蒲榮 周小棉

1東莞市松山湖中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣東東莞523326）；2廣東省廣州市寶創(chuàng)生物技術(shù)有限公司（廣州510663）

由于缺乏安全和低成本的方式獲得足夠病毒或細(xì)菌含量標(biāo)本，目前肺部感染的診斷受到限制。冠狀病毒的一個重要的特點(diǎn)是通過痰和飛沫或氣溶膠傳播，現(xiàn)有的診斷方法，由于病程中排病毒時機(jī)未知，造成口腔、鼻咽部取樣所致的分子診斷樣本陽性率低（30% ～50%）；同時，因咽拭子樣本取樣困難，不僅會消耗大量的醫(yī)療資源，甚至?xí)疳t(yī)務(wù)人員感染［1］。通過氣溶膠和飛沫進(jìn)行診斷肺部感染可能是未來新的發(fā)展方向。

1 肺部標(biāo)本與局限性

目前診斷肺部感染最常用的標(biāo)本是咳痰和咽拭子樣本。然而，各種疾病導(dǎo)致的痰液分泌差異很大。通常可自發(fā)或通過吸入生理鹽水誘導(dǎo)獲得，但對肺結(jié)核患者或囊性纖維化導(dǎo)致的支氣管擴(kuò)張患者會使其支氣管擴(kuò)張加重。與此相反，約50%結(jié)節(jié)性支氣管擴(kuò)張（非結(jié)核分枝桿菌）感染患者無痰，約1/3 的細(xì)菌性肺炎患者可能無痰。一個關(guān)鍵的問題是痰標(biāo)本的質(zhì)量，因?yàn)樵S多采集的痰來自上呼吸道，不能代表下呼吸道。兒童通常不能提供高質(zhì)量的痰標(biāo)本，因此病原體通常通過臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室或放射學(xué)模式來推斷。如果無法獲得高質(zhì)量的痰標(biāo)本，特別是如果患者病情嚴(yán)重，通常需要通過支氣管鏡獲得肺泡灌洗液檢查。而咽拭子取樣雖然簡單快速，但也存在如下不足：（1）疾病指征及留取時間把握不夠，造成結(jié)果的參考價(jià)值較低。（2）標(biāo)本采集部位不正確，沒有采集到病灶所在部位分泌物，尤其是鼻拭子，采集部位往往較淺，沒有達(dá)到鼻前庭。（3）操作者業(yè)務(wù)知識欠缺，對操作標(biāo)準(zhǔn)及流程掌握不夠。因此，造成陽性率低，假陰性率高的現(xiàn)象。然而，肺部病毒感染或少數(shù)細(xì)菌感染一個重要的特點(diǎn)是通過患者或帶菌者的飛沫和呼吸氣溶膠傳播。氣溶膠是導(dǎo)致這些疾病防控難度增加的重要原因。流感和SARS 傳播尤其明顯，種種跡象表明新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）也可能存在氣溶膠傳播［2］。因此，飛沫和氣溶膠有潛力成為臨床上有用的標(biāo)本。

2 氣溶膠和飛沫作為肺部感染診斷的研究進(jìn)展

在過去的二十年里，在收集傳染性氣溶膠方面有了很大的進(jìn)展，尤其是在結(jié)核病和流感的研究方面。

2.1 結(jié)核桿菌可通過氣溶膠傳播結(jié)核桿菌病萊利等［3］進(jìn)行了一項(xiàng)精妙的研究，證明了通過空氣傳播結(jié)核病的可能性。他們證明，豚鼠在呼吸了一個偏遠(yuǎn)的實(shí)驗(yàn)病房里住有結(jié)核病患者的空氣后，就患上了結(jié)核桿菌病。在一項(xiàng)新型咳嗽氣溶膠采樣系統(tǒng)（CASS）的初步概念驗(yàn)證研究［4］中，12 例住院肺結(jié)核患者中只有4 例患者（25%）因自愿咳嗽產(chǎn)生的氣溶膠可培養(yǎng)結(jié)核菌。隨后的6 組來自烏干達(dá)和巴西的涂片陽性培養(yǎng)證明結(jié)核病患者發(fā)現(xiàn)，43%（100/233）的患者產(chǎn)生了可培養(yǎng)的氣溶膠，其中24%（57/233）是高氣溶膠生產(chǎn)者（氣溶膠采樣產(chǎn)生≥10 菌落形成單位（cfu）的結(jié)核分枝桿菌）［5-7］。另外兩項(xiàng)來自南非的研究，一項(xiàng)是對CASS 方法稍作修改，另一項(xiàng)是讓患者坐在取樣室內(nèi)固定式呼吸氣溶膠取樣［8-9］。研究［9］結(jié)果表明，傳染性氣溶膠的產(chǎn)生僅與痰涂片等級或液體培養(yǎng)基中的陽性時間測量的細(xì)菌負(fù)荷有部分關(guān)系，并且在開始結(jié)核病治療后迅速減少。在巴西和烏干達(dá)的研究中，氣溶膠檢測方法比痰菌涂片更能預(yù)測家庭接觸者的結(jié)核病感染風(fēng)險(xiǎn)。此外，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，繼發(fā)結(jié)核病患者主要發(fā)生在氣溶膠陽性結(jié)核病例的居家密切接觸者中［3］。南非兩個不同研究小組的咳嗽氣溶膠培養(yǎng)結(jié)果與另一個研究小組在烏干達(dá)和巴西發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析可以在呼氣中發(fā)現(xiàn)比固體培養(yǎng)中的菌落形成單位更高濃度的分子信號［9］。另外，英國的一個研究小組利用分子檢測方法在用改良的口罩收集肺結(jié)核患者呼出的氣休中發(fā)現(xiàn)了高濃度的結(jié)核分枝桿菌DNA［10］。雖然分子檢測與培養(yǎng)方法的結(jié)果不一致，但收集的氣溶膠不失為一種很有前途的樣本。兩者不同的原因可能是由于氣溶膠中細(xì)菌的生存能力不同，但這需要進(jìn)一步的研究。

2.2 流感病毒可通過氣溶膠和飛沫傳播目前研究認(rèn)為流感至少一部分是通過接觸和飛沫傳播的。然而，越來越多的證據(jù)表明，空中傳播的霧滴核也發(fā)揮了重要作用，特別是在短期范圍。病毒性呼吸道感染現(xiàn)在通常通過收集呼吸道黏液樣本并用抗原或基于聚合酶鏈反應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)行分析來診斷。目前，從呼吸道取得臨床樣本的常用方法有鼻咽拭子、鼻咽分泌物和鼻腔清洗液、氣管分泌物、支氣管肺泡灌洗或痰液收集。這些技術(shù)都有缺點(diǎn)：鼻咽拭子、口咽拭子、吸出物和洗滌物從上呼吸道提供黏液，而上呼吸道并不總是包含相同的病毒載量或者相同種類的病毒［11］。鼻咽拭子的采集對患者，尤其是兒科患者來說是不舒服的，兒科常常首選鼻腔清洗液和鼻咽分泌物。支氣管肺泡灌洗提供了一個更加確定的下呼吸道感染樣本，但是這個過程相當(dāng)具有侵入性，因此很少使用。痰液通常含有上呼吸道黏液，人為產(chǎn)生痰液對患者來說是困難和難以忍受的，可能需要霧化吸入，這可能導(dǎo)致支氣管痙攣。

患者在咳嗽和潮汐呼吸過程中產(chǎn)生的氣溶膠粒子的收集可能為收集呼吸道病毒的診斷標(biāo)本提供一種非侵入性的方法。在受感染患者呼出的氣和咳嗽氣霧劑中檢測到呼吸道病毒，特別是流感病毒［11］。MILTON等［12］收集了37例受試者在30 min內(nèi)呼氣和咳嗽中的氣溶膠粒子，并在35個樣本（95%）中發(fā)現(xiàn)了流感病毒DNA。LINDSLEY等［15］從47例流感陽性受試者咳嗽中收集了這些粒子，在38個樣本中檢測到了流感DNA。MILTON 等［12］及YAN 等［13］還發(fā)現(xiàn)，鼻咽拭子中的流感病毒拷貝數(shù)量遠(yuǎn)低于氣溶膠粒子的拷貝數(shù)量，兩者只有微弱的相關(guān)性，這表明氣溶膠粒子感染源于肺部感染，而不是源于呼吸道頭部。同時也發(fā)現(xiàn)，對于流感患者，有時觀察到鼻咽拭子陰性的患者咳嗽氣溶膠和飛沫呈陽性［14］。這些觀察和越來越敏感的分子標(biāo)記物的發(fā)展表明，咳嗽或呼吸氣溶膠有可能被用作診斷疾病的標(biāo)本。因此，與鼻咽拭子相比，呼吸道氣溶膠可能為下呼吸道感染提供更具代表性的診斷標(biāo)本來源。

2.3 SARS 和禽流感病毒可通過氣溶膠傳播2004年中國香港學(xué)者在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表論文，分析香港淘大花園多人集中感染嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）病毒的案例，推斷病毒通過樓宇間的氣溶膠傳播［14］。此外，還有學(xué)者利用雪貂研究了禽流感病毒通過氣溶膠傳播的能力［15］。BERTRAN等［16］在實(shí)驗(yàn)室模擬處理感染了人源H5N1病毒的無癥狀雞（族群1 和2.2.1）和禽源H5N1 病毒的雞（族群1.1、2.2 和2.1）時，檢測到了傳染性飛沫和氣溶膠，證明在家庭或活禽市場屠宰受感染的家禽時，禽類和家禽之間可以通過空氣傳播禽流感病毒。在COVID-19 感染方面，不僅存在飛沫和痰等直接接觸傳播，也可能存在通過氣溶膠間接傳播的高風(fēng)險(xiǎn)。國家《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》已經(jīng)將氣溶膠傳播列入其中。因此，疑似患者和患者的呼出的氣溶膠和飛沫中病毒或細(xì)菌的安全、有效收集是面臨的關(guān)鍵問題。

3 取樣方法的研究進(jìn)展

近十多年以來，全球的科研工作者對氣溶膠和飛沫的收集也做了一些有益的探索。各種取樣裝置可用于回收空氣中的病毒。最常見的是液體和固體沖擊器（如安德森采樣器、狹縫采樣器和旋風(fēng)采樣器，通常能更有效地捕獲大顆粒），以及過濾器和靜電除塵器［17］。但其中絕大多數(shù)是利用自建的大型氣溶膠收集器進(jìn)行流感或結(jié)核傳染力的研究。研究人員從13 例患有慢性阻塞性肺?。–OPD）的患者（其中5 例患者與同期痰液樣本配對）和10名健康人對照中，抽取了15 min口罩樣本，從患者樣本中提取了DNA［20］。英國的一個研究小組利用外科口罩和改良的口罩（含有明膠過濾膜）收集患者呼吸氣體和飛沫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用外科口罩的提取物對PCR 反應(yīng)有強(qiáng)烈的抑制作用，而明膠過濾膜提取物的抑制作用很小或沒有抑制作用。他們還利用PCR分子方法在6個肺結(jié)核患者的3 個口罩中發(fā)現(xiàn)了高濃度的結(jié)核分枝桿菌DNA［10］。這就提出了一種可能性，即在某些情況下，口罩式取樣可能會避免或降低那種昂貴的、侵入性的取樣方法。從方便、安全、經(jīng)濟(jì)和普適性等方面考慮，口罩取樣可能為涂片陰性或失能的患者提供一種更好的替代取樣工具。有研究［19］表明，為了提高診斷用口罩取樣的靈敏度，可以增加取樣次數(shù)和時間以及采用更靈敏的分子分析法。

4 展望

綜上所述，微生物氣溶膠可能更能代表病毒性疾病中的下呼吸道疾病，在這種疾病中痰液的產(chǎn)生并不常見。微生物氣溶膠作為疾病的診斷性測試，對于收集痰液特別具有挑戰(zhàn)性的人群可能特別有用，例如兒童、感染人類免疫缺陷病毒的患者、其他免疫抑制患者和老年人。由于呼出氣溶膠和飛沫采集是非侵入性的，所以重復(fù)采集比傳統(tǒng)方法更易被患者接受。如果提高檢測方法的靈敏度，呼出的氣溶膠和飛沫分析可以成為診斷呼吸道感染和監(jiān)測病程和治療反應(yīng)的有用工具，而氣溶膠和飛沫將是肺部感染診斷的新標(biāo)本。