魯?shù)り?林仙華 黃荷鳳

遺傳病是指遺傳物質(zhì)發(fā)生改變導(dǎo)致的疾病，包括胚系遺傳病和體細(xì)胞遺傳病兩大類。遺傳學(xué)分子診斷是指應(yīng)用分子遺傳學(xué)技術(shù)對染色體、基因組、DNA序列進(jìn)行檢測，判斷患者是否存在遺傳物質(zhì)突變。其中，DNA測序技術(shù)是最重要的分子診斷手段。自1977年Sanger發(fā)明DNA測序技術(shù)[1]以來，DNA測序水平得到了顯著提高，尤其是在最近十幾年間快速發(fā)展的下一代測序(next-generation sequencing，NGS)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床和科學(xué)研究中。NGS是基于第1代測序技術(shù)的新型測序技術(shù)，自2005年基于焦磷酸測序法的高通量測序系統(tǒng)應(yīng)用于臨床以來[2]，NGS技術(shù)摒棄了Sanger測序低通量、測序時間較長和成本高的缺點(diǎn)，以高通量、低成本的優(yōu)勢運(yùn)用于遺傳病的診斷中，可一次性檢測受檢者所有相關(guān)基因及其突變情況，大大提高了遺傳病的診斷效率，已成為臨床診斷的重要手段。NGS技術(shù)在臨床上被廣泛應(yīng)用于包括染色體異常、基因組拷貝數(shù)變異、單基因病基因篩查在內(nèi)的多種胚系遺傳病的篩查，并貫穿于生育全周期。本文從生育周期的全過程介紹NGS技術(shù)在遺傳病篩查中的作用。

1 NGS技術(shù)在隱性遺傳病攜帶者孕前篩查中的應(yīng)用

已有研究結(jié)果顯示，每人攜帶0～7個隱性單基因遺傳病的致病突變，攜帶者無任何臨床表現(xiàn)，但會將致病突變向下傳遞；如果女性攜帶X連鎖隱性遺傳病，其所孕男性胎兒患遺傳病的概率為50%；如果夫婦雙方均為常染色體隱性遺傳病攜帶者，所孕胎兒患遺傳病的概率為25%。因此，孕前攜帶者篩查是避免孕育隱性遺傳病胎兒的重要手段。傳統(tǒng)的攜帶者篩查主要依賴于Sanger測序，每次只能鑒定1種或幾種特定的突變基因，且病種有限位點(diǎn)較少，限制了這種有效預(yù)防策略在臨床上的普及。NGS技術(shù)的讀長較短，能同時高精度、高效率、高通量地對DNA分子進(jìn)行序列測定，對單基因隱性遺傳病攜帶者進(jìn)行廣譜篩查。2011年，Bell等[3]應(yīng)用NGS技術(shù)對104名測試者進(jìn)行了針對448種隱性遺傳病的相關(guān)基因測試，結(jié)果顯示，每位測試者平均攜帶2或3種嚴(yán)重兒童疾病的突變基因。目前，隱性遺傳病孕前篩查主要用于輔助生育技術(shù)中供精個體或供卵個體的攜帶者篩查，以及近親婚配夫婦的篩查，未來普通低風(fēng)險夫婦攜帶者群體將成為主要篩查對象。

2 NGS技術(shù)在胚胎植入前產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是指在輔助生殖技術(shù)中，通過對配子或胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)分析，排除有缺陷的胚胎，選擇正常的胚胎植入子宮，從而孕育正常胎兒的診斷方法。早期的診斷方法主要是應(yīng)用PCR或熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH)技術(shù)對單基因異?；蛴邢薜娜旧w異常進(jìn)行檢測；此后，由于比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)和單核苷酸多態(tài)性分析(single nucleotide polymorphisms array，SNP array)等技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步提高了檢測分辨率。隨著全基因組擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化和NGS技術(shù)成本的降低，NGS技術(shù)開始應(yīng)用于PGD領(lǐng)域。NGS技術(shù)能夠高效、精確地篩查出胚胎潛在的染色體異常或者基因突變，選擇無異常的胚胎植入母體，從根本上提高“試管嬰兒”的妊娠成功率和出生后嬰兒的質(zhì)量[4]。

在體外受精(invitrofertilization, IVF)技術(shù)中，染色體非整倍體異常是導(dǎo)致其失敗的主要原因。應(yīng)用NGS技術(shù)可分析單細(xì)胞水平的染色體拷貝變化，從而準(zhǔn)確推斷染色體非整倍性改變，且診斷時間<24 h。染色體病攜帶者在生育時，因產(chǎn)生不平衡配子而導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)、生育力下降、畸形兒出生等，在PGD中應(yīng)用NGS技術(shù)不僅能有效檢測目標(biāo)易位相關(guān)染色體，也能檢測其他染色體異常。目前，應(yīng)用NGS技術(shù)進(jìn)行染色體病診斷的適應(yīng)證主要為羅氏易位攜帶者、大片段相互易位攜帶者、倒位攜帶者等。有研究[5]結(jié)果顯示，相較于目前臨床常用的SNP array，NGS技術(shù)對某些區(qū)域(如性染色體等)異常的診斷準(zhǔn)確率更高。

對于符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因病個體，提取囊胚滋養(yǎng)外層細(xì)胞DNA，通過靶向NGS技術(shù)和全基因組連鎖分析確定囊胚中目的基因的拷貝數(shù)，選擇包含最少拷貝數(shù)基因突變的囊胚進(jìn)行移植。目前已有研究[6]成功地將PGD應(yīng)用于包括甲基丙二酸血癥、X-連鎖腎上腺皮質(zhì)發(fā)育不良、血友病A等在內(nèi)的單基因病的診斷。最近的研究[7]發(fā)現(xiàn)，在囊胚腔液和培養(yǎng)過囊胚的廢培養(yǎng)基中依然存在胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)，該環(huán)境中cffDNA的發(fā)現(xiàn)有望替代傳統(tǒng)的有創(chuàng)胚胎活組織檢查，作為一種無創(chuàng)的檢測材料應(yīng)用于單基因遺傳病的PGD中。

3 NGS技術(shù)在基于母體血漿中cffDNA的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用

3.1 胎兒染色體非整倍體異常 以唐氏綜合征為主的胎兒染色體非整倍體異常是胎兒產(chǎn)前篩查的主要疾病。傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查主要為唐氏血清學(xué)篩查，通過在孕早期或孕中期測定妊娠相關(guān)血漿蛋白A、β-人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)、AFP、游離雌三醇(uncojugated estriol 3，uE3)等水平，結(jié)合孕婦的年齡、孕周、體重等計算胎兒罹患某一遺傳疾病的風(fēng)險率。然而該篩查方法的精度不高，且漏診率高。于孕早、中期穿刺獲取胎兒的絨毛、羊水或臍血等進(jìn)行染色體核型分析[8]的方法對小的染色體結(jié)構(gòu)異常的分辨率較低，受細(xì)胞操作培養(yǎng)的限制，成功率易受細(xì)胞污染、氣候環(huán)境等多種因素的影響，且耗時較長。

1997年，Lo等[9]在母體血液中發(fā)現(xiàn)cffDNA。2008年該團(tuán)隊結(jié)合大規(guī)模平行測序技術(shù)測定母體血液中總游離DNA的片段，成功鑒定出21三體綜合征后，以NGS為主的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)因具有安全性好、高通量和特異度高的優(yōu)點(diǎn)在臨床上普及。該方法首先應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體的篩查，利用基于大規(guī)模平行高通量測序技術(shù)檢測母體血漿中cffDNA序列，量化DNA片段，通過生物信息分析，對cffDNA的堿基序列進(jìn)行識別、判斷，據(jù)此計算出源于胎兒目標(biāo)染色體(21/18/13)的cffDNA基因量是否增加，從而推斷胎兒是否患有染色體非整倍體異常。

3.2 胎兒染色體微缺失和微重復(fù) 與染色體非整倍體一樣，染色體亞結(jié)構(gòu)異常(微缺失和微重復(fù))也會導(dǎo)致胎兒的身體或智力發(fā)育嚴(yán)重異常。有研究[10]報道，致病性染色體微缺失和微重復(fù)的發(fā)生率可能接近于唐氏綜合征。此外，在大約6%的B超結(jié)果異常和1.7%的高齡或唐氏綜合征篩查陽性的孕婦中存在染色體微缺失和微重復(fù)，且其發(fā)生率與孕婦年齡無明顯相關(guān)性[11-12]。因此，對所有年齡段孕婦均應(yīng)在產(chǎn)前行胎兒染色體微缺失和微重復(fù)檢測。

隨著無創(chuàng)產(chǎn)前檢查(non-invasive prenatal testing，NIPT)技術(shù)在全球超過60多個國家和地區(qū)臨床工作中的推廣應(yīng)用，以及相關(guān)臨床研究的深入，使其檢測范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。自2013年起，國際知名的NIPT服務(wù)商N(yùn)atera、Sequenom、Illumina等公司陸續(xù)推出針對染色體拷貝數(shù)異常(copy-number variants，CNVs)的檢測服務(wù)，稱為NIPT-Plus技術(shù)。NIPT-Plus技術(shù)在經(jīng)典NIPT技術(shù)基礎(chǔ)上升級測序流程,增加測序深度，同樣依托于傳統(tǒng)的NGS基因測序儀、配套的快速建庫核心技術(shù)和快速分析流程，主要依賴于全基因組低深度測序。

有學(xué)者應(yīng)用NIPT-Plus技術(shù)對94 085名單胎妊娠的婦女進(jìn)行前瞻性臨床樣本研究，成功地檢測出965例染色體非整倍體和163例染色體微缺失微重復(fù)綜合征[13]。該方法實(shí)現(xiàn)了從染色體非整倍體至微缺失和微重復(fù)NIPT的飛躍，可覆蓋90%以上的染色體病，是迄今國際上涵蓋疾病種類最多、檢測精度最高的NIPT方法。值得注意的是，目前臨床上仍缺乏系統(tǒng)解讀CNVs結(jié)果的數(shù)據(jù)庫，NGS技術(shù)應(yīng)用于CNVs的檢測會發(fā)現(xiàn)大量的“臨床意義不明確變異”(variants of uncertain significance，VOUS)結(jié)果，給患者和遺傳咨詢醫(yī)師帶來很多挑戰(zhàn)。

3.3 胎兒單基因病 NGS技術(shù)除了能夠應(yīng)用于產(chǎn)前染色體異常檢測之外，也能進(jìn)行產(chǎn)前單基因遺傳病的檢測。對于常染色體顯性遺傳病，通過檢測孕婦的血漿cffDNA有無攜帶致病位點(diǎn)(父源突變、新發(fā)突變)來判斷胎兒是否發(fā)病[14]；對于常染色體隱性遺傳病也具有提示作用，若父母同時攜帶不同的雜合突變(先證者為復(fù)合雜合突變)，只有在孕婦外周血中檢測到父源突變時，才需進(jìn)一步行侵入性產(chǎn)前診斷，使進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦減少了50%[15]。若父母攜帶相同致病雜合突變，通過大規(guī)模平行測序或數(shù)字PCR技術(shù)等精確定量cffDNA濃度，以此來分辨突變來自父源或母源[16]。除了cffDNA，母體血液循環(huán)中的游離胎兒細(xì)胞[17]和子宮頸黏液中胎兒脫落的絨毛細(xì)胞[18]檢測聯(lián)合NGS技術(shù)已被成功地應(yīng)用于單基因遺傳病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。

目前基于NIPT的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)已成功地應(yīng)用于杜氏肌營養(yǎng)不良癥[19]、脊髓性肌萎縮癥[20]、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥[21]、囊性纖維化[22]、新生兒糖尿病[23]、軟骨發(fā)育不全[14]、苯丙酮尿癥[24]等單基因遺傳病的產(chǎn)前檢測，NIPT檢測單基因遺傳病的應(yīng)用進(jìn)展已有綜述[25]詳細(xì)介紹。

基于cffDNA的高通量測序的NIPT技術(shù)的發(fā)展，正在迅速改變傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷和產(chǎn)前篩查手段，并在臨床試驗中得以證實(shí)。NIPT技術(shù)檢測染色體微重復(fù)和微缺失目前尚存爭議，但美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)仍建議NIPT可作為孕9～10周且BMI<40 kg/m2孕婦檢出21三體、18三體和13三體染色體非整倍體異常胎兒的一線常規(guī)篩查技術(shù)[26]，也可對一些常見的染色體微缺失微重復(fù)綜合征進(jìn)行檢測。然而，該方法作為一種篩查手段存在局限性，高風(fēng)險孕婦須采用經(jīng)典的羊水胎兒細(xì)胞染色體核型分析或者染色體微陣列分析等確診；且因受胎盤嵌合、母體狀況、孕周等因素影響，易產(chǎn)生假陽性和假陰性等異常結(jié)果。

4 NGS技術(shù)在出生后單基因遺傳病診斷中的應(yīng)用

已知的單基因病致病基因和遺傳方式大部分已明確，不受環(huán)境因素的影響。目前，已知的人類單基因遺傳病已超過10 000種[27]，盡管單基因病個體發(fā)病率很低，但人群總發(fā)病率仍較高，約為1/100。大部分單基因病具有致死性、致殘性或致畸性，臨床表現(xiàn)多樣，因此診斷準(zhǔn)確率不高。傳統(tǒng)的單基因遺傳病檢測方法主要為Southern印跡法、Sanger測序，以及以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的各種檢測手段[28-33]。傳統(tǒng)檢測方法的操作步驟復(fù)雜、通量低，不易檢測出未知的突變位點(diǎn)和進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)的基因突變分析。

通過先進(jìn)的NGS技術(shù)可對上千種由于基因變異(基因突變、平衡異位、微缺失等)導(dǎo)致的遺傳病進(jìn)行檢測，且可在早期對胎兒的脫落細(xì)胞或者絨毛膜進(jìn)行檢測，在產(chǎn)前就可確認(rèn)胎兒是否患有遺傳病。目前，NGS技術(shù)應(yīng)用于單基因遺傳病的形式有目標(biāo)序列捕獲高通量測序技術(shù)(Panel)測序、全外顯子組測序、全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序等。

Panel測序通過靶向某一已知疾病的全部致病基因，能夠快速高效地分析給定樣本是否患有該疾病，根據(jù)臨床診斷需要自由設(shè)計Panel，靈活方便，但不能有效地預(yù)測新的致病基因和對未知疾病的致病基因進(jìn)行診斷。當(dāng)Panel測序診斷結(jié)果為陰性，或者臨床表型比較復(fù)雜時，就需要行全外顯子組測序和全基因組測序，以進(jìn)行更大范圍的篩查。全外顯子組測序是指對個體外顯子區(qū)進(jìn)行測序的方法，一般包括22 000個左右的編碼基因[34]，能夠更快地確定致病基因及其突變位點(diǎn)，但不能獲得完整的基因組信息，且不適用于非編碼區(qū)突變和DNA結(jié)構(gòu)變異等檢測。全基因組測序是對某個體基因組的測序，不僅能夠明確患者的基因譜，而且能夠檢測出更多的突變類型，如一些結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異等；但該方法價格昂貴且數(shù)據(jù)量大，導(dǎo)致數(shù)據(jù)儲存和結(jié)果解讀十分困難。全外顯子組測序和全基因組測序應(yīng)用于潛在遺傳病(尚未確診)的分子診斷時，診斷準(zhǔn)確率為25%～52%。通過TRIO測序(患者及其父母共同進(jìn)行測序)，有助于發(fā)現(xiàn)父母不存在，而孩子新發(fā)生的突變(新發(fā)突變)和潛在的隱性遺傳突變[35]。轉(zhuǎn)錄組測序主要是通過對某一物種特定細(xì)胞或組織在某個狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄本和基因序列進(jìn)行測序，以研究基因的表達(dá)情況，從而對非編碼區(qū)功能、結(jié)構(gòu)和新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測等進(jìn)行研究。

5 總 結(jié)

受益于研究的不斷深入和大規(guī)模的應(yīng)用，臨床上二代測序在遺傳病篩查方面的進(jìn)展迅速，新的測序方向如RNA測序數(shù)據(jù)的集成、結(jié)構(gòu)變異(structural variation，SV)研究、現(xiàn)有二代測序檢測層級的選擇和策略優(yōu)化等均迅速開展。然而，NGS技術(shù)對遺傳病的診斷依然存在局限性。首先，對于單基因病的診斷，受制于測序深度等影響，其結(jié)果需經(jīng)Sanger測序等驗證；且NGS技術(shù)不能有效地解決一些特殊的單基因病基因突變(如倒位、假基因等)的檢測問題。其次，對于染色體異常的診斷，NGS技術(shù)不能對拷貝數(shù)無改變的結(jié)構(gòu)異常做出判斷，不能區(qū)分平衡易位攜帶者與正常胚胎；且由于結(jié)構(gòu)的特殊性，NGS技術(shù)不能準(zhǔn)確地判斷著絲粒和端粒區(qū)域的異常。最后，受制于種族差異、數(shù)據(jù)庫和新發(fā)突變功能預(yù)測等因素制約，對一些NGS的結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確詳細(xì)的解讀比較困難。目前，國內(nèi)NGS技術(shù)的發(fā)展面臨區(qū)域發(fā)展存在差異和在基層醫(yī)院開展困難的問題；但不可否認(rèn)的是，未來很多疾病的臨床NGS都可能被納入常規(guī)檢測流程中，而一系列指南的完善和操作流程的建立將進(jìn)一步推動臨床NGS技術(shù)的發(fā)展，從而不斷豐富人類的基因組數(shù)據(jù)庫。