任志鵬 康宇翔 胡永成

1天津市天津醫(yī)院骨科（天津300211）；2天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（天津300070）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）好發(fā)于兒童及年輕患者，約占兒童腫瘤的5%，據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所統(tǒng)計(jì)，24 歲以下人群每年骨肉瘤發(fā)病率為4.4 例/100 萬(wàn)人，這可能與青春期股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端的骨骺生長(zhǎng)板生長(zhǎng)迅速有關(guān)［1］。盡管通過(guò)規(guī)范多藥方案的新輔助化療和手術(shù)使患者預(yù)后得到了改善，但由于早期臨床癥狀不明顯，轉(zhuǎn)移發(fā)生早及惡性程度高等原因，治療效果仍不理想；最近幾十年來(lái)，骨肉瘤的治療進(jìn)展甚微，5年生存率也僅為55%～65%，而并發(fā)肺轉(zhuǎn)移者2年生存率不到25%，治療后生存期進(jìn)入平臺(tái)期，傳統(tǒng)治療方案難以獲得突破性的療效［2-3］。因此，進(jìn)一步了解骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制，探尋早期診斷骨肉瘤的分子標(biāo)志物以及新的治療靶點(diǎn)成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著基因組學(xué)研究的深入，曾經(jīng)被誤認(rèn)為是“噪音”的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）日益受到重視，目前的研究顯示lncRNA 在基因的表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育、物種進(jìn)化、物質(zhì)代謝以及腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等過(guò)程均具有重要作用［4-9］。本文將對(duì)與骨肉瘤相關(guān)的lncRNA 研究進(jìn)展做一闡述，旨在為骨肉瘤診治提供新的思路。

1 骨肉瘤與lncRNA 簡(jiǎn)述

骨肉瘤發(fā)病年齡通常呈雙峰分布，青少年和老年人發(fā)病率最高，青少年患者峰值集中在15 歲，主要為原發(fā)性骨肉瘤；老年患者峰值位于75 歲，主要為繼發(fā)性骨肉瘤，多繼發(fā)于Paget 病或其他骨損傷。骨肉瘤主要有髓內(nèi)、表面、骨外3 種亞型，髓內(nèi)高級(jí)別骨肉瘤是經(jīng)典的病理類型，好發(fā)于青少年患者長(zhǎng)骨干骺端，占全部骨肉瘤的80%，大多數(shù)的文獻(xiàn)和研究數(shù)據(jù)都是基于該類型的原發(fā)性骨肉瘤［1］。疼痛是骨肉瘤早期最常見的癥狀，但由于早期疼痛癥狀多為間斷性，容易與青少年生長(zhǎng)痛混淆，而導(dǎo)致確診較晚，當(dāng)確診骨肉瘤時(shí)，約80%患者已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，最常見于肺部轉(zhuǎn)移［2］。骨肉瘤的病因機(jī)制、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等方面仍然存在較大的模糊區(qū)域，生存率并未獲得明顯地改善［3］。

LncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 核苷酸的功能性RNA 分子，早期研究發(fā)現(xiàn)其缺乏保守的開放式閱讀框（ORFs），因而被認(rèn)為是“噪音”，沒(méi)有生物學(xué)特性［6］。但隨著研究的深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)lncRNA 在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、核內(nèi)運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞的組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、DNA 甲基化、介導(dǎo)基因激活或沉默等作用［5］。大多數(shù)lncRNA 由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工和修飾成為成熟的lncRNA，大量存在于細(xì)胞核，少量位于細(xì)胞質(zhì)中。lncRNA 的主要生物學(xué)功能包括了以下幾點(diǎn)：（1）作為信號(hào)分子，經(jīng)激活后產(chǎn)生組織或細(xì)胞特異性；（2）參與X 染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要調(diào)控過(guò)程；（3）以多種模式保護(hù)蛋白編碼基因；（4）含有高效的關(guān)鍵序列，類似于啟動(dòng)子等調(diào)控因素，具有比蛋白質(zhì)更敏感的結(jié)構(gòu)功能限制；（5）既有順式調(diào)控作用，又有反式調(diào)控作用，實(shí)現(xiàn)靶基因的雙向調(diào)控［4-9］。

2 骨肉瘤相關(guān)lncRNA 的篩選

基因芯片技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤相關(guān)lncRNA表達(dá)譜的篩選。常用方法是將腫瘤組織與正常組織中差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行高通量測(cè)序篩選，然后通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），進(jìn)行基因本體論（gene ontology）及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)通路注釋及富集分析，最后通過(guò)建立lncRNA 基因與靶基因的基因網(wǎng)絡(luò)圖來(lái)探索差異表達(dá)的lncRNA 與腫瘤的關(guān)系。通過(guò)上述方法，包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤相關(guān)lncRNA 已被篩選識(shí)別。LI 等［10］通過(guò)對(duì)9 例骨肉瘤及癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)25 733 個(gè)骨肉瘤相關(guān)lncRNA 表達(dá)，其中403 個(gè)表達(dá)上調(diào)，798 個(gè)表達(dá)下調(diào)；KEGG分析顯示，34 條相關(guān)信號(hào)通道表達(dá)上調(diào)，32 條相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)有助于骨肉瘤相關(guān)lncRNA 的初步篩選，為探尋應(yīng)用于早期診斷和治療的新型分子靶標(biāo)提供了線索，為后續(xù)研究提供了方向。

3 lncRNA 輔助骨肉瘤的早期診斷

疼痛是骨肉瘤早期最常見的癥狀，最初多為間斷性疼痛，常與青少年生長(zhǎng)痛相混淆，并且影像學(xué)表現(xiàn)往往滯后于臨床癥狀，導(dǎo)致確診較晚［2］。雖然早期檢測(cè)到血液中堿性磷酸酶增高可以輔助成骨型骨肉瘤的診斷，但由于堿性磷酸酶缺乏特異性，臨床診斷價(jià)值有限［11］。WANG 等［12］分別對(duì)骨肉瘤患者術(shù)前術(shù)后及健康對(duì)照志愿者血清中l(wèi)ncRNA FAL1 的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)前血清中FAL1 表達(dá)量高于術(shù)后患者及健康志愿者，并且骨肉瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的患者血清FAL1 表達(dá)量高于未復(fù)發(fā)患者及化療敏感者。HUO 等［13］發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 的表達(dá)水平在較健康個(gè)體顯著升高，并且與腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等存在相關(guān)關(guān)系。聯(lián)合血清lncRNA MALAT1、ALP的AUC檢查可將診斷敏感度及特異度分別由80.8%和72.5%提高到82.6%和82.5%。lncRNA MALAT1［14］、lncRNA THOR［15］、lncRNA HOTAIR 等［16］也被證實(shí)在骨肉瘤患者的循環(huán)系統(tǒng)中異常表達(dá)，可能成為早期篩查的生物標(biāo)志物，但上述lncRNA 在循環(huán)系統(tǒng)中的特異度及敏感度有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 lncRNA 對(duì)骨肉瘤治療的影響

4.1 致癌lncRNA 與抑癌lncRNA研究表明，lncRNA 能夠在骨肉瘤的啟動(dòng)與進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮正向或負(fù)向調(diào)控作用。通過(guò)采集骨肉瘤組織與癌旁組織或不同分期的骨肉瘤組織等臨床標(biāo)本進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)分析，研究目標(biāo)lncRNA 的表達(dá)增量，并結(jié)合生物信息學(xué)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，然后上調(diào)或敲降lncRNA 的表達(dá)增量，通過(guò)細(xì)胞惡性生物學(xué)特性檢測(cè)及動(dòng)物腫瘤接種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用。由此，通過(guò)臨床、細(xì)胞、動(dòng)物3 個(gè)層次相互驗(yàn)證，能夠系統(tǒng)全面地闡明骨肉瘤相關(guān)lncRNA 的作用。

依據(jù)在骨肉瘤調(diào)控中發(fā)揮的正向或負(fù)向作用，lncRNA 可分為致癌lncRNA 與抑癌lncRNA。能促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力及轉(zhuǎn)移過(guò)程，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的lncRNA 被稱為致癌lncRNA［17］。DUAN 等［14］發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1在骨肉瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)均升高，其高表達(dá)常見于腫瘤體積大、臨床分期高及合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況，并證實(shí)MALAT1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-34a/CCND1軸促進(jìn)骨肉瘤的細(xì)胞增殖。ZHANG等［18］也證實(shí)了lncRNA MALAT1 在骨肉瘤中的致癌作用，認(rèn)為可能通過(guò)RAC1/JNK 信號(hào)通路發(fā)揮作用。lncRNA THOR 在骨肉瘤組織中可以檢測(cè)到，但在癌旁組織中卻無(wú)法檢測(cè)到，它可能通過(guò)協(xié)同IGF2BP1 參與腫瘤的生長(zhǎng)［15］。lncRNA PANDA 在骨肉瘤組織中過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞U2OS 的增殖、遷移和侵襲，這一過(guò)程可能是通過(guò)抑制p18 的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1 期向S 期轉(zhuǎn)換完成的［19］。REN 等［20］發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD2-AS1 在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，并通過(guò)募集具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的EZH2，抑制抑癌基因p21表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤的增殖、遷移和侵襲。lncRNA HOTAIR［16］、lncRNA host2［21］、lncRNA snhg1［22-23］、lncRNA ak093407［24］等也被證實(shí)能夠促進(jìn)骨肉瘤的啟動(dòng)與進(jìn)展。

能抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力及轉(zhuǎn)移過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的lncRNA 被稱為抑癌lncRNA。CHE等［25］發(fā)現(xiàn)lncRNA RAB11BAS1 在人骨肉瘤中明顯下調(diào)，并與轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)，RAB11B-AS1 通過(guò)抑制RAB11B 的表達(dá)來(lái)阻止骨肉瘤的進(jìn)展。QU 等［26］發(fā)現(xiàn)lncRNA WWOXAS1 在骨肉瘤組織中下調(diào)，當(dāng)其過(guò)表達(dá)時(shí)，可以抑制了骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性。lncRNA LET［27］、lncRNA GAS5［28］、lncRNA CASC2 等［29］也被證實(shí)屬于骨肉瘤抑癌lncRNA。骨肉瘤相關(guān)的lncRNA 的作用與分子機(jī)制的闡明，可能有助于確定骨肉瘤的治療靶點(diǎn)，為相關(guān)靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)奠定了理論基礎(chǔ)，為臨床新型藥物的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

4.2 lncRNA對(duì)骨肉瘤化療耐藥性的影響與單純的手術(shù)方法相比，聯(lián)合新輔助化療的多模式治療極大的提高了骨肉瘤患者的5年生存率，從10%～20%提高到60%［30］，而化療耐藥往往是另外40%患者預(yù)后不良的重要因素。因此，研究lncRNA 在骨肉瘤化療耐藥中的機(jī)制，改善化療耐藥性，可能成為提高骨肉瘤生存期的新方向。ZHU 等［31］利用基因芯片技術(shù)，篩選出3 465 個(gè)骨肉瘤耐藥細(xì)胞株相關(guān)lncRNA，其中1 761 個(gè)表達(dá)升高，1 704 個(gè)表達(dá)下降，進(jìn)一步研究確定了部分lncRNA 影響骨肉瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，與ABCB1、HIF1a 和FOXC2 基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)?？涤钕璧龋?2］發(fā)現(xiàn)lncRNA HIT 通過(guò)正調(diào)控Snail 蛋白水平，抑制E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的順鉑抵抗。ZHANG 等［33］發(fā)現(xiàn)lncRNA ODRUL 可以上調(diào)經(jīng)典的耐藥相關(guān)基因ABCB1，增加骨肉瘤對(duì)阿霉素的耐藥性，抑制癌細(xì)胞的凋亡。lncRNA CTA［34］可以通過(guò)抑制細(xì)胞自噬提高骨肉瘤組織對(duì)阿霉素的敏感性。由此可知，lncRNA在骨肉瘤化療耐藥中起到關(guān)鍵作用，通過(guò)lncRNA 的靶向調(diào)節(jié)，可能會(huì)逆轉(zhuǎn)化療耐藥，進(jìn)而極大地提高患者的臨床生存期，但尚需進(jìn)一步研究探索從而安全地應(yīng)用于臨床。

5 lncRNA 輔助骨肉瘤臨床預(yù)后評(píng)估

研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 表達(dá)與臨床預(yù)后存在相關(guān)關(guān)系。REN 等［20］通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析及臨床標(biāo)本研究，發(fā)現(xiàn)FOXD2-AS1 高表達(dá)常見于腫瘤體積大，臨床分期晚的患者，這類患者生存期短，預(yù)后差。ZHANG 等［35］研究發(fā)現(xiàn)CBR3-AS1 在骨肉瘤中過(guò)表達(dá)，降低E-cadherin 水平，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，并且與骨肉瘤的大小和轉(zhuǎn)移相關(guān)，是骨肉瘤預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。業(yè)已證實(shí)，HOST2［36］、XIST等［37］也反映了骨肉瘤惡性程度較高，預(yù)后不良。通過(guò)明確lncRNA 與臨床預(yù)后的相關(guān)關(guān)系，可以優(yōu)化臨床治療方案，為手術(shù)和化療的介入治療的時(shí)機(jī)提供科學(xué)依據(jù)。

6 總結(jié)與展望

近年來(lái)，骨肉瘤的臨床治療遭遇瓶頸，治療效果進(jìn)入平臺(tái)期。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，lncRNA 的分子機(jī)制不斷被研究與闡明。相關(guān)lncRNA 不僅可以輔助骨肉瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估，還調(diào)控其生物學(xué)特性和化療耐藥性，有望成為新的治療靶點(diǎn)。但是，lncRNA 的研究目前也面臨著一些挑戰(zhàn)，比如：（1）lncRNA 數(shù)量巨大，功能及作用機(jī)制存在多樣性；（2）難以單純通過(guò)lncRNA 的序列來(lái)預(yù)測(cè)其功能；（3）目前尚未被特征化標(biāo)記的lncRNA 可能編碼關(guān)鍵的的蛋白質(zhì)或多肽，影響目標(biāo)lncRNA 的功能研究。盡管困難重重，但lncRNA 仍被認(rèn)為是腫瘤研究領(lǐng)域的“明日之星”，探索其對(duì)骨肉瘤的影響及分子機(jī)制，有利于骨肉瘤高危人群篩查、降低發(fā)病率和病死率及改善預(yù)后和提高生存率，為臨床診療提供新思路、新方法。