 擴(kuò)增儀（上海興曼生物科技有限公司）；Western-blot 分析儀（BIO-RAD）；BX53 型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5 動物分組及處理

SPF 級Wister大鼠自由飲水、攝食1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組，單純輻射模型組，黃芪湯高、中、低劑量組，每組10 只。正常對照組和單純輻射模型組給予等量生理鹽水灌胃，黃芪湯高、中、低劑量組給予黃芪湯灌胃（劑量為18.0 g/(kg·d)、9.0 g/(kg·d)、4.5 g/(kg·d)），連續(xù)7 d。第8 天腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉各組大鼠，除正常對照組大鼠外，其余各組大鼠腦部均給予4 Gy12C6+離子束單次照射。重離子照射是在中國科學(xué)院近代物理研究蘭州重離子加速器研究裝置的淺層腫瘤治療終端上所完成的，照射過程中的束流為12C6+離子束，具體照射方法參考文獻(xiàn)［5］，采用坪區(qū)照射，照射過程中的能量為165 MeV，LET 為20 keV/μm，吸收劑量率為4 Gy/min，用空氣電離室監(jiān)測劑量，照射劑量為4 Gy。輻射后第7天稱量各組大鼠的體質(zhì)量，股動脈采血，處死大鼠，分離血清，摘取腦組織備用。

1.6 動物體質(zhì)量及腦系數(shù)測定

輻射后第7天稱量各組大鼠體質(zhì)量，股動脈采血處死各組大鼠，用生理鹽水沖洗腦組織并用吸水紙吸干后稱重，計算大鼠的腦系數(shù)。大鼠腦系數(shù)（mg/g）=腦質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.7 腦組織病理改變觀察

稱重后的腦組織用手術(shù)刀片做冠狀腦切片后放在4%多聚甲醛固定液中24 h，梯度乙醇脫水后二甲苯處理及常規(guī)石蠟包埋，60 ℃過夜后脫蠟、沖洗、蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)改變。

1.8 腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡測定

將適量腦組織制作冰凍腦片后用TUNEL 試劑盒進(jìn)行染色，抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡下觀察切片，隨機(jī)各選擇5 個×100 視野區(qū)域，每個視野區(qū)域至少包含30 個細(xì)胞；使用Image proplus 6.0 軟件分析對每個視野范圍內(nèi)的總細(xì)胞個數(shù)和凋亡細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行計數(shù)。細(xì)胞凋亡百分率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.9 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達(dá)測定

腦組織RNA 提取用4 ℃的Trizol 試劑，提取后立即上機(jī)測定RNA 含量和OD260/OD280的比值。RT-PCR 法合成模板cDNA 后，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性40 s，58 ℃退火50 s，60 ℃延伸2 min。共42 個循環(huán)。實驗過程中每個樣品至少設(shè)置3 個復(fù)孔，以β-actin基因為內(nèi)參基因，用2-△△Ct來表示基因相對表達(dá)含量。

1.10 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)測定

腦組織總蛋白的提取用4 ℃的RPMI 裂解液。BCA 法測定各樣品的蛋白含量，將所有的樣品用裂解液稀釋成4 mg/L，取10 μL 與4×上樣緩沖液混勻，調(diào)整蛋白進(jìn)樣濃度為40 μg/10 μL。點樣后經(jīng)過SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉等過程，加兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3 和GAPDH 等一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3～4 次，二抗室溫孵育2 h 后TBST 洗膜3～4 次。電化學(xué)發(fā)光液化學(xué)發(fā)光顯影、定影后用Western-blot 分析儀進(jìn)行圖片采集與拍照。蛋白條帶灰度值用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行處理與分析，目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值。

1.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理

所有實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 22.0 軟件分析，所得結(jié)果用“±s”表示，組別之間的差異分析方法采用One-Way-Anova，p＜0.05 為有顯著性差異，p＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 腦系數(shù)測定

單純輻射模型組大鼠體質(zhì)量和腦系數(shù)均顯著降低（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組大鼠腦系數(shù)顯著升高，并且其高劑量組體重也顯著升高（p＜0.05），見表1。

表1 各組動物體質(zhì)量及腦系數(shù)檢測結(jié)果Table 1 The weight and the cerebral coefficient in each group (±s,n=10)

表1 各組動物體質(zhì)量及腦系數(shù)檢測結(jié)果Table 1 The weight and the cerebral coefficient in each group (±s,n=10)

注：1p＜0.05，2 p＜0.01，與單純輻射模型組比較。Note: 1p＜0.05, 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

腦系數(shù)/(mg?g?1)Cerebral coefficient 7.50±0.772 4.84±0.48 6.82±0.381 6.61±0.331 5.98±0.43組別Group正常對照組Normal control group單純輻射模型組Radiation alone model group黃芪湯高劑量組Huangqi decoction high-dose group黃芪湯中劑量組Huangqi decoction middle-dose group黃芪湯低劑量組Huangqi decoction low-dose group體質(zhì)量/g Body mass 235.09±19.912 174.37±17.02 224.34±21.731 198.44±15.18 187.36±20.99

2.2 觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)改變

正常對照組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、規(guī)則，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；單純輻射模型組大鼠腦組織排列疏松，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)細(xì)胞核固縮、深染，血管周圍間隙增寬，神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬；黃芪湯低、中劑量組腦組織排列疏松，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，血管周圍間隙增寬；黃芪湯高劑量組腦組織排列疏松及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少等情況較單純輻射組明顯好轉(zhuǎn)，但未完全恢復(fù)正常，見圖1。

2.3 腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率測定

單純輻射模型組和黃芪湯低劑量組大鼠腦組織的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象，黃芪湯中、高劑量組大鼠腦組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯減輕，但未恢復(fù)到正常組水平。單純輻射模型組大鼠腦組織的神經(jīng)細(xì)胞存在大量凋亡細(xì)胞（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組的腦組織細(xì)胞凋亡百分率顯著降低（p＜0.01）。見圖2和圖3。

2.4 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達(dá)測定

單純輻射模型組大鼠腦組織Bcl-2 基因表達(dá)顯著降低，Bax 和Caspase-3 基因表達(dá)顯著升高（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組大鼠腦組織Caspase-3基因表達(dá)顯著降低，黃芪湯高劑量組大鼠腦組織Bax 基因表達(dá)也顯著降低，Bcl-2 基因表達(dá)顯著升高（p＜0.01）。見表2。

表2 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達(dá)的檢測結(jié)果Table 2 Gene expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10）

表2 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表達(dá)的檢測結(jié)果Table 2 Gene expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10）

注：2 p＜0.01，與單純輻射模型組比較。Note: 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

Caspase-3(2-ΔΔCt)0.27±0.092 1.03±0.05 0.44±0.052 0.46±0.112 1.12±0.17組別Group正常對照組Normal control group單純輻射模型組Radiation alone model group黃芪湯高劑量組Huangqi decoction high-dose group黃芪湯中劑量組Huangqi decoction middle-dose group黃芪湯低劑量組Huangqi decoction low-dose group Bcl-2(2-ΔΔCt)2.67±0.412 1.05±0.07 2.03±0.152 1.10±0.17 1.04±0.19 Bax(2-ΔΔCt)0.35±0.062 1.08±0.02 0.44±0.072 1.05±0.20 1.27±0.15

2.5 腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)測定

單純輻射模型組大鼠腦組織Bcl-2 蛋白量表達(dá)顯著降低，Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著升高（p＜0.01）；黃芪湯中、高劑量組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著降低，黃芪湯高劑量組大鼠腦組織Bax 蛋白表達(dá)量也顯著降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著升高（p＜0.01）。見表3和圖4。

表3 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白灰度值的檢測結(jié)果Table 3 Protein expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10)

表3 各組動物腦組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白灰度值的檢測結(jié)果Table 3 Protein expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10)

注：1p＜0.05，2 p＜0.01，與單純輻射模型組比較。Note: 1p＜0.05, 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

Caspase-3(OD)0.32±0.042 0.69±0.09 0.40±0.082 0.47±0.052 0.74±0.02組別Group正常對照組Normal control group單純輻射模型組Radiation alone model group黃芪湯高劑量組Huangqi decoction high-dose group黃芪湯中劑量組Huangqi decoction middle-dose group黃芪湯低劑量組Huangqi decoction low-dose group Bcl-2(OD)0.87±0.092 0.35±0.05 0.45±0.031 0.38±0.03 0.34±0.04 Bax(OD)0.13±0.012 0.56±0.04 0.21±0.022 0.54±0.08 0.63±0.10

3 討論

重離子輻射發(fā)病過程具有急、猛、快、多，廣等特點，繼而引起機(jī)體各臟腑功能紊亂、氣血陰陽失調(diào)等惡候，兼挾火熱痰瘀、遷延難愈，其引發(fā)的病理演變過程符合毒邪致病的特點，因此，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“毒邪”的范疇［7-9］。機(jī)體受輻照后不僅可耗損人體正氣，還使體內(nèi)火熱毒邪亢盛，嚴(yán)重耗損津液。因此，中醫(yī)認(rèn)為火、瘀、虛是輻射損傷的基本病機(jī)［10］。根據(jù)輻射損傷的基本病機(jī)，中醫(yī)藥防護(hù)輻射損傷以培元固本、益氣滋陰、活血散瘀為基本治則。黃芪湯方中，熟地、枸杞子，滋陰補腎；五味子，益氣生津，滋腎養(yǎng)陰；麥冬，潤肺養(yǎng)陰；黃芪，補中益氣；人參大補元氣，補脾益肺，生津養(yǎng)血。諸藥合奏發(fā)揮益氣滋陰，生津養(yǎng)血之功效，使得“正氣存內(nèi)，邪不可干”，起到防護(hù)輻射損傷的作用。

研究表明，輻射損傷最早期的生物學(xué)效應(yīng)是細(xì)胞凋亡［11］。Bax、Bcl-2 和Caspase-3 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要蛋白。Bcl-2是屬于Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，Bax 是屬于Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，Caspase-3是Bcl-2家族通過線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡的下游促凋亡蛋白［12-14］。在線粒體凋亡調(diào)控通路中，當(dāng)Bax形成Bax-Bax同源二聚體時會促進(jìn)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax 形成Bax-Bcl-2 異源二聚體時會抑制細(xì)胞凋亡［15］。重離子輻射會激活機(jī)體受損組織的Bax過度表達(dá)，過度表達(dá)的Bax可通過線粒體途徑激活下游的Caspase-3，激發(fā)Caspase 發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)受損組織的細(xì)胞凋亡［16］。但是，重離子輻射同時又會抑制機(jī)體受損組織Bcl-2 的過度表達(dá)，使Bax 無法與Bcl-2 形成異源二聚體，從而無法抑制Bax 蛋白對線粒體下游Caspase-3 的激活，進(jìn)一步促進(jìn)了Caspase的級聯(lián)效應(yīng)，促進(jìn)受損傷組織的細(xì)胞凋亡［17-18］。

本研究結(jié)果顯示，4 Gy12C6+離子束照射大鼠腦組織后，單純輻射模型組大鼠體質(zhì)量及腦系數(shù)在照射后第7 天均顯著降低，并且其腦組織的Bcl-2的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)也在照射后第7 天顯著降低，而腦組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加，Bax和Caspase-3 的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)則在照射后第7天顯著升高。腦組織病理形態(tài)顯示，單純輻射模型組大鼠腦組織排列疏松，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)細(xì)胞核固縮、深染，血管周圍間隙增寬，神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬。說明12C6+離子束輻照后，凋亡相關(guān)蛋白Bax 過度表達(dá)和Bcl-2 過度抑制會促進(jìn)線粒體凋亡通路激活，激活Caspase 的級聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)腦組織的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)一步加重腦組織的病理形態(tài)損傷（見圖5）。

而在12C6+離子束照射大鼠腦組織之前預(yù)先給予黃芪湯干預(yù)1周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪湯中、高劑量組的腦系數(shù)顯著升高，而腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯降低，Caspase-3 的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均顯著降低；黃芪湯高劑量組體質(zhì)量及腦組織Bcl-2 的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均升高，而其Bax的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均顯著降低。腦組織病理結(jié)果顯示，黃芪湯高劑量組腦組織排列疏松及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少等情況較單純輻射組明顯好轉(zhuǎn)，但未完全恢復(fù)正常。說明黃芪湯的干預(yù)機(jī)制可能是通過抑制Bax過度表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2 過度表達(dá)來抑制線粒體凋亡通路激活，抑制Caspase 的級聯(lián)反應(yīng)，從而抑制受12C6+離子束照射腦組織的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而緩解腦組織的病理形態(tài)損傷，發(fā)揮抗輻射作用（見圖6）。

綜上所述，黃芪湯中的黃芪、熟地、麥冬、人參、枸杞子和五味子通過益氣、生津、養(yǎng)血和滋陰等發(fā)揮抗輻射作用，具體機(jī)制可能是通過抑制線粒體凋亡通路來實現(xiàn)的。