粟靖 于健 史明霞

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，云南省血液病研究中心（昆明650032）；2北京生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心，北航生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院（北京100083）

B 細(xì)胞惡性腫瘤是一大類血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是一個(gè)異質(zhì)性的淋巴細(xì)胞增殖性疾病群，包括套細(xì)胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、慢性B 淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL）、華氏巨球蛋白血癥（Waldenstrom′s macroglobulinemia，WM）、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）等［1］。近年來，隨著利妥昔單抗、BTK 抑制劑等新藥的出現(xiàn)，使B 細(xì)胞惡性腫瘤的臨床治療取得長足的進(jìn)步，但由于耐藥及其導(dǎo)致的頻繁復(fù)發(fā)，這類惡性腫瘤仍然難以治愈。

腫瘤微環(huán)境對B 細(xì)胞惡性腫瘤的治療效果和臨床預(yù)后有重要影響，其與B 細(xì)胞惡性腫瘤之間的信號通訊主要是由細(xì)胞之間直接接觸、可溶性因子和外泌體介導(dǎo)［2］。近年來，有越來越多的研究表明外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間信號傳遞，并證實(shí)其在B 細(xì)胞惡性腫瘤中的重要作用［3-5］。外泌體是細(xì)胞分泌的囊性小泡，平均直徑為30 ～100 nm，內(nèi)含蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA、非編碼RNA、脂質(zhì)等生物活性分子，通常反映其來源細(xì)胞的性質(zhì)和狀態(tài)［6］。它將細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)包裹進(jìn)入自體中并向細(xì)胞外環(huán)境中釋放，從而向非惡性旁觀者細(xì)胞傳遞信息［7］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）與惡性腫瘤B 細(xì)胞分泌大量的外泌體，它們是B 細(xì)胞惡性腫瘤微環(huán)境的重要組份，有助于腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間的信號交流，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和耐藥發(fā)生［8-13］。

1 外泌體促進(jìn)B細(xì)胞惡性腫瘤的存活和增殖

近年來，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道外泌體可以攜帶并釋放DNA、mRNA、miRNA 和蛋白質(zhì)到相關(guān)細(xì)胞［6］。其中外泌體含有的miRNA 已被證明參與多種細(xì)胞的信號通路，這些通路對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要［14］。B-CLL 細(xì)胞釋放的外泌體含有與疾病相關(guān)的mRNA。它們通過將mRNA 轉(zhuǎn)移到非惡性旁觀者細(xì)胞內(nèi)對靶細(xì)胞進(jìn)行“重新編程”，從而改變受體細(xì)胞的表型來引起細(xì)胞微環(huán)境的變化，這是B-CLL 發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵因素［7］。在體外實(shí)驗(yàn)中，B-CLL 細(xì)胞分泌的外泌體被MSCs積極攝入，通過將蛋白質(zhì)和miRNA（miR-146a 和miR-451）轉(zhuǎn)移到MSCs 中上調(diào)了與MSCs 生長、存活和遷移相關(guān)的基因，從而轉(zhuǎn)變成類似于癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞表型。B-CLL 細(xì)胞分泌的外泌體能夠激活MSCs 中多種RNA 和蛋白的表達(dá)，從而激活蛋白激酶B/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（protein kinase B/extracellular signal-regulated kinase，Akt/ERK）和NF-κB 等信號途徑，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子活性的改變。這些轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)了IL-8、B 細(xì)胞激活因子（B cell activating factor，BAFF）、CXC 趨化因子配體-1（CXC chemokine ligand-1，CXCL1）、IL-6、CC 趨化因子配體-2（CC chemokine ligand-2，CCL2）、CCL5、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）等細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)了MSCs的增殖，增加了MSCs 與B-CLL 細(xì)胞之間的黏附，從而為B 細(xì)胞惡性腫瘤的生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移提供了適宜的條件［15］，這表明B-CLL 細(xì)胞來源的外泌體通過調(diào)節(jié)MSCs 的一些功能來積極促進(jìn)疾病進(jìn)展。

隨著B 細(xì)胞惡性腫瘤進(jìn)展為侵襲性表型，其來源的外泌體的分泌、組成和功能也會相繼發(fā)生改變。通過分析惰性和進(jìn)行性B-CLL患者血漿來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)這兩者之間存在差異蛋白組學(xué)特征，S100-A9 蛋白僅存在于進(jìn)展期B-CLL 患者血漿來源的外泌體中，并且該蛋白在此階段由白血病細(xì)胞特異性過表達(dá)。更重要的的是，攜帶S100-A9蛋白的外泌體能夠通過激活B-CLL 細(xì)胞中的NF-κB 途徑維護(hù)白血病細(xì)胞的存活、增殖［9］，這表明外泌體是使B-CLL 中NF-κB 信號途徑激活的新起源，并強(qiáng)調(diào)了外泌體作為細(xì)胞外介質(zhì)在促進(jìn)B-CLL 進(jìn)展中的重要性。在一項(xiàng)對MM 的研究中發(fā)現(xiàn)，MM 細(xì)胞來源的外泌體過表達(dá)CD147 可以增強(qiáng)MM 細(xì)胞的增殖，同時(shí)下調(diào)CD147 的表達(dá)后從MM 細(xì)胞來源的外泌體刺激MM 細(xì)胞的增殖能力減弱，這說明攜帶CD147 的外泌體能夠部分誘導(dǎo)MM 細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)MM 的進(jìn)展［16］。

2 外泌體介導(dǎo)B 細(xì)胞惡性腫瘤的遷移

MSCs 分泌的外泌體含有SDF-1、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon induced protein-10，IP-10）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），這有助于增強(qiáng)MM 細(xì)胞遷移。此外，MM 細(xì)胞釋放的外泌體通過激活ERK1/2 和c-Jun 氨基-末端激酶1/2/3（c-Jun N-terminal kinase1/2/3，JNK1/2/3）途徑促進(jìn)MM 細(xì)胞的遷移。用硼替佐米處理外泌體后發(fā)現(xiàn)ERK1/2 磷酸化降低，從而有助于抑制MM 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［17］。

有研究［18］證實(shí)從MM 細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基可以上調(diào)MSCs 中miR146a 的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，來源于MM 細(xì)胞的外泌體含有miR-146a，可以轉(zhuǎn)移到MSCs 中，而在MSCs 中過量表達(dá)miR-146a 可導(dǎo)致CXCL1、MCP-1 和CCL-5 等多種趨化因子的分泌增加，從而促進(jìn)MM 細(xì)胞的遷移，這表明攜帶miR-146a 的外泌體可以促進(jìn)MM 細(xì)胞遷移。此外，內(nèi)源性Notch 途徑的抑制劑DAPT 能夠消除miR-146 誘導(dǎo)的MSCs 釋放的趨化因子增加，這可能是由于Notch 途徑可與NF-κB，JAK 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）途徑相互作用，從而調(diào)節(jié)趨化因子基因的轉(zhuǎn)錄所致。

3 外泌體和B 細(xì)胞惡性腫瘤的免疫逃逸

腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要因素是免疫逃逸，外泌體被認(rèn)為是抑制腫瘤免疫監(jiān)視的重要參與者［19］。EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相關(guān)的DLBCL 細(xì)胞分泌的外泌體包含EBV 來源的非編碼RNA，當(dāng)這些外泌體進(jìn)入巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中，攜帶的非編碼RNA 可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖哒{(diào)節(jié)表型來支持腫瘤免疫逃避［4］。NKG2D 是自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）的活化型受體，在天然免疫中發(fā)揮著重要的作用。它的配體NKG2DL 在多種類型的腫瘤中都有組成性表達(dá)，包括B 細(xì)胞惡性腫瘤，這表明腫瘤逃離NKG2D/NKG2DL 介導(dǎo)的免疫監(jiān)視機(jī)制可能存在。B細(xì)胞惡性腫瘤分泌的外泌體表達(dá)和分泌應(yīng)激誘導(dǎo)的NKG2D配體MICA/B和ULBP1/2的mRNA 和蛋白質(zhì)。NKG2D 配體作為誘餌，可以下調(diào)體外NKG2D 受體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，損害NK 細(xì)胞功能，從而使表達(dá)NKG2D 配體的B 細(xì)胞惡性腫瘤逃避免疫監(jiān)視［20］。

骨髓來源的抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是未成熟的骨髓細(xì)胞，作為一種免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，活化后MDSCs 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲，并增強(qiáng)免疫抑制能力［21］。WANG 等［8］在體內(nèi)和體外研究中均發(fā)現(xiàn)MM 細(xì)胞來源的外泌體通過激活STAT3 和STAT1 通路以及增加抗凋亡蛋白Bcl-xl 和Mcl-1 的表達(dá)來促進(jìn)MDSCs 的生長。此外，MM 患者來源的外泌體還增強(qiáng)了MDSCs 釋放一氧化氮合酶的能力以及對T 細(xì)胞的抑制活性，這將進(jìn)一步促進(jìn)MM的進(jìn)展。

4 外泌體介導(dǎo)B 細(xì)胞惡性腫瘤的耐藥

外泌體在腫瘤耐藥過程中具有重要作用，其介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的方式主要是通過外泌體途徑將藥物排出細(xì)胞外、中和單克隆抗體藥物和通過復(fù)雜的miRNA 與mRNA 相互作用調(diào)控基因表達(dá)［22］。CD20 是一種跨膜磷酸蛋白，由成熟B 細(xì)胞以及大多數(shù)B-NHL 細(xì)胞表達(dá)。利妥昔單抗是第一代抗CD20 抗體，由美國食品和藥物管理局于1997年批準(zhǔn)的第一種抗癌抗體［23］。惡性淋巴瘤B細(xì)胞釋放的外泌體攜帶CD20，可以中和利妥昔單抗，保護(hù)靶細(xì)胞免受特異性抗體攻擊，從而阻礙利妥昔單抗誘導(dǎo)淋巴瘤B 細(xì)胞的凋亡［24］。

據(jù)報(bào)道，在復(fù)發(fā)/難治性MM 患者中分離出的原代MM 細(xì)胞中，miR-15a 的表達(dá)水平低于正常細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過在MM 細(xì)胞中過表達(dá)miR-15a 可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這表明miR-15a 具有腫瘤抑制特性。有趣的是，原發(fā)性MM 來源的MSCs 分泌的外泌體與MM 細(xì)胞分泌的外泌體具有相似之處，都表達(dá)較低水平的miR-15a，但致癌蛋白和生長因子的含量較高，在進(jìn)入MM 細(xì)胞后有助于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥［25］。MSCs 分泌的外泌體通過與B-CLL 細(xì)胞相互作用不僅使BCLL 細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，而且還促使B 細(xì)胞受體（B-cell receptor，BCR）途徑的基因如CCL3/4，早期生長反應(yīng)因子1/2/3（early growth response factor1/2/3，EGR1/2/3）和MYC 上調(diào)，從而保護(hù)B-CLL 細(xì)胞的自發(fā)性凋亡，并在進(jìn)入B-CLL 細(xì)胞后降低B-CLL細(xì)胞對氟達(dá)拉濱、依魯替尼、idelalisib 和venetoclax的藥物敏感性［10］。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均已證明MSCs 來源的外泌體通過激活一些生存相關(guān)的信號通路，包括JNK、p38、p53 和Akt，促進(jìn)了MM 細(xì)胞的生存、增殖、存活、遷移，并誘導(dǎo)MM 細(xì)胞對硼替佐米耐藥，這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索靶向這些外泌體的方法提供了依據(jù)。ZHANG 等［26］發(fā)現(xiàn)對硼替佐米耐藥的患者釋放的外泌體中miRNA 水平明顯下調(diào)，例如miR-16-5p，miR-15a-5p，miR-20a-5p和miR-17-5p，其中MM 細(xì)胞中miR-15a-5p 和miR-16-5p 的下調(diào)可能是通過miRNA 與mRNA 相互作用調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來促進(jìn)MM 細(xì)胞的耐藥。

5 外泌體在B 細(xì)胞惡性腫瘤診斷和治療中的潛在應(yīng)用

5.1 作為B 細(xì)胞惡性腫瘤診斷的工具B-CLL 患者的外泌體總量與晚期臨床分期呈正相關(guān)，可以用來預(yù)測總生存期（overall survival，OS）。此外，B-CLL 患者血清來源的外泌體主要表面抗原有CD19+和CD37+，可以作為B-CLL 的生物標(biāo)記［27］。Richter 綜合征（richter syndrome，RS）是指在B-CLL的基礎(chǔ)上已發(fā)展為侵襲性淋巴瘤，且預(yù)后不良［3］。通過識別攜帶miR-19b 的外泌體可以潛在的預(yù)測B-CLL 向RS 的演變，這樣就可以在經(jīng)典癥狀出現(xiàn)前診斷RS。miR-19b 起作用的機(jī)制主要是上調(diào)Ki67 和下調(diào)p53。這表明攜帶miR-19b 的外泌體可以作為B-CLL 進(jìn)展到Richter 綜合征的細(xì)胞標(biāo)志物［3］。在一項(xiàng)對WM 研究中，發(fā)現(xiàn)無癥狀和有癥狀的WM 患者來源的外泌體中具有類似水平的miRNA，這表明在癥狀出現(xiàn)之前，在疾病進(jìn)展的早期階段就已經(jīng)發(fā)生外泌體內(nèi)miRNA 的變化。此外，有小部分外泌體內(nèi)miRNA 的表達(dá)與WM 患者的疾病狀態(tài)正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，包括抑癌基因miRNA let-7d、癌基因miR-21 和癌基因miR-192［28］。IACCINO 等［29］證實(shí)MM 細(xì)胞釋放的外泌體表達(dá)腫瘤B 細(xì)胞的免疫球蛋白B 細(xì)胞受體（immunoglobulin B-cell receptor，Ig-BCR），它可以被獨(dú)特型結(jié)合肽（idiotype-binding peptides，ID-肽）靶向結(jié)合。這表明ID-肽識別MM 細(xì)胞釋放的外泌體可以作為診斷和評估MM 疾病進(jìn)展的一種方法。

5.2 作為納米載體用于B 細(xì)胞惡性腫瘤的治療外泌體在細(xì)胞通訊過程中可以保護(hù)貨物免受核酸酶和蛋白酶侵害，具有低免疫原性和細(xì)胞毒性，并且還有特異性靶向腫瘤細(xì)胞的能力，因此被視為分子信號、藥物遞送和基因水平轉(zhuǎn)移的理想載體［30］。MCL 患者的外泌體能夠被健康人和患者的B 淋巴細(xì)胞攝取，而T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞沒有明顯攝?。?1］，這表明了MCL 來源的外泌體對B 淋巴細(xì)胞具有天然特異性，可以作為治療B 細(xì)胞惡性腫瘤的理想載體。外泌體能夠有效地裝載siRNA，并有效調(diào)控靶基因，這對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。LUNAVAT 等［32］證實(shí)含有針對c-Myc 的siRNA 的外泌體不僅可以下調(diào)c-Myc 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，還可以通過激活細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)小鼠淋巴瘤細(xì)胞凋亡。

5.3 參與B 細(xì)胞惡性腫瘤的免疫治療CD40/IL-4刺激的B-CLL 細(xì)胞釋放的外泌體含有豐富的miR-363。攜帶miR-363 的外泌體可以進(jìn)入CD4+T 細(xì)胞內(nèi)，靶向免疫調(diào)節(jié)分子CD69，增強(qiáng)CD4+T 細(xì)胞的增殖、免疫突觸活性和遷移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在CD40/IL-4 刺激前通過敲除B-CLL 細(xì)胞中的miR-363，阻止了B-CLL 細(xì)胞釋放的外泌體誘導(dǎo)增加免疫突觸信號的能力，也賦予了CD4+T 細(xì)胞功能改變的特異性。這說明攜帶miR-363 的B-CLL 細(xì)胞釋放的外泌體對B-CLL 細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以用作B-CLL 細(xì)胞免疫治療的載體［33］。此外，BL細(xì)胞來源的外泌體含有參與抗原呈遞、細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附的蛋白質(zhì)，并攜帶了腫瘤表面抗原，例如CD19，CD20 和CD22［11］。這表明BL 細(xì)胞來源的外泌體可以誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性的抗腫瘤免疫，因此可能是淋巴瘤細(xì)胞相關(guān)抗原免疫治療的潛在來源。由于天然的外泌體存在復(fù)雜而多變的生物活性分子，這將影響它們對分子貨物的可接受性。一種潛在的替代方案已被開發(fā)，那就是使用可控的程序進(jìn)行組裝外泌體，從而將其用于功能蛋白的定向轉(zhuǎn) 移。GARTNER 等［34］設(shè)計(jì) 了 一種 攜 帶gp350、CD40L 和人類巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）的免疫顯性抗原（pp65）的外泌體。這種外泌體可以與B-CLL 患者的惡性B 細(xì)胞特異性相互作用，并使這些細(xì)胞對EBV 和CMV 特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞具有免疫原性。這表明CD40L+/gp350+/pp65+的外泌體具有免疫治療B細(xì)胞惡性腫瘤的潛力。

5.4 基于外泌體的B 細(xì)胞惡性腫瘤疫苗目前，腫瘤來源的外泌體普遍含有腫瘤抗原，因此將其作為疫苗的潛在用途受到廣泛關(guān)注。腫瘤來源的熱休克蛋白（heat shock protein 70，HSP70）分子是分子伴侶，已經(jīng)被用作癌癥疫苗中的佐劑，有助于刺激樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）細(xì)胞成熟和增強(qiáng)CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）免疫應(yīng)答［35］。XIE 等［36］證實(shí)表達(dá)膜結(jié)合HSP70 的MM 細(xì)胞釋放外泌體能夠通過上調(diào)共刺激分子（CD40 和CD80）和炎性細(xì)胞因子（IL-1、腫瘤壞死因子-α和IL-12）來促進(jìn)DC 的成熟，并且增強(qiáng)的CD8+CTL 細(xì)胞的抗腫瘤免疫能力。這表明表達(dá)膜結(jié)合HSP70 的腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體可能代表了一種更有效的基于外泌體的疫苗，用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。

5.5 通過減少外泌體的釋放來治療B 細(xì)胞惡性腫瘤由于B 細(xì)胞惡性腫瘤來源的外泌體可以促進(jìn)免疫逃逸，并在腫瘤微環(huán)境中直接或間接的支持腫瘤細(xì)胞，因此如何阻斷這些外泌體的分泌，或?qū)⑵鋸幕颊唧w內(nèi)清除腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可能有助于抑制腫瘤進(jìn)展。FAICT 等［37］發(fā)現(xiàn)MM 細(xì)胞來源的外泌體不僅在體內(nèi)增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的活性，還在體外阻斷了成骨細(xì)胞的分化和功能。鞘磷脂酶抑制劑GW4869 在體內(nèi)阻斷外泌體的分泌不僅可以減少骨溶解，而且與硼替佐米聯(lián)合使用還具有顯著的抗腫瘤作用，這說明抑制外泌體的分泌可能是MM 新的治療靶點(diǎn)。

6 結(jié)語

目前研究主要集中于外泌體在B-CLL 和MM疾病中的潛在應(yīng)用，對于外泌體在其他B 細(xì)胞惡性腫瘤的研究仍然甚少，且外泌體內(nèi)生物活性成分以及發(fā)揮作用的機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。由于外泌體的生理性質(zhì)和功能，可把它作為分子信號、藥物遞送和基因水平轉(zhuǎn)移治療B 細(xì)胞惡性腫瘤的理想非細(xì)胞載體。在優(yōu)化B 細(xì)胞惡性腫瘤療效的同時(shí)，可以減少其非靶向遞送。因此，進(jìn)一步廣泛開展研究評估基于外泌體的免疫治療或基因修飾后外泌體的長期安全性和有效性，利用基因修飾后的外泌體特異性地傳遞抗B 細(xì)胞惡性腫瘤信號殺傷腫瘤細(xì)胞，將可能進(jìn)一步改善抗B 細(xì)胞惡性腫瘤的治療效果，但將這些策略轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，例如外泌體的安全性、復(fù)雜多變性、穩(wěn)定性、精確靶向性等。通過對外泌體這一領(lǐng)域進(jìn)一步研究，無疑將對B 細(xì)胞惡性腫瘤與其腫瘤微環(huán)境之間的相互作用產(chǎn)生更多深入的了解，這將為治療B 細(xì)胞惡性腫瘤提供了潛在的理論基礎(chǔ)。