劉若冰，郝怡環(huán)，楊 茜，焦文雅，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）又名乙基環(huán)丙沙星，是目前使用較為廣泛的一種氟喹諾酮類抗生素藥物。多用于治療動物感染性疾病，不管是對革蘭氏陰性菌，還是革蘭氏陽性菌都有較好的殺滅作用[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧領(lǐng)域也有較為廣泛的應(yīng)用，常用于治療小豬仔白、黃痢和魚類弧菌癥等疾病[2]。同樣能夠抑制如梭狀桿菌、短小芽孢桿菌、消化鏈球菌等致病菌的繁殖[3-4]。但隨著這種藥物的過量使用，動物源性食品中ENR殘留問題常有發(fā)生[5]，當(dāng)在人體內(nèi)蓄積到一定濃度時就會產(chǎn)生毒性作用[6]，可能還會導(dǎo)致人體過敏反應(yīng)或產(chǎn)生其他比如過敏性哮喘[7]、頭痛[8]、惡心、嘔吐等人體不適的副作用[9]。因此，亟需建立一種快速、靈敏的食品中ENR的檢測方法。

目前用于檢測ENR的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、免疫分析法[12]、毛細(xì)管電泳法[13]以及微生物法[14]等。這些方法雖具有較高的檢測靈敏度，但由于受到樣品前處理過程繁瑣、操作復(fù)雜、設(shè)備要求高等限制，使其不能廣泛地用于食品的快速檢測。核酸適配體是通過體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出的能夠與無機或有機分子、蛋白等目標(biāo)物發(fā)生高親和性和特異性結(jié)合的一類單鏈核苷酸（DNA或RNA）[15]。它的獲取不依賴于生物體或細(xì)胞[16]，是獸藥殘留檢測領(lǐng)域的一個主要研究方向[17-19]。針對ENR的適配體檢測方法目前已有很多，趙秋伶等[20]研制了ENR酶聯(lián)適配體分析檢測試劑盒；趙銀麗等[21]建立了膠體金核酸適配體比色法；Dolati等[22]利用氧化石墨烯通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移機制對附近熒光物質(zhì)的熒光猝滅建立了一種基于核酸適配體的ENR熒光檢測方法。這些方法快速、簡單、靈敏，已經(jīng)被廣泛用于開發(fā)便攜和現(xiàn)場使用的快速檢測。

AccuBlue是一種極為靈敏的熒光核酸染料[23]，常用于雙鏈DNA（dsDNA）的定量檢測。AccuBlue在游離狀態(tài)，或與單鏈DNA（ssDNA）共存時只發(fā)出微弱的熒光，與dsDNA共存時會與之發(fā)生結(jié)合使得熒光信號顯著增強。Duan Nuo等[24]基于AccuBlue的識別特性進(jìn)行了副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測，但目前并沒有適用于小分子物質(zhì)檢測的報道。

本研究基于AccuBlue對痕量dsDNA的超敏感性和ENR核酸適配體建立檢測ENR的非標(biāo)記型熒光分析方法，并用于實際樣品的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶、蝦肉、牛肉 市購；E N R、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、依諾沙星（enoxacin，ENX） 上海源葉科技有限公司； 牛血清蛋白（bovine serum protein，BSA） 美國Sigma公司；AccuBlue染料 美國Biotium公司；酶標(biāo)抗原、ENR抗體（0.996 mg/mL）均為實驗室制備。

參照文獻(xiàn)[25]合成ENR的核酸適配體及其互補鏈Complementary DNA（表1）。

表1 寡核苷酸名稱與序列Table 1 Oligonucleotides used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

LUX多功能酶標(biāo)儀、1500-823多功能酶標(biāo)儀 美國 Thermo Scientific公司；F-750分光光度計 日本日立公司；1260液相色譜儀 安捷倫科技有限公司； SKP-02.300電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特有限公司；TGL-40B臺式低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原理

AccuBlue是一種定量檢測dsDNA的染料，靈敏度較高，當(dāng)它與dsDNA結(jié)合后，熒光強度會在短時間內(nèi)達(dá)到峰值，熒光強度會增強1 000 倍以上，并且不與ssDNA結(jié)合。向含有核酸適配體的緩沖液體系中加入ENR，核酸適配體就會與之結(jié)合，能結(jié)合ENR的適配體空間結(jié)構(gòu)就會改變，使之不能再與其互補鏈堿基互補配對。不能與ENR特異性結(jié)合的核酸適配體與反應(yīng)體系中核酸適配體互補鏈雜交生成dsDNA。AccuBlue不結(jié)合單鏈核苷酸，僅識別dsDNA的螺旋溝結(jié)構(gòu)，從而釋放熒光信號。結(jié)合原理如圖1所示，向相同濃度的核酸適配體體系中添加不同濃度的ENR，反應(yīng)體系中的熒光強度不同，因此，可以借助熒光信號強度的變化確定樣品中ENR濃度，從而實現(xiàn)快速定量檢測ENR的目的[26]。

圖1 AccuBlue熒光法反應(yīng)原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram showing the principle of AccuBlue fluorescence reaction

1.3.2 AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA的檢測

分別取10 μL 10 nmol/LENR 核酸適配體與Complementary DNA溶液，95 ℃加熱5 min，冰浴10 min，恢復(fù)至室溫。然后加入到96 孔黑色酶標(biāo)板中混勻，25 ℃反應(yīng)10 min。再加入200 μL AccuBlue熒光染料避光反應(yīng)5 min，利用多功能酶標(biāo)儀的熒光功能檢測熒光強度（參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長為468 nm，發(fā)射 波長為507 nm）。

1.3.3 雙鏈孵育時間及AccuBlue識別時間的優(yōu)化

將ENR核酸適配體與Complementary DNA溶液經(jīng)預(yù)變性后加入反應(yīng)體系，在25 ℃培養(yǎng)箱中分別反應(yīng)5、10、15、20、25、30 min，再分別加入200 μL AccuBlue熒光染料，固定孵育時間后通過多功能酶標(biāo)儀連續(xù)20 min檢測熒光強度。

1.3.4 ENR定量檢測

將0、20、50、100、500、1 000 μg/L和2 000 μg/L系列質(zhì)量濃度的ENR溶液與ENR核酸適配體溶液在孔內(nèi)混勻，25 ℃孵育10 min，再加入Complementary DNA溶液和AccuBlue，重復(fù)3 次檢測熒光強度。ENR藥物質(zhì)量濃度為0時體系中熒光強度用F0表示。以ENR藥物質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以F/F0為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 特異性實驗

按照1.3.2節(jié)方法分別測定終質(zhì)量濃度為1 000 μg/L ENR、OFL、CIP、ENX溶液體系的熒光強度，重復(fù)3 次，結(jié)果與空白對比。

1.3.6 實際樣品的檢測

稱取5.0 g脫脂奶粉溶于 10 mL的1×PBS，經(jīng)14 000 r/min離心20 min，保留上清液用Tris緩沖液進(jìn)行10 倍的稀釋。選取蝦肉和牛肉可食用部分剁碎混勻，準(zhǔn)確稱取5.0 g肉樣，加入無水硫酸鈉5.0 g研磨均勻后加入提取溶劑（4 mL乙腈、0.04 mL乙酸）于3 000 r/min離心12 min，保留上清液；將殘渣重復(fù)上述操作1 次，合并上清液后氮氣吹干，再用Tris緩沖液溶稀釋20 倍[27]。然后向樣品中添加終質(zhì)量濃度為200、500、1 000 μg/L的ENR標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)優(yōu)化好的方法重復(fù)3 次測定熒光強度值，計算添加回收率。

1.3.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及HPLC驗證

基于抗體的ELISA方法樣品前處理為將15 g奶粉溶解于15 mL磷酸鹽緩沖溶液（1×PBS），加入5 mL三氯乙酸，5 000 r/min離心15 min，保留上清液，調(diào)節(jié)pH值為中性。準(zhǔn)確稱取蝦肉與牛肉均質(zhì)樣本1.0 g，加入5 mL 1%氨水的乙腈溶液及2.5 mL正己烷，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min，棄去上層有機相，將提取液氮氣吹干，緩沖液復(fù)溶。ENR加標(biāo)量分別設(shè)定為200、500、1 000 μg/kg 3 個水平，重復(fù)3 次測定樣品中ENR含量，計算回收率。

HPLC在參考文獻(xiàn)[28-30]中ENR測定方法的基礎(chǔ)上稍作修改，建立了奶粉、蝦肉、牛肉中ENR檢測的HPLC法。樣品處理方法為準(zhǔn)確稱取10 g奶粉溶于10 mL磷酸鹽緩沖溶液，加入35 mL乙腈，超聲提取30 min后加入200 g/L乙酸鋅2.0 mL，乙腈定容至50 mL，10 000 r/min離心5 min，收集上清液經(jīng)0.22 μmol/L有機濾膜過濾；準(zhǔn)確稱取蝦肉與牛肉均值樣本2.00 g，分別加入12 g無水硫酸鈉和12 mL酸化乙腈，超聲提取15 min，4 500 r/min離心15 min，收集上清液移至分液漏斗中，加入25 mL正己烷，振蕩5 min。充分靜置后，將下層液體55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用1 mL流動相充分溶解殘渣，4 500 r/min離心5 min，保留上層溶液，經(jīng)0.45 μm膜微孔過濾。待測樣品經(jīng)HPLC儀重復(fù)3 次進(jìn)行測定。HPLC分析條件為：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流動相：0.05 mol/L的磷酸三乙胺-乙腈（pH 3）（82∶18，V/V）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm[31]。ENR的加標(biāo)量分別設(shè)定為200、500、1 000 μg/kg 3 個水平。

將ELISA方法和HPLC方法測定結(jié)果與熒光法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，分析相關(guān)性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

使用Excel 2010及Origin 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA的檢測

建立基于AccuBlue熒光染料和核酸適配體方法檢測ENR的前提是確定AccuBlue與緩沖液、適配體和互補鏈之間形成的雙鏈核苷酸反應(yīng)后是否釋放熒光，該熒光信號是否可以被儀器識別。AccuBlue對ENR核酸適配體形成的dsDNA檢測結(jié)果如圖2所示，緩沖液本身不具有熒光信號且ENR核酸適配體與Complementary DNA的雜交產(chǎn)物dsDNA結(jié)合AccuBlue釋放的熒光信號遠(yuǎn)大于AccuBlue熒光染料本身，且由此可以證明，利用AccuBlue熒光檢測ENR方法可行。

圖2 ENR核酸適配體形成的dsDNA與AccuBlue結(jié)合后的 熒光檢測（n=3）Fig. 2 Fluorescence intensity of AccuBlue in the presence and absence of ENR aptamer hybridizer (n = 3)

2.2 雙鏈孵育時間及AccuBlue識別雙鏈時間的優(yōu)化

熒光染料AccuBlue通過識別核酸適配體與其互補鏈之間的堿基配對位點，在初始階段隨著反應(yīng)時間的推移，釋放出的熒光信號不斷增強，直到反應(yīng)體系中AccuBlue與dsDNA不再結(jié)合為止。雙鏈孵育時間優(yōu)化結(jié)果如圖3所示，ENR核酸適配體與其互補鏈反應(yīng)10 min時，體系中相對熒光強度達(dá)到最大值，且處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此確定ENR適配體與其互補鏈、ENR藥物的孵育時間為10 min。

圖3 ENR核酸適配體與其互補鏈孵育時間優(yōu)化（n= 3）Fig. 3 Optimization of incubation time of ENR aptamer and its complementary chain (n = 3)

當(dāng)加入體系中的AccuBlue和ENR核酸適配體濃度一定時，需要確定在當(dāng)前濃度條件下熒光強度達(dá)到峰值的時間。熒光染料識別雙鏈的時間優(yōu)化如圖4所示。相對熒光強度在第6分鐘時達(dá)到最高點且處于穩(wěn)定狀態(tài)。AccuBlue熒光染料的濃度一定時，相對熒光強度隨dsDNA的增多而增強，達(dá)到峰值之后又有輕微的猝滅。因此，選擇6 min作為AccuBlue與樣品的最優(yōu)反應(yīng)時間。

圖4 熒光染料識別雙鏈的時間優(yōu)化（n=3）Fig. 4 Optimization of reaction time between AccuBlue and dsDNA (n = 3)

2.3 ENR定量檢測結(jié)果

根據(jù)上述確定的最佳反應(yīng)條件，建立AccuBlue熒光法檢測不同質(zhì)量濃度ENR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)ENR核酸適配體的量一定時，ENR質(zhì)量濃度越大，體系中能與互補鏈結(jié)合的核酸適配體越少，形成的dsDNA越少，AccuBlue識別dsDNA產(chǎn)生的熒光強度F值越小。溶液中沒有ENR藥物存在時，核酸適配體完全與其對應(yīng)的互補鏈結(jié)合，此時熒光強度F0最大。因此，以F/F0為縱坐標(biāo)，以ENR質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝-0.186 8x＋1.186，R2＝0.945 7。ENR在20～1 000 μg/L的質(zhì)量濃度梯度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，檢出限為9.96 μg/L，定量限為29.97 μg/kg。此外，由表2可知，該方法的平均板內(nèi)變異系數(shù)為6.63%，平均板間變異系數(shù)為8.05%。目前應(yīng)用于ENR的熒光檢測方法還有很多。對比文獻(xiàn)報道的其他熒光分析方法 （表3）可以看出，本實驗建立的AccuBlue熒光法線性范圍較寬、檢測限低，且AccuBlue免標(biāo)記，操作簡便，整個實驗過程不超過1.5 h。

表2 板內(nèi)與板間變異實驗（n=6）Table 2 Inter-plate and intra-plate coefficients of variation (n = 6)%

表3 ENR不同熒光檢測方法結(jié)果比較Table 3 Comparison of different fluorescence methods for enrofloxacin detection

2.4 特異性實驗結(jié)果

圖5 AccuBlue與ENR核酸適配體檢測ENR的特異性分析（n=3）Fig. 5 Specificity evaluation of AccuBlue and ENR aptamer for the detection of ENR (n = 3)

為了考察ENR的核酸適配體與其他結(jié)構(gòu)類似物是否發(fā)生交叉反應(yīng)，同時對ENR、CIP、OFL、ENX進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)向反應(yīng)體系中加入相同質(zhì)量濃度（1 000 μg/L）的抗生素藥物時，AccuBlue檢測ENR的反應(yīng)體系所釋放的熒光強度小于其他3 種。這說明反應(yīng)體系內(nèi)中有ENR存在時，ENR核酸適配體與ENR發(fā)生了特異性結(jié)合，只能激發(fā)產(chǎn)生少量熒光。而其他抗生素反應(yīng)體系中，ENR核酸適配體幾乎與互補鏈完全結(jié)合，與AccuBlue結(jié)合激發(fā)產(chǎn)生更多的熒光。由此可知，ENR核酸適配體可特異性識別并結(jié)合ENR，與CIP、OFL、ENX基本上不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5 實際樣品的檢測結(jié)果

本實驗選取奶粉、蝦肉和牛肉3 種樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。按照1.3.6節(jié)的方法處理樣品，每種樣品添加3 個不同水平的ENR標(biāo)準(zhǔn)品，用熒光法進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品回收率。由表4可知，3 種樣品的加標(biāo)回收率范圍為76.54%～98.79%。結(jié)果表明，該檢測方法準(zhǔn)確可靠，可用于實際動物性樣品中ENR含量的快速檢測。

表4 熒光法測定樣品的加標(biāo)回收結(jié)果（n=3）Table 4 Recoveries of spiked samples by the fulorescence method (n = 3)

2.6 熒光法與ELISA及HPLC測定結(jié)果的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步驗證AccuBlue熒光法的準(zhǔn)確性，使用ELISA和HPLC方法檢測加入ENR標(biāo)準(zhǔn)的相同樣品（奶粉、蝦肉和牛肉）。ENR標(biāo)準(zhǔn)品及3 種動物食品加標(biāo)樣品的HPLC見圖6。3 種方法的線性回歸分析結(jié)果如圖7所示，采用熒光法測定加標(biāo)樣品回收率與其他兩種方法都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2＞0.96；R2＞0.98），證實了本實驗建立的熒光法檢測ENR殘留方法準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于實際樣品的快速檢測。

圖6 ENR標(biāo)準(zhǔn)品（a）及奶粉（b）、蝦肉（c）、牛肉（d） 樣品HPLC圖Fig. 6 HPLC chromatograms of ENR standard (a), milk powder (b), shrimp (c), and beef (d) samples

圖7 熒光法和ELISA（a）及HPLC（b）測定結(jié)果的線性回歸分析Fig. 7 Linear regression analysis of fluorescence method versus ELISA (a), and fluorescence method versus HPLC (b)

3 結(jié) 論

利用核酸適配體及AccuBlue熒光染料的特點，建立一種基于核酸適配體快速檢測ENR的方法，并對熒光法反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，本研究建立的AccuBlue適配體方法在pH 8.5的緩沖溶液中，熒光染料識別雙鏈的時間為6 min，雙鏈孵育時間為10 min的最優(yōu)反應(yīng)條件下，ENR在20～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為9.96 μg/L，定量限為29.97 μg/kg。且與OFL、CIP、ENX無交叉反應(yīng)，板內(nèi)變異系數(shù)范圍為4.97%～9.31%，板間變異系數(shù)范圍為5.83%～10.96%。在3 個不同水平，樣品回收率在76.54%～98.79%之間。通過ELISA方法與HPLC方法進(jìn)行驗證，R2均大于0.96。由此表明，該檢測特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。本研究建立的AccuBlue熒光法所需設(shè)備簡單、成本低、效率高，為食品中ENR的快速和高靈敏檢測提供了新的方案。