李如意，尹軍峰，鄒 純，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081)

紅茶菌是一種傳統(tǒng)的功能性飲料，它是由酵母聯(lián)合醋酸菌發(fā)酵茶糖水而制成[1]。紅茶菌菌液中富含茶多酚、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、醋酸、乳酸、D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯等活性物質(zhì)[2-3]，具有抗氧化、抑菌、解毒抗癌等功效。紅茶菌是一種歷史悠久的茶飲料，它的出現(xiàn)最早可以追溯到我國秦朝時期，之后陸續(xù)流傳到日本、俄羅斯、德國等地。近幾年，紅茶菌在北美、澳洲和歐洲等地區(qū)迅速發(fā)展，星巴克、可口可樂、百事公司等多家飲料巨頭相繼進軍紅茶菌領(lǐng)域[4]。北美地區(qū)成為紅茶菌最大的消費市場，占據(jù)全球的39.4%[5]。預(yù)計到2025年，紅茶菌飲料的國際市場規(guī)模將達到35億～50億美元[6-8]，其發(fā)展前景廣闊。

盡管紅茶菌在我國飲用歷史悠久，但它在國內(nèi)的生產(chǎn)還停留于家庭式、作坊式的階段。在這些粗放式生產(chǎn)中紅茶菌容易出現(xiàn)雜菌污染、品質(zhì)不穩(wěn)定等問題，導(dǎo)致市場上鮮有具備較強競爭力的產(chǎn)品，國內(nèi)市場占有率也很低。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們對紅茶菌的認識和研究也逐步深入，這為紅茶菌的產(chǎn)業(yè)化提供了理論依據(jù)。在此背景下，本文梳理和總結(jié)了近年來紅茶菌在微生物組成及其共生關(guān)系、發(fā)酵影響因素與保健功能等方面的研究現(xiàn)狀，提出了目前紅茶菌研究中主要存在的問題，并對其未來發(fā)展進行了展望。

1 紅茶菌微生物的研究現(xiàn)狀

1.1 紅茶菌的微生物組成

醋酸菌和酵母菌是紅茶菌中的主要菌種，少數(shù)紅茶菌還含有乳酸菌。研究者們從紅茶菌中分離得到的主要細菌和酵母如表1所示。不同文獻報道的紅茶菌菌種組成存在一定差異，一般是由多種醋酸菌與酵母菌形成的共生體，少數(shù)研究者還在紅茶菌中發(fā)現(xiàn)了乳酸菌。

1.2 紅茶菌中各微生物間的共生關(guān)系

醋酸菌、酵母菌、乳酸菌為紅茶菌中的共生菌落，它們通過相互間的合作與競爭關(guān)系使紅茶菌產(chǎn)生大量的活性成分。酵母菌作為“啟動子”，在發(fā)酵初期(0～3 d)將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并通過進一步糖酵解產(chǎn)生乙醇[38]。當(dāng)培養(yǎng)液中含有葡萄糖和乙醇后，醋酸菌開始大量繁殖，它能將葡萄糖和乙醇分別轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸和乙酸[39]。乙酸的存在會刺激酵母菌產(chǎn)生乙醇，乙醇的生成能刺激醋酸菌產(chǎn)生更多乙酸[40]。乳酸菌是一種益生菌，它能利用酵母菌的部分代謝物如維生素和蛋白質(zhì)等進行生長繁殖，并產(chǎn)生一定量的乳酸。培養(yǎng)液中含有一定量的乙醇后乳酸菌逐漸衰弱，酵母菌重新繁殖并占絕對優(yōu)勢[41]。

2 紅茶菌發(fā)酵的影響因素

2.1 原料對紅茶菌發(fā)酵的影響

紅茶菌的發(fā)酵原料主要包括茶葉和糖類。研究者主要分析了不同茶葉種類與濃度、糖源種類與濃度對紅茶菌品質(zhì)的影響，也有一些研究者將果蔬汁或中草藥等植物提取物應(yīng)用于紅茶菌的培養(yǎng)，形成特殊的風(fēng)味或功效。

在茶葉種類選擇方面，紅茶或綠茶通常是紅茶菌發(fā)酵的底物；后來研究者們開始利用黑茶、烏龍茶發(fā)酵紅茶菌，并研究比較了紅茶、綠茶、黑茶、烏龍茶在紅茶菌發(fā)酵過程中對其功能性成分含量和菌膜生長的影響。孫協(xié)軍等[42]研究發(fā)現(xiàn)，紅茶菌總酸和蛋白質(zhì)含量在以紅茶、綠茶、烏龍茶、黑茶作為發(fā)酵原料時相近，多酚含量和糖度在以綠茶或紅茶作為發(fā)酵原料時相對較高。過慈妹[43]研究發(fā)現(xiàn)，以綠茶為原料發(fā)酵紅茶菌形成菌膜的時間較紅茶短，且菌膜量較紅茶增加；而菌膜量在以烏龍茶為發(fā)酵原料時較少，黑茶作為發(fā)酵原料時則無菌膜長出。就抑菌物質(zhì)而言，紅茶菌在不同種類茶湯中發(fā)酵對抑菌物質(zhì)的最終形成影響不大。茶汁濃度也是影響紅茶菌發(fā)酵的重要因素，濃度過低可能導(dǎo)致產(chǎn)品的茶味不足，濃度過高則可能抑制紅茶菌生長。王榮榮等[44]發(fā)現(xiàn)，茶汁濃度低于0.9%時，隨著茶汁濃度的增加菌膜生成量增加，茶汁濃度大于0.9%后菌膜的生成量下降。這可能是由于茶多酚物質(zhì)含量的增加在一定程度上會抑制紅茶菌中微生物的生長，所以當(dāng)紅茶菌茶汁濃度過大后，菌膜的生成量開始下降[44]。袁磊等[40]研究發(fā)現(xiàn)，茶葉添加量越大，產(chǎn)酸率越高。綜上所述，茶汁中的氨基酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)能夠促進紅茶菌的生長，但其中的茶多酚等物質(zhì)在濃度較高時會抑制紅茶菌的生長，此外，茶汁濃度還影響了紅茶菌的風(fēng)味品質(zhì)。因此，在紅茶菌的制備中需將茶葉添加量控制在合適的范圍。在糖源種類與濃度選擇方面，研究者主要比較了紅糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖等糖源對紅茶菌主要成分和pH的影響，并進一步分析了不同糖濃度對紅茶菌產(chǎn)酸率和感官品質(zhì)的影響。孫協(xié)軍等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在以紅糖、蔗糖、葡萄糖作為糖源發(fā)酵的紅茶菌中，紅糖發(fā)酵的紅茶菌茶多酚與蛋白質(zhì)含量最低，pH最高；蔗糖、葡萄糖發(fā)酵的紅茶菌蛋白質(zhì)含量、pH沒有差異，但蔗糖發(fā)酵的紅茶菌茶多酚含量高于葡萄糖發(fā)酵的紅茶菌中茶多酚含量。Reiss[45]在20～22 ℃條件下研究不同濃度不同糖源(蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖)對紅茶菌pH和代謝產(chǎn)物的影響，結(jié)果表明，果糖和蔗糖能產(chǎn)生較多的乙醇，而葡萄糖則產(chǎn)生少量的乙醇。在糖添加量對紅茶菌的影響方面，袁磊等[40]發(fā)現(xiàn)，糖添加量較低時紅茶菌味淡色淺，糖添加量較高時紅茶菌過甜色深，并且較高的糖添加量會形成高滲透壓，從而抑制微生物的生長，故不宜添加高濃度的糖。

表1 紅茶菌共生體系中的微生物組成

此外，為了賦予紅茶菌更好的保健功效，近年來出現(xiàn)了許多將果蔬汁或中草藥等植物提取物應(yīng)用于紅茶菌培養(yǎng)的報道。比如往紅茶菌中分別添加肉桂[46]、小麥草汁[47]、葡萄汁[48]、各類水果[49]、老山芹汁[50]、枸杞金銀花[51]、紅棗汁[52]和石榴汁[53]等等，使得制備的紅茶菌口感獨特，香氣各異，且營養(yǎng)成分和抗氧化活性得到改善。

2.2 培養(yǎng)條件對紅茶菌發(fā)酵的影響

近年來，有關(guān)紅茶菌培養(yǎng)條件的研究主要集中在研究發(fā)酵溫度、pH與通氣方式對紅茶菌品質(zhì)的影響。

培養(yǎng)溫度對紅茶菌中菌種的生長、產(chǎn)酸、菌膜生成和紅茶菌口味等均有影響。就菌種生長溫度而言，26～30 ℃為酵母菌的最適生長溫度[34]，醋酸菌在28 ℃時生長最快，但不得超過40 ℃[54]。在產(chǎn)酸與代謝物方面，實驗表明，菌種在紅茶菌中發(fā)酵產(chǎn)酸的最佳溫度是30 ℃[54]。分別在22、30 ℃發(fā)酵紅茶菌，在30 ℃下紅茶菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸、葡萄糖、果糖和維生素C含量更高[55]；這可能是由于30 ℃條件下菌種生長速度加快，代謝物生成量增多。喬宏萍等[56]分別在20、25、30、35 ℃下發(fā)酵紅茶菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在20 ℃下紅茶菌的菌膜產(chǎn)生較少且口味差，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌膜生成與口味均有改善。

pH是影響紅茶菌發(fā)酵的最重要環(huán)境參數(shù)之一，它會影響紅茶菌菌種的生長和抑菌效果。王麗麗等[57]研究表明，低酸條件可促進紅茶菌的生長繁殖，但pH過低則不利菌種的生長。醋酸菌可耐受的pH范圍是3.6～6.3，酵母菌的最佳pH取決于菌株種類，但平均范圍在4.5～6.5[58]。張虎成等[59]研究發(fā)現(xiàn)，抑菌圈在pH為7時最小，當(dāng)pH<7時，抑菌圈隨pH的逐漸增大而減小，當(dāng)pH>7時，抑菌圈隨pH的升高又逐漸增大。由于較低pH會導(dǎo)致飲料的總體感官品質(zhì)下降，故應(yīng)合理把握紅茶菌飲料的pH；有研究表明，當(dāng)總酸度達到4～5 g·L-1時，獲得的酸性飲料令人愉悅[60]。

傳統(tǒng)的紅茶菌采用的是靜止培養(yǎng)的方式，但一些研究者發(fā)現(xiàn)，通過振蕩通氣的方式可加速紅茶菌生長、降低菌膜的生成量并提高紅茶菌產(chǎn)率。醋酸菌、酵母菌作為紅茶菌中的主要菌種，在氧氣存在的情況下能更好地將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙酸、乙醇等物質(zhì)，并為乳酸菌的生長提供豐富的營養(yǎng)基質(zhì)[61]，故通氣方式在紅茶菌菌種的生長中發(fā)揮著重要的作用。王碩等[62]研究表明，振蕩通氣培養(yǎng)可以促進菌群生長(酵母菌和木醋酸菌數(shù)量分別是靜止培養(yǎng)時的3倍和4倍)，抑制菌膜生成，從而減少糖類等碳源物質(zhì)的損耗。李昊燃[63]研究表明，靜態(tài)培養(yǎng)的菌膜呈薄膜狀且產(chǎn)量高，而振蕩培養(yǎng)的菌膜呈絲帶狀或者絮狀且持水性比靜態(tài)培養(yǎng)好。綜上所述，通氣方式對紅茶菌的生長和產(chǎn)酸、菌膜的產(chǎn)量和性質(zhì)均具有較大影響。

2.3 菌種組成對紅茶菌發(fā)酵的影響

傳統(tǒng)的紅茶菌培養(yǎng)方式是在煮沸過的糖茶水中加入帶有菌膜的紅茶菌液，并對其進行靜置培養(yǎng)。這種方式發(fā)酵時間長，易染雜菌，且由于紅茶菌中復(fù)雜的微生物組成導(dǎo)致紅茶菌口味不盡相同，難以滿足標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的需要[39]。為早日實現(xiàn)紅茶菌工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，近年來出現(xiàn)的“從紅茶菌和自然界中篩選適合生產(chǎn)紅茶菌的純菌種并進行組合搭配”成為研究的一個新思路。

研究表明，純菌混合發(fā)酵技術(shù)對紅茶菌發(fā)酵具有縮短培養(yǎng)周期、促進功能性成分生成、提高部分保健功效的作用。王鴻志等[64]和林娟等[65]以不同的菌種組合發(fā)酵紅茶菌，與傳統(tǒng)紅茶菌相比，紅茶菌的發(fā)酵時間縮短，且滋味爽口、風(fēng)味獨特。Nguyen等[36]從傳統(tǒng)紅茶菌中篩選適合生產(chǎn)葡萄糖醛酸的酵母與醋酸菌，并將篩選出的酵母DekkerabruxellensisKN89與醋酸菌Gluconacetobacterintermedius按4：6(2種菌的活細胞數(shù)比)混合發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵7 d紅茶菌中可生成175.8 mg·L-1的葡萄糖醛酸，這為安全生產(chǎn)富含葡萄糖醛酸的紅茶菌提供了參考。Wang等[66]研究表明，用巴氏醋桿菌、木葡糖醋桿菌和拜氏接合酵母混合發(fā)酵獲得的紅茶菌比各菌株單獨發(fā)酵的菌液具有更高濃度的有機酸。陳雪嬌等[67]采用自主篩選的醋酸菌純種和市售純菌酵母菌、乳酸菌進行紅茶菌飲品改良發(fā)酵，以及傳統(tǒng)產(chǎn)膜紅茶菌發(fā)酵，對比有效成分發(fā)現(xiàn)，菌種組合搭配生成的紅茶菌發(fā)酵液產(chǎn)酸能力、抗超氧陰離子自由基能力、游離氨基酸、8種必需氨基酸生成能力和SOD活性較傳統(tǒng)的紅茶菌液有明顯的改善。王國增等[68]將釀酒酵母、葡糖醋桿菌和植物乳桿菌按體積比1∶1∶1菌種配比進行復(fù)配，得到的紅茶菌具有較強的抗氧化能力。另外，不同菌種之間混合培養(yǎng)時，微生物之間會因為代謝途徑和代謝能力的不同而相互促進或抑制[69]。

總之，深入研究培養(yǎng)條件、菌種、原料對紅茶菌發(fā)酵的影響是實現(xiàn)紅茶菌的工業(yè)化應(yīng)用、統(tǒng)一紅茶菌工業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。

3 紅茶菌的保健功能研究現(xiàn)狀

近年來，國內(nèi)外對于紅茶菌保健功能的研究主要集中在抗氧化、抑菌、護肝、提高免疫力和防癌抗癌等方面。

3.1 抗氧化功能

3.2 抑菌功能

紅茶菌液對霉菌等真菌的抑制作用有限，但對革蘭氏陰性和陽性細菌具有明顯的抑制作用[75]。目前已報道的可被紅茶菌抑制的微生物有大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、單增李斯特菌、熒光假單胞菌、致病性大腸埃希菌、產(chǎn)毒性大腸埃希菌、豬霍亂沙氏桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希菌、幽門螺桿菌、根瘤膿桿菌、雞沙門氏菌、霍亂弧菌等[68，73，79-82]。研究表明，紅茶菌的抑菌作用主要來源于茶多酚、共生體系在代謝過程中形成的乙酸、葡萄糖酸二酸等代謝產(chǎn)物和多種微生物共同作用形成的抗菌蛋白等[83]。申瑞瑞等[84]通過熱處理試驗和低溫濃縮試驗發(fā)現(xiàn)，紅茶菌發(fā)酵液中可能存在對熱敏感的抑菌活性物質(zhì)，例如多肽類或蛋白類物質(zhì)。李璐路[83]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度酸性物質(zhì)和抑菌蛋白的共同作用使得紅茶菌發(fā)酵液有抑菌效果，且發(fā)酵液總蛋白濃度與抑菌效果呈正相關(guān)。王恩智等[85]研究表明，茶多酚對金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌(尤其是腸道致病菌)具有不同程度的抑制和殺傷作用，其中對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為62.5 mg·mL-1。Greenwalt等[86]和Steinkraus等[87]研究表明，乙酸是紅茶菌發(fā)酵液里具有抑菌作用的重要物質(zhì)，乙酸等有機酸可降低溶液的pH，進而導(dǎo)致酸度引起的缺氧，這可能是致病菌受到抑制的一個重要原因[88]。

3.3 護肝功能

紅茶菌的護肝作用是由于其中的抗氧化成分對肝臟起了抗氧化作用或通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等實現(xiàn)的，但也有研究認為D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯是紅茶菌護肝作用的關(guān)鍵成分[76]。Lee等[89]研究表明，紅茶菌可通過影響脂質(zhì)代謝來保護肝細胞免受脂質(zhì)毒性。吳雅茗等[90]研究發(fā)現(xiàn)，紅茶菌菌液對四氯化碳導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷有保肝降酶的作用，該作用可能與提高小鼠肝臟抗氧化損傷能力有關(guān)。Wang等[76]研究表明，紅茶菌能對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的ICR小鼠急性肝損傷起到改善的作用，這可能得益于D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯。此外，葡萄糖醛酸能與肝臟中的毒素分子結(jié)合，并將它們從機體中清除，從而起到護肝的功效[88]。

3.4 提高免疫力功能

紅茶菌不僅能促進免疫相關(guān)基因的表達，還可以增強免疫細胞活性。王春龍[91]將不同濃度的紅茶菌凍干產(chǎn)物灌給免疫力低下的小鼠，通過qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，枸杞金銀花紅茶菌發(fā)酵飲料可促進IL-2、IL-6、IFN-γ、Cox-2、Mcl-l和Bcl-xL等與免疫相關(guān)的基因表達上調(diào)。Wang等[92]研究表明，高中劑量的紅茶菌能夠增強腹腔巨噬細胞功能和淋巴細胞增殖活性，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。李波清等[93]研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠長期進行紅茶菌灌胃處理可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，并明顯提高小鼠自然殺傷細胞的殺傷活性。

3.5 防癌抗癌功能

紅茶菌中起抗癌作用的主要成分是D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯，有研究認為它能抑制與癌癥發(fā)生有關(guān)的β-葡聚苷酸酶的活性，從而減少致癌物的生成[94]。另外，部分研究者對紅茶菌抗癌機制進行了研究。比如Srihari等[95]研究發(fā)現(xiàn)，紅茶菌通過降低血管生成刺激物的表達可顯著降低前列腺癌細胞的存活率；俸毅等[96]發(fā)現(xiàn)，紅茶菌菌液能夠快速降解亞硝酸鹽，并在降解過程中產(chǎn)生大量的NO，從而對預(yù)防胃腸癌起到一定的保健作用。此外，紅茶菌可以降低胃的pH，這對胃腸道中的有害菌如幽門螺桿菌等有拮抗作用，還可預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生[97]。

4 問題與展望

近年來，雖然人們對紅茶菌在微生物組成、營養(yǎng)成分、發(fā)酵制備技術(shù)、保健功能等方面進行了廣泛研究，但是紅茶菌的研究目前還存在以下不足：(1)研究者對紅茶菌中小分子的功能性成分(如有機酸、酯類)分析得比較透徹，但對一些活性大分子(如抗菌肽)的種類、形成機制研究較少且不深入；(2)隨著高通量測序技術(shù)的日益成熟，紅茶菌中的微生物組成已基本明確，但這些復(fù)雜的微生物中究竟哪些菌起益生作用，起何種益生效果尚不明確；(3)當(dāng)前紅茶菌的研究大部分采用玻璃杯、搖瓶等簡單容器進行相對粗放的培養(yǎng)，缺乏應(yīng)用發(fā)酵罐精準(zhǔn)控制的研究，對紅茶菌的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化制備參考價值相對較小；(4)由于茶多酚的氧化絡(luò)合、微生物的代謝和衰亡等原因，導(dǎo)致紅茶菌存在產(chǎn)品穩(wěn)定性較差的問題，這也是限制其產(chǎn)業(yè)化的重要因素。

隨著人們對健康品質(zhì)需求的日益增加，風(fēng)味獨特且具有多種保健功效的紅茶菌正在飛速發(fā)展，并推動著茶飲料行業(yè)的升級。今后紅茶菌的發(fā)展方向主要包括以下幾個方面：(1)系統(tǒng)探明紅茶菌發(fā)酵中微生物組成的變化規(guī)律和目標(biāo)代謝物的形成機制，通過特定菌種的組合、精準(zhǔn)的發(fā)酵調(diào)控實現(xiàn)紅茶菌的標(biāo)準(zhǔn)化制備；(2)豐富紅茶菌的產(chǎn)品形式，開發(fā)菌種存活率高、產(chǎn)品穩(wěn)定性好的粉劑或片劑；(3)明確紅茶菌的抑菌機制，促進其在天然、安全食品防腐劑或添加劑等方面的開發(fā)和應(yīng)用；(4)紅茶菌合成的細菌纖維素是一種高機械強度、持水性強、生物相容性好的高分子納米材料，加強其合成機制和性能改良的研究，拓展其在化妝品、紡織、醫(yī)學(xué)材料等方面的應(yīng)用。