唐群，吳華，張熙，劉春燕，董翔，王茜

論著·實驗研究

六味地黃湯對慢性腎衰竭大鼠腎組織ZO-1、N-cadherin及Vimentin表達的影響

唐群1，吳華2，張熙2，劉春燕1，董翔1，王茜1

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南 長沙 410007

觀察六味地黃湯對慢性腎衰竭大鼠腎組織緊密連接蛋白1（ZO-1）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表達的影響，探討其干預腎間質纖維化的作用機制。健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、六味地黃湯組和依那普利組。5/6腎切除術復制慢性腎衰竭模型，各給藥組給予相應藥物灌胃，每日1次。給藥8周后，腹主動脈放血法處死大鼠，檢測大鼠腎功能指標，HE染色觀察腎組織病理變化，Masson染色觀察膠原纖維沉積，免疫組化檢測腎組織ZO-1、N-cadherin、Vimentin蛋白表達。與假手術組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平明顯升高（＜0.05）；腎組織病變明顯，大量膠原纖維沉積（＜0.05）；腎組織ZO-1蛋白表達明顯降低（＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯升高（＜0.05）。與模型組比較，六味地黃湯組大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平明顯降低（＜0.05）；腎組織病變程度減輕，少量膠原纖維沉積（＜0.05）；腎組織ZO-1蛋白表達明顯升高（＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯降低（＜0.05）。六味地黃湯通過上調ZO-1的表達，下調N-cadherin、Vimentin的表達，延緩腎間質纖維化，其作用機制與抑制腎小管上皮細胞間充質轉化有關。

慢性腎臟??；5/6腎切除術；上皮細胞間充質轉化；六味地黃湯；大鼠

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的主要病理特征是腎臟纖維化，上皮細胞間充質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是促進腎臟纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要機制[1]。六味地黃湯是臨床治療CKD的有效方劑[2]，但其具體作用機制尚未完全闡明。本研究通過5/6腎切除術復制慢性腎衰竭大鼠模型，觀察六味地黃湯對慢性腎衰竭大鼠腎組織緊密連接蛋白1（ZO-1）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表達的影響，探討其干預腎間質纖維化的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物

健康雄性SD大鼠50只，體質量（150±20）g，動物許可證號SYXK（湘）2016-0002，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室。

1.2 藥物

六味地黃湯（熟地黃24 g，酒萸肉12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，鹽澤瀉9 g，茯苓9 g），購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，所有飲片經鑒定均符合2015年版《中華人民共和國藥典》有關規(guī)定和標準。飲片進行2次煎煮后過濾，濾液混勻，于水浴恒溫器上將藥物濃縮至含原藥材1 g/mL。馬來酸依那普利片，揚子江藥業(yè)集團股份有限公司，批號19042111，加蒸餾水充分溶化，配制成濃度為1 mg/mL的懸濁液。

1.3 主要試劑與儀器

尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、24 h尿蛋白（24 h UAlb）定量試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號分別為20190602、20190529、20190522；ZO-1、N-cadherin、Vimentin多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為AH09144321、AG09114506、AG10165239；通用二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為PV-9000、ZLI-9019。輪轉石蠟切片機（德國徠卡RM2235），生物組織攤片機（浙江金迪YD-A），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，DNP-9162），BA410顯微鏡（德國Motic），Motic 6.0數碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪儀器儀表有限公司）。

1.4 分組及造模

50只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組（10只）和手術組（40只）。假手術組打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉，腎臟不切除，手術組按照文獻[3]方法進行5/6腎切除術造模。造模成功后，將39只大鼠（死亡1只，有大量腹水，考慮腹腔感染）隨機分為模型組、六味地黃湯組、依那普利組，每組13只。灌胃第1周模型組和六味地黃湯組各死亡2只和1只，死亡原因均考慮灌胃誤吸；灌胃第2周依那普利組死亡1只，死亡原因考慮腸梗阻。死亡大鼠從相應組別直接剔除，最終進入實驗的大鼠為假手術組10只、模型組11只、六味地黃湯組12只和依那普利組12只。

1.5 給藥

造模成功后第2周起灌胃，六味地黃湯組給予6.75 g/kg六味地黃湯灌胃[4]，依那普利組予10 mg/kg依那普利懸濁液灌胃[5]，假手術組和模型組予10 mL/kg蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

1.6 標本采集及處理

灌胃8周后，腹主動脈放血法處死大鼠，處死前代謝籠收集24 h尿量測定24 h UA1b，腹主動脈采血檢測血BUN和SCr，4%多聚甲醛固定腎組織，用于HE染色和Masson染色，觀察腎組織病理變化及膠原纖維沉積程度。免疫組化檢測ZO-1、N-cadherin、Vimentin蛋白的表達。

1.7 腎功能檢測

大鼠腹主動脈取血，3000 r/min離心15 min，分離血清，分裝后-70 ℃冰箱保存待測。血BUN測定采用二乙酰一肟顯色法，SCr測定采用堿性苦味酸比色法，ELISA檢測24 h UAlb，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.8 病理形態(tài)觀察

取4%多聚甲醛固定好的腎組織，乙醇脫水、二甲苯透明、62 ℃浸蠟、包埋，制成蠟塊，置于4 ℃冰箱保存。腎組織切片（厚約4 μm），分別進行HE染色、Masson染色。HE染色觀察腎臟病理變化，進行腎小管間質損傷指數評分[6]。評分指標：腎小管萎縮、擴張、上皮細胞空泡形成、紅細胞管型、蛋白管型、白細胞管型、間質水腫、間質炎性細胞浸潤。每個指標設4個等級：正常0分，輕度1分，中度2分，重度3分。腎小管間質損傷指數為該標本5個視野評分的平均值。Masson染色觀察膠原纖維沉積情況，400倍光鏡下每張切片隨機選取10個不重復視野，利用Image Pro Plus 6.0軟件分析膠原纖維占整個視野百分比。

1.9 免疫組化檢測

石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2室溫孵化15 min，滅活內源性過氧化物酶；蒸餾水進行沖洗后PBS漂洗5 min×2次；抗原修復和封閉，加一抗（1∶50），37 ℃孵育2 h；PBS漂洗5 min×3次；加二抗（1∶100），37 ℃孵育20 min；PBS漂洗5 min×3次；滴加堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min；PBS漂洗5 min×3次；DAB顯色；待切片自然風干后，滴入中性樹膠封片。400倍光鏡下每張切片隨機選取5個腎皮質視野進行觀察。陽性表達呈淺黃色、棕黃色或棕褐色。采用Motic Med 6.0數碼醫(yī)學圖像系統(tǒng)測定分析陽性細胞平均光密度值，蛋白表達越強則平均光密度值越大。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 六味地黃湯對模型大鼠腎功能的影響

與假手術組比較，模型組大鼠24 h UAlb、BUN和SCr水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠24 h UAlb、BUN和SCr水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；六味地黃湯組和依那普利組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠24 h UAlb、BUN和SCr水平比較（±s）

注：與假手術組比較，▲＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.2 六味地黃湯對模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

2.2.1 HE染色結果

灌胃8周后，假手術組大鼠腎小球結構完整，腎小管上皮細胞排列整齊且基底膜完整，間質少，未見明顯炎性細胞浸潤；模型組大鼠腎小球硬化、腎小管萎縮、間質纖維組織增生，大量炎性細胞浸潤，部分腎小球代償性肥大、腎小管代償性擴張，管腔內可見蛋白管型；六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織病變程度均有改善。與假手術組比較，模型組大鼠腎小管間質損傷指數評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎小管間質損傷指數評分均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；六味地黃湯組和依那普利組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。結果見圖1、表2。

2.2.2 Masson染色結果

灌胃8周后，假手術組大鼠腎小球、腎小管形態(tài)正常，腎間質未見明顯膠原纖維；模型組大鼠腎小球玻璃樣變，腎小管萎縮消失，間質纖維化明顯，可見大量染成藍色的膠原纖維；六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎小管間質見少量膠原纖維，纖維化程度明顯減輕。與假手術組比較，模型組大鼠腎小管間質膠原面積百分比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎小管膠間質原面積百分比減少，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。結果見圖2、表3。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE染色，×200）

表2 各組大鼠腎小管間質損傷指數評分比較（±s，分）

注：與假手術組比較，▲＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)（Masson染色，×200）

表3 各組大鼠腎小管間質膠原面積百分比比較（±s，%）

注：與假手術組比較，▲＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.3 六味地黃湯對模型大鼠腎組織緊密連接蛋白1、N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達的影響

ZO-1蛋白陽性著色呈淺黃色至棕褐色，主要表達在細胞質。假手術組大鼠腎小管上皮細胞強陽性表達，腎小球未見明顯表達，模型組微弱表達，六味地黃湯組和依那普利組表達增強，見圖3。N-cadherin蛋白陽性著色呈淺黃色至棕褐色，主要表達在細胞膜和細胞質。假手術組表達不明顯，模型組腎小管上皮細胞高表達，尤以基底膜明顯，腎小球未見明顯表達，六味地黃湯組和依那普利組表達減弱，見圖4。Vimentin蛋白陽性著色呈淺黃色至棕黃色，主要表達在腎小管上皮細胞細胞質。假手術組腎小管上皮細胞微弱表達，腎小球不表達，模型組腎小管上皮細胞高表達，尤以遠曲小管明顯，六味地黃湯組和依那普利組表達明顯減弱，見圖5。與假手術組比較，模型組大鼠腎組織ZO-1蛋白表達明顯降低，N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織ZO-1蛋白表達明顯升高，N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；六味地黃湯組和依那普利組比較差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。見表4。

圖3 各組大鼠腎組織ZO-1蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖4 各組大鼠腎組織N-cadherin蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖5 各組大鼠腎組織Vimentin蛋白陽性表達（免疫組化染色，×400）

表4 各組大鼠腎組織ZO-1、N-cadherin和Vimentin蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組比較，▲＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

3 討論

CKD主要病理特點為腎小球硬化、腎小管萎縮消失和腎間質纖維化?？刂颇I間質纖維化，對于治療慢性腎臟病、延緩慢性腎衰竭起關鍵作用[7]。EMT是腎間質纖維化的重要機制之一。20世紀90年代中期Strutz[8]首先提出成年動物腎小管上皮細胞可轉變?yōu)殚g充質的成纖維細胞，進而推測成年動物腎臟也可發(fā)生EMT。近年來Strutz假說得到大量證據的支持，EMT在腎間質纖維化的進展中起著至關重要的作用[9]。EMT過程中，成熟的上皮細胞喪失其上皮表型，而獲得未成熟的間充質表型，可表現為上皮細胞表型如細胞角蛋白、ZO-1、E-cadherin逐漸喪失，而間質細胞表型如Vimentin、纖維連接蛋白、N-cadherin、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達增加[10-11]。

CKD屬中醫(yī)學“水腫”“關格”“癃閉”等范疇。六味地黃丸（湯）出自宋代錢乙《小兒藥證直訣》，由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮組成，其組方嚴謹，配伍得當，具有三補三瀉的特點。中醫(yī)探討腎間質纖維化病因及發(fā)病機制，提出“虛、痰（濁）、瘀、毒”四大病機學說[12]，其中虛是腎間質纖維化的始動因素，痰（濁）、瘀是構成腎間質纖維化的病理基礎，而毒是加重腎間質纖維化不可忽視的方面。針對其四大病機，六味地黃湯“三補三瀉”，既補腎虛，又能化痰（濁）、去瘀、毒。本實驗結果顯示，與模型組比較，六味地黃湯組大鼠24 h UAlb、BUN、SCr水平均明顯降低（＜0.05），光鏡下大鼠腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化程度明顯減輕，腎小管間質損傷指數評分明顯降低，腎小管間質膠原面積百分比明顯下降（＜0.05），提示六味地黃湯能明顯改善5/6腎切除大鼠腎功能，減輕腎組織病理變化和膠原纖維沉積，對慢性腎衰竭大鼠有明顯的治療作用。

為進一步闡明六味地黃湯防治CKD的作用機制，本研究從EMT的角度，進一步觀察六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織ZO-1、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響。ZO-1是與緊密連接相關的蛋白，主要存在于上皮細胞、內皮細胞間連接復合體中，可維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，保持上皮細胞的極性，影響細胞的運動、增殖、分化，調節(jié)細胞功能。N-cadherin是鈣黏蛋白家族中一個經典成員，正常主要在神經組織和間葉細胞中表達，起細胞間黏附作用。Vimentin是間葉細胞骨架中間纖維的主要組成成分，廣泛分布于間充質細胞。因此，ZO-1是上皮細胞的重要蛋白標志，而N-cadherin和Vimentin是間充質細胞的重要蛋白標志。熊飛等[13]研究發(fā)現，高糖腹膜透析液可引起腹膜間皮細胞的損傷，影響緊密連接和ZO-1的表達，促進EMT的發(fā)生，引起腹膜纖維化。Heuberger等[14]研究發(fā)現，N-cadherin的表達有助于血管形成及EMT發(fā)生，從而使腫瘤細胞更加富于侵襲力，易于轉移。王雪瑤等[15]研究發(fā)現，轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導的HK-2細胞中E-cadherin表達明顯降低甚至消失，而α-SMA和Vimentin表達明顯升高，促進EMT的發(fā)生，且表型轉化能力與TGF-β1的劑量有關。因此，ZO-1、N-cadherin、Vimentin參與腫瘤的侵襲與轉移或纖維化過程，其機制均與EMT的發(fā)生有關。本研究結果顯示，與模型組比較，六味地黃湯組大鼠腎組織ZO-1蛋白表達明顯升高，而N-cadherin、Vimentin蛋白表達不同程度降低，差異均有統(tǒng)計學意義（＜0.05），提示六味地黃湯能上調慢性腎衰竭大鼠上皮細胞表型標記物，同時下調間葉細胞表型標記物，可通過抑制腎小管上皮細胞間充質轉化發(fā)揮抗纖維化的作用。

綜上所述，CKD發(fā)生機制復雜，目前尚未完全闡明，其主要病變特征是腎臟纖維化，而EMT在腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。六味地黃湯防治CKD的作用機制可能與其抑制EMT的發(fā)生有關。

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Effects ofDecoction on Expressions of ZO-1, N-cadherin andVimentinin Renal Tissue of Rats with Chronic Renal Failure

TANG Qun1, WU Hua2, ZHANG Xi2, LIU Chunyan1, DONG Xiang1, WANG Xi1

To observe the effects ofDecoction on the expressions of ZO-1, N-cadherin and Vimentin in renal tissue of rats with chronic renal failure; To explore its mechanism in the renal interstitial fibrosis.Healthy male SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group,Decoction group and Enalapril group. 5/6 nephrectomy was performed to replicate chronic renal failure model. Rats in each administration group were given intragastric administration once a day. 8 weeks after medication, the rats were killed by abdominal aorta bleeding. Renal function was measured. Pathological changes were observed by HE staining. Collagen fiber deposition was observed by Masson staining. The expressions of ZO-1, N-cadherin, Vimentin protein were detected by immunohistochemistry.Compared with sham-operation group, 24 h urinary protein, blood urea nitrogen and serum creatinine in model group significantly increased (<0.05), renal tissue lesions significantly increased (<0.05), collagen fiber deposition significantly increased (<0.05); the protein level of ZO-1 protein in renal tissue significantly decreased (<0.05), and the protein levels of N-cadherin and Vimentin significantly increased (<0.05). Compared with the model group, the levels of 24 h urine protein, blood urea nitrogen and serum creatinine were significantly decreased (<0.05) in theDecoction group, and the degree of renal lesion was reduced, a small amount of collagen deposition appeared (<0.05); the protein level of ZO-1 protein increased (<0.05), while the protein levels of N-cadherin and Vimentin decreased (<0.05).Decoction can delay renal interstitial fibrosis by up-regulating the expression of ZO-1 and down-regulating the expressions of N-cadherin and Vimentin, and the mechanism may be related to the inhibition of renal tubular epithelial-mesenchymal transformation.

chronic kidney disease; 5/6 nephrectomy; epithelial-mesenchymal transformation;Decoction; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)12-0032-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005340

國家自然科學基金（81503442、81603470）；湖南省教育廳科研項目（17B197）

（2020-05-19）

（2020-06-02；編輯：華強）