李麗芳，黃文勝，張九凱，王彥波，傅玲琳，韓曉祥，陳 穎,

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

大豆（Glycine max[L.] Merr.）是世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的八大食物過(guò)敏原之一[1]。大豆過(guò)敏原易在嬰幼兒和幼齡動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)IgE抗體介導(dǎo)的速發(fā)型（I型）超敏反應(yīng)。目前尚無(wú)治愈食物過(guò)敏的有效療法，避免大豆及其制品的直接攝入是大豆過(guò)敏者預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)的唯一方式。但由于大豆蛋白在食品工業(yè)（預(yù)制和加工食品）中應(yīng)用廣泛，很難將其從日常飲食中完全去除[2]。為保護(hù)大豆過(guò)敏消費(fèi)者，歐盟、日本、美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國(guó)家的食品標(biāo)簽法規(guī)要求，任何含有大豆及其制品的食品，無(wú)論含量高低都須在包裝上明確標(biāo)識(shí)[3]。 我國(guó)GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》中也建議在食品包裝上標(biāo)識(shí)相關(guān)致敏物質(zhì)。盡管各國(guó)標(biāo)簽法規(guī)相繼頒布，但因交叉污染或違規(guī)而導(dǎo)致食物過(guò)敏原未按照規(guī)定進(jìn)行標(biāo)識(shí)的情況仍經(jīng)常發(fā)生[4]。因此，為督促食品生產(chǎn)者自覺(jué)遵守過(guò)敏原標(biāo)識(shí)相關(guān)法規(guī)，幫助消費(fèi)者判斷標(biāo)簽標(biāo)識(shí)的真實(shí)性，研發(fā)高靈敏度、快速準(zhǔn)確的食物過(guò)敏原檢測(cè)方法至關(guān)重要。

目前，用于檢測(cè)大豆過(guò)敏原蛋白的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）[5-7]和高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)等[8-9]?；诳贵w的ELISA法應(yīng)用最早也最為廣泛，但食品加工中常用的高壓和熱處理等加工方式易引起蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性[5-7]。近年來(lái)，HPLC-MS法因其良好的特異性和靈敏度，在大豆過(guò)敏原檢測(cè)中的應(yīng)用逐漸增多。迄今為止，世界過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.allergenonline.org/）中共收錄了43 種大豆過(guò)敏原。其中，大豆球蛋白（包括G1、G2、G3、G4和G5亞基）和β-伴大豆球蛋白（包括α’、α和β亞基）、Gly m Bd 30K（P34蛋白）、Gly m Bd 28K（P28蛋白）以及Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（kunitz trypsin inhibitor，KTI）5 類是主要的大豆過(guò)敏原蛋白，組成大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的各亞基均已被證明具有獨(dú)立的免疫原性[10-12]。不同的大豆品種中過(guò)敏原蛋白的組成和含量存在差異，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不少有關(guān)P34等過(guò)敏原蛋白缺失[13]以及α’、α、β等亞基缺失[14-15]的大豆種質(zhì)資源。但現(xiàn)有的基于HPLC-MS技術(shù)的檢測(cè)方法通常僅以單一的大豆過(guò)敏原蛋白[16]/亞基[17-18]或某幾種大豆過(guò)敏原[11,19]為檢測(cè)目標(biāo)，未涵蓋大豆中5 大類主要的過(guò)敏原蛋白及其亞基。

本研究利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）聯(lián)用技術(shù)，針對(duì)大豆5 大類主要過(guò)敏原蛋白的11 種過(guò)敏原，篩選出特征標(biāo)識(shí)肽段，建立多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式質(zhì)譜檢測(cè)方法，以期為食物過(guò)敏原檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)各類型大豆樣品24 份（表1），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國(guó)家大豆種質(zhì)資源庫(kù)提供。

尿素、冰乙酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、碳酸氫銨（ammonium bicarbonate，ABC）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、乙腈（HPLC級(jí)）、甲酸（HPLC級(jí)）、10 kDa離心濃縮裝置 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶蛋白酶（MS級(jí)） 美國(guó)Thermo Fisher-Pierce 公司；低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Marker 美國(guó)Bio-Rad公司；考馬斯亮藍(lán)R250 北京克爾慧公司；超純水由Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)制備；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD XR液相色譜儀 日本Shimadzu公司； Q-TOF?6600質(zhì)譜、Q-TRAP?5500質(zhì)譜 美國(guó)AB Sciex 公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（4.6 mm× 150 mm，3.5 μm，300 ?） 美國(guó)Waters公司； TissueLyser II型組織研磨儀 德國(guó)Qiagebn公司；ME403E型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Centrifuge 5418R型離心機(jī)、Concentrator plus型真空濃 縮儀 德國(guó)Eppendorf公司；Multiskan GO型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；Vortex-Genie 2型振蕩器 美國(guó)Scientific Industries公司；PowerPac Basic型凝膠電泳儀、ChemiDoc型凝膠掃描儀 美國(guó)Bio-Rad公司；HNDSY800型水浴搖床 德國(guó)Wiggens公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

所有大豆樣品均在液氮作用下研磨成粉末，過(guò)80 目篩，4 ℃保存。確稱取1 g大豆粉末并置于50 mL離心管中，以料液比1∶10（g/mL）加入超純水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至10.0，50 ℃振蕩1 h；4 ℃、4 500 r/min離心20 min后取上清液；將沉淀重懸于10 倍體積的提取緩沖液中，重復(fù)上述步驟；將2 次提取的上清液合并，過(guò)400 目濾布即得大豆全蛋白提取液；分裝后保存于-80 ℃待用。

1.3.2 提取液蛋白含量的測(cè)定

采用Bradford法[20]測(cè)定大豆總蛋白的含量。用0.15 mol/L NaCl溶液配制質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。將樣品大豆蛋白原液稀釋30 倍。分別吸取各系列質(zhì)量濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液與各樣品稀釋液30 μL，加入1 mL考馬斯亮藍(lán)染料，輕搖混勻，室溫靜置2～3 min。使用酶標(biāo)儀于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和樣品稀釋液的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品總蛋白含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。提取液中的蛋白質(zhì)提取率按照下式計(jì)算[21]：

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

SDS-PAGE分析參照Laemmli[22]的方法：根據(jù)Bio-Rad推薦配方分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白樣品稀釋至1 μg/μL并與上樣緩沖液1∶1混勻，95 ℃水浴10 min，上樣量為15 μL，加樣完畢后接通電源，開(kāi)始時(shí)濃縮膠電泳電壓為80 V，到達(dá)分離膠后調(diào)節(jié)電壓為120 V，待溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底部5 mm時(shí)結(jié)束電泳，取出凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色約2 h，染色結(jié)束后倒去染色液，以適量體積的超純水清洗凝膠以去除殘留染料，再用脫色液（甲醇-冰乙酸-水（4∶1∶5，V/V））脫色至背景無(wú)色，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，利用Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3.4 胰蛋白酶消化

參考Wisniewski等[23]的過(guò)濾輔助樣品制備（filtration auxiliary sample preparation，F(xiàn)ASP）法進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解。取約200 μg的大豆總蛋白提取物于10 kDa截留超濾管中，加入100 μL 10 mmol/L DTT溶液（8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5），37 ℃孵育1 h；加入10 μL 50 mmol/L IAA（8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5）于室溫避光放置15 min，將蛋白烷基化；在室溫下以12 000 r/min離心10 min，用100 μL Buffer1（8 mol/L尿素，0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）洗滌樣品；加入100 μL 50 mmol/L ABC溶液，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，至超濾管上沒(méi)有殘留液體。在超濾管中加入100 μL 50 mmol/L ABC溶液，再以1∶50質(zhì)量比加入4 μL胰蛋白酶（1 μg/μL，溶于50 mmol/L乙酸溶液中），渦旋混勻，37 ℃過(guò)夜酶切。酶解液12 000 r/min離心10 min，然后用100 μL 25 mmol/L ABC溶液洗滌3 次，使小分子肽段進(jìn)入濾液中。將濾液旋轉(zhuǎn)干燥，加入質(zhì)譜水除鹽，重復(fù)旋轉(zhuǎn)蒸干3 次，最后加入100 μL流動(dòng)相A（0.1%甲酸-2%乙腈-98%水）溶液復(fù)溶。

1.3.5 UPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流動(dòng)相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫程序：0～0.1 min，98% A、2% B；0.1～0.5 min，98%～92% A、2%～8% B；0.5～25 min，92%～78% A、8%～22% B；25～31 min，7 8%～6 5% A、2 2%～3 5% B；3 1 ～3 3 m i n，65%～20% A、35%～80% B；33～39 min，20% A、80% B；39～39.5 min，20%～98% A、80%～2% B；39.5～44 min，98% A、2% B。

AB SCIEX TripleTOF?6600質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）正離子掃描模式；離子化電壓5 000 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；質(zhì)譜掃描模式：信息依賴型采集工作模式（information dependent acquisition，IDA）；TOF MS模式m/z 350～1 500，500 ms；IDA TOF MS/MS模式m/z 350～1 500， 40 MS/MS，100 ms，IDA閾值100 cps，母離子電荷選擇范圍為＋2～＋5；滾動(dòng)碰撞能量enabled；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間12 s；運(yùn)行時(shí)間44 min。

1.3.6 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流動(dòng)相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。梯度洗脫程序：0～0.1 min，97% A、3% B；0.1～10 min，97%～70% A、3%～30% B；10～13 min，7 0%～4 5% A、3 0%～5 5% B；1 3 ～1 3.1 m i n，45%～20% A、55%～80% B；13.1～16 min，20% A、80% B；16.1～20 min，20%～97% A、80%～3% B；20～20.1 min，97% A、3% B。

AB QTRAP?5500質(zhì)譜條件：ESI正離子掃描參數(shù)：氣簾氣壓力35 psi，碰撞氣：Medium，離子化電壓4 500 V，離子源溫度500 ℃，霧化氣壓力65 psi，輔助氣壓力50 psi；正離子掃描Scheduled MRM模式：MRM檢測(cè)窗口120 s；掃描時(shí)間3 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用高分辨質(zhì)譜和計(jì)算機(jī)對(duì)胰蛋白酶酶解肽的質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間（retention time，RT）和響應(yīng)強(qiáng)度等原始數(shù)據(jù)進(jìn)行IDA，生成wiff文件。從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（UniprotKB，http://www.uniprot.org）中檢索并下載大豆蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)并導(dǎo)入AB SCIEX公司的ProteinPilot v.5.0軟件，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫(kù)處理。ProteinPilot v.5.0軟件參數(shù)設(shè)定如下：樣品類型：鑒定；Cys烷基化：IAA；消化：胰蛋白酶；搜索工作：完整蛋白信息（identity document，ID）；ID焦點(diǎn)：生物學(xué)修飾；檢測(cè)到的蛋白質(zhì)閾值（Unused ProtScore（Conf））：＞0.05（10.0%）；運(yùn)行錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

樣品蛋白的高效提取是質(zhì)譜鑒定分析的前提，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆蛋白提取緩沖液的組成與pH值、提取料液比及提取溫度和時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。由于大豆蛋白在堿性溶液中具有良好的溶解性[19]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比3 種提取緩沖液（緩沖液a：H2O；緩沖液b：0.03 mol/L Tris-HCl；緩沖液c：0.1 mol/L ABC）在堿性條件下（pH 9.0和pH 10.0）對(duì)大豆中可溶性蛋白總回收率的影響。結(jié)果顯示，緩沖液a在pH 9.0和pH 10.0時(shí)獲得的大豆蛋白提取率均高于緩沖液b和緩沖液c（圖1A）；并采用HPLC-MS/MS 方法檢測(cè)不同緩沖液在pH 10.0條件下提取的大豆蛋白酶解肽中目標(biāo)致敏原特征肽段的得率，經(jīng)比較分析，當(dāng)使用堿性水溶液作為提取溶劑（緩沖液a）時(shí)，各過(guò)敏原特征肽段的響應(yīng)強(qiáng)度可達(dá)到最高值（圖1B），故本研究最終選擇以1 mol/L NaOH溶液作為堿化介質(zhì)調(diào)節(jié)的水溶液作為大豆蛋白的提取緩沖液。在此基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)提取緩沖液的pH值（pH 8.0～12.0），發(fā)現(xiàn)pH值為10.0時(shí)大豆蛋白提取率最高（圖1C）。通過(guò)評(píng)估不同料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20（g/mL））下的提取效率，發(fā)現(xiàn)料液比為1∶10時(shí)大豆蛋白提取效果最佳（圖1D）。為增加大豆蛋白的溶解度，需輔助進(jìn)行加熱和振蕩處理，進(jìn)一步考察提取溫度（25～60 ℃）和振蕩提取時(shí)間（15～120 min）對(duì)其提取效率的影響。結(jié)果表明，在50 ℃和60 min的提取條件下獲得了大豆蛋白的最佳提取率（圖1E和圖1F）。在優(yōu)化的提取條件下完成了所有大豆樣品的蛋白提取，利用Bradford法測(cè)得24 個(gè)品種中大豆蛋白含量在252.89～329.85 mg/g之間。

圖1 提取條件對(duì)大豆蛋白提取效果的影響Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction efficiency of soybean protein

2.2 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE技術(shù)分析24 個(gè)大豆樣品的蛋白組成，通過(guò)與已知的各過(guò)敏原相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，可準(zhǔn)確定位大豆球蛋白的酸性多肽鏈A（34～44 kDa）和堿性多肽鏈B（18～20 kDa）、β-伴大豆球蛋白的α’（72 kDa）、α（68 kDa）和β（52 kDa）亞基、P34（30～34 kDa）、P28（28 kDa）及KTI（24 kDa）相應(yīng)的條帶位置。由圖2可知，利用本實(shí)驗(yàn)方法提取的大豆總蛋白包括了上述主要大豆過(guò)敏原，各過(guò)敏原條帶清晰可見(jiàn)，未發(fā)生降解，且不同品種間大豆蛋白質(zhì)的亞基組成及含量存在差異。

圖2 大豆蛋白粗提物的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE profiles of crude soy protein extracts from different cultivars

2.3 大豆蛋白胰蛋白酶肽的UPLC-Q-TOF-MS分析

按1.3.5節(jié)色譜及質(zhì)譜條件，利用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)24 份大豆樣品的全蛋白胰蛋白酶消化產(chǎn)物進(jìn)行分析，得到其在全掃描模式下具有代表性的總離子流色譜圖。以綏農(nóng)1號(hào)大豆種質(zhì)為例，大豆蛋白酶解產(chǎn)物的分離情況較好，其色譜圖譜峰尖銳，響應(yīng)強(qiáng)度較高，峰形對(duì)稱且重復(fù)性好，數(shù)據(jù)采集情況良好（圖3）。

圖3 大豆蛋白酶解產(chǎn)物在全掃描模式下的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion current chromatograms of tryptic digestion products from soybean protein extracts

2.4 特征肽段的篩選

在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并下載大豆蛋白的氨基酸序列，使用ProteinPilot軟件結(jié)合Paragon算法針對(duì)大豆蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS分析得到的MS2譜進(jìn)行搜庫(kù)處理，以生成蛋白質(zhì)、肽序列、豐度和修飾信息的列表，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和多肽的鑒定。在95%置信度下，針對(duì)性地鑒定出11 種大豆主要過(guò)敏原，即大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基，β-伴大豆球蛋白的α′、α和β亞基，P34、P28及KTI。為確定質(zhì)譜檢測(cè)的標(biāo)志物，對(duì)經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果比對(duì)后得到的一系列肽段進(jìn)行篩選。篩選原則如下：長(zhǎng)度在7～21 個(gè)氨基酸之間；m/z＜1 250；不含任何修飾氨基酸（半胱氨酸（C）與蛋氨酸（M））；不含內(nèi)部胰蛋白酶切割位點(diǎn)；在酶切位點(diǎn)處沒(méi)有連續(xù)的精氨酸（R）或賴氨酸（K）殘基[24-28]。根據(jù)上述原則，每個(gè)目標(biāo)過(guò)敏原篩選得到1～4 條預(yù)選特征肽段，共計(jì)29 條（表2），其中11 條為本研究首次發(fā)現(xiàn)。將所選擇的預(yù)選特征肽段利用BLAST分析工具進(jìn)行UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，以檢查物種間同源性，確保這些肽段對(duì)于其所屬的大豆過(guò)敏原具有特異性。比對(duì)結(jié)果表明，所選特征肽段僅存在于其所屬大豆過(guò)敏原中，均可作為大豆過(guò)敏原定性定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的候選靶肽。

表2 大豆中11 種主要過(guò)敏原的特征肽段信息及其MRM參數(shù)Table 2 Information about signature peptides and MRM parameters for 11 major allergens in soybean

2.5 大豆主要過(guò)敏原特征肽段的三重四極桿質(zhì)譜驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)利用Skyline軟件對(duì)所選特征肽段進(jìn)行模擬酶解，獲得各肽段適用于質(zhì)譜分析的理論傳輸離子對(duì)（母離子Q1和子離子Q3）、RT、碰撞能量（collision energy，CE）以及去簇電壓（declustering potential，DP）等MRM參數(shù)信息，并通過(guò)三重四極桿質(zhì)譜MRM模式對(duì)所選特征肽段進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后，帶電荷的肽段碎裂成許多小片段，產(chǎn)生y離子和b離子（肽段主鏈片段離子在N和C端保持正電荷），導(dǎo)致每個(gè)肽段出現(xiàn)多個(gè)峰。之前研究表明，每個(gè)特征肽段應(yīng)至少選擇3 個(gè)子離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中響應(yīng)值最高的離子可作為定量離子，其余兩個(gè)離子輔助定性分析[29-30]。以β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR為例，在m/z526.272＋處觀察到該肽的雙質(zhì)子化離子信號(hào)強(qiáng)度最高，該離子的MS2分析結(jié)果如圖4所示。m/z580.28＋（y5）、m/z693.37＋（y6）和m/z840.44＋（y7）處的片段碎裂效果最佳，其中y5子離子的響應(yīng)強(qiáng)度在C-末端y-系列產(chǎn)物離子中最高，適用于MRM監(jiān)測(cè)，而y6子離子和y7子離子分別具有第2和第3高的響應(yīng)強(qiáng)度。因此，選擇m/z 526.272＋～580.28＋、m/z 526.272＋～693.37＋和 m/z 526.272＋～840.44＋的離子躍遷用于該特征肽段的鑒定。同上方法，獲得其余肽段適用于MRM監(jiān)測(cè)的離子對(duì)信息。以綏農(nóng)1號(hào)大豆作為實(shí)驗(yàn)樣本，對(duì)特征肽段的RT、CE值和DP值等MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終的HPLC-MRM方法能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)上述11 種大豆主要過(guò)敏原的29 條特征肽段（表2）。圖5顯示了正離子采集模式下綏農(nóng)1號(hào)大豆樣品中上述過(guò)敏原特征肽段的提取離子色譜圖，各特征肽段在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下均得到較好的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)應(yīng)的色譜峰分離效果良好、峰形對(duì)稱且響應(yīng)強(qiáng)度高。

圖4 β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 4 Tandem mass spectrum of signature peptide NPFLFGSNR of β-conglycinin α subunit

圖5 大豆主要過(guò)敏原特征肽段的提取離子色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of signature peptides of major allergens in soybean

2.6 特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用于檢測(cè)的特征肽段應(yīng)具有序列保守性，覆蓋絕大多數(shù)大豆品種，因此進(jìn)一步利用24 個(gè)代表性大豆品種對(duì)所選擇的特征肽段進(jìn)行特異性驗(yàn)證。結(jié)果表明，同一條特征肽段在不同大豆品種中的響應(yīng)強(qiáng)度存在差異，如 β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段ESYFVDAQPK在焉耆黃豆中的響應(yīng)強(qiáng)度最高，而在瑞金青皮豆中的響應(yīng)強(qiáng)度最低；大豆球蛋白G1亞基的特征肽段VLIVPQNFVVAAR在焉耆黃豆中的響應(yīng)強(qiáng)度與在上饒八月白中的響應(yīng)強(qiáng)度相差一個(gè)數(shù)量級(jí)；KTI的特征肽段FIAEGHPLSLK在青豆中的響應(yīng)強(qiáng)度為泌陽(yáng)小籽黃的300多倍等。雖然不同大豆品種的肽段/蛋白質(zhì)的組成和含量不同，但所選擇的29 條特征肽段均存在于被測(cè)的24 個(gè)大豆品種中（圖6），體現(xiàn)出良好的特異性。該結(jié)果與Ma Yingtao等[31]報(bào)道的桃脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LTPI）的Pru p 3.01過(guò)敏原蛋白在不同栽培品種中的含量存在顯著差異的結(jié)果一致。

圖6 不同大豆品種中預(yù)選特征肽段的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Mass spectrometry verification of signature peptides selected for different soybean cultivars

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)和Skyline等生物信息學(xué)軟件完成肽段匹配，成功篩選到可用于表征11 種大豆主要過(guò)敏原（大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基， β-伴大豆球蛋白的α′、α和β亞基，P34、P28以及KTI）的特征肽段共29 條，并優(yōu)化了這些肽段的三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的MRM檢測(cè)參數(shù)，利用24 個(gè)代表性大豆品種對(duì)特征肽段的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，從而建立了11 種大豆主要過(guò)敏原的UPLC-MS/MS-MRM定性檢測(cè)方法。與現(xiàn)有大豆過(guò)敏原的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法相比，本方法檢測(cè)目標(biāo)包含了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的所有亞基，檢測(cè)結(jié)果能夠全面、準(zhǔn)確地代表大豆品種和大豆制品中所含的過(guò)敏原。

引起食物過(guò)敏免疫應(yīng)答的不是整個(gè)過(guò)敏原蛋白，而是其中某一段連續(xù)的氨基酸序列（線性抗原表位）或由幾段不連續(xù)氨基酸序列形成的空間構(gòu)象（構(gòu)象表位）?，F(xiàn)階段，本實(shí)驗(yàn)所確定的特征肽段中，有些屬于抗原表位的組成部分（如β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR和ESYFVDAQPK），有些則與抗原表位無(wú)關(guān)（如β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段EQQQEQQQEEQPLEVR）。由于在加工食品中蛋白質(zhì)易發(fā)生降解，此時(shí)應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)中某些特征肽段得到的過(guò)敏原含量可能無(wú)法與實(shí)際樣品的致敏性強(qiáng)弱相關(guān)聯(lián)[32]。

本研究下一步將以挖掘到的特征肽段為檢測(cè)靶標(biāo)，合成相應(yīng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽，詳盡考察定量限、檢出限、回收率、重復(fù)性等方法學(xué)要素，最終建立食品中11 種大豆主要過(guò)敏原的定量檢測(cè)方法，為大豆過(guò)敏研究、大豆脫敏試劑開(kāi)發(fā)以及低致敏性大豆品種培育、嬰幼食品中大豆蛋白含量檢測(cè)等提供技術(shù)支持，為完善我國(guó)食物過(guò)敏標(biāo)簽立法和食品安全監(jiān)管提供技術(shù)保障。