尹相叢，楊頡， 閆麗萍，趙春亭

青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266001

造血微環(huán)境是指骨髓造血細(xì)胞增殖、分化的全部環(huán)境因素，是由基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和造血生長(zhǎng)因子三部分組成的[1]，其共同構(gòu)成了造血細(xì)胞存活所必需的生理結(jié)構(gòu)支架和信號(hào)傳導(dǎo)載體[2]，是造血系統(tǒng)的重要組成部分，具有支持造血細(xì)胞增殖及促使造血細(xì)胞向各個(gè)血細(xì)胞增殖分化的作用。再生障礙性貧血(AA)是由于物理、化學(xué)、生物或其他不明因素作用使骨髓中造血干細(xì)胞(HSC)和骨髓造血微環(huán)境受損，造成骨髓造血功能降低或衰竭，并以全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)的一組綜合征。AA的發(fā)病機(jī)制涉及免疫紊亂、造血微環(huán)境改變等多個(gè)方面。本文對(duì)AA患者造血微環(huán)境的相關(guān)變化作一綜述。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)相關(guān)異常

1.1 細(xì)胞增殖緩慢、數(shù)量減少、特性改變 骨髓基質(zhì)細(xì)胞主要包括BMSCs、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，是造血微環(huán)境的重要成分之一，能夠分泌多種造血調(diào)控因子。BMSCs是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，主要來(lái)源于中胚層，是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞[3]，能夠分泌多種細(xì)胞因子，具有低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)性及支持造血的功能[4]。在一定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞等多種間質(zhì)細(xì)胞[5]。在維持骨髓微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)控HSC的生理功能中發(fā)揮著重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常成人相比，AA患者BMSCs數(shù)量減少、增殖能力降低、生長(zhǎng)緩慢，且促進(jìn)骨髓粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)生長(zhǎng)的作用明顯減弱[7]。BMSCs增殖緩慢、數(shù)量減少、特性改變均與AA嚴(yán)重程度、病程等有關(guān)，BMSCs的上述變化在重型、病程較長(zhǎng)或繼發(fā)于放化療后的AA患者中尤其明顯。

1.2 抑制T淋巴細(xì)胞的作用減弱 正常的BMSCs具有抑制T淋巴細(xì)胞的功能，可為HSC提供免疫保護(hù)環(huán)境。正常人BMSCs可抑制植物血凝素刺激后的T淋巴細(xì)胞增殖，且這種作用會(huì)隨著B(niǎo)MSCs數(shù)量的增加而增強(qiáng)。AA患者BMSCs在細(xì)胞形態(tài)和免疫表型上與正常人沒(méi)有明顯差異，但其BMSCs對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制作用較正常人減弱[8]。BMSCs能夠使T淋巴細(xì)胞停留在G0或G1期，從而抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，并使CD25、CD69等T淋巴細(xì)胞早期活化表型的表達(dá)下降，抑制IL-2、IFN-γ分泌，而AA患者的BMSCs缺乏這種免疫抑制作用。Bacigalupo等[9]也發(fā)現(xiàn)，重型AA患者的BMSCs在抑制T淋巴細(xì)胞生成、增殖方面存在不足，且不能通過(guò)免疫治療得到糾正，但經(jīng)HSC移植后可恢復(fù)正常。BMSCs對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制作用減弱會(huì)影響骨髓局部的免疫調(diào)節(jié)，從而影響骨髓正常造血。

1.3 成脂性增強(qiáng) 正常情況下BMSCs成脂和成骨分化處于動(dòng)態(tài)平衡，而AA患者BMSCs成脂及成骨分化發(fā)生失衡[10,11]，AA患者骨髓中正常造血組織減少并被脂肪組織取代。研究發(fā)現(xiàn)，AA患者BMSCs向脂肪細(xì)胞分化的能力增強(qiáng)，形成脂滴時(shí)間早、數(shù)量多、體積大；且在誘導(dǎo)BMSCs形成脂肪細(xì)胞的過(guò)程中，早期脂蛋白酯酶基因表達(dá)明顯升高。在正常人的脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)體系中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)可促進(jìn) BMSCs增殖，并抑制其成脂分化。而AA患者BMSCs的易成脂性可能與TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)通路出現(xiàn)異常，TGF-β1及其下游第1個(gè)分子信號(hào)Smad3表達(dá)下調(diào)有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，AA患者BMSCs脂肪化能力明顯增強(qiáng)[12]，且脂聯(lián)素、FABP基因及蛋白表達(dá)顯著升高[13]。AA患者BMSCs成脂性增強(qiáng)導(dǎo)致成骨細(xì)胞減少，而成骨細(xì)胞也被證實(shí)參與了對(duì)HSC早期分化調(diào)控的介導(dǎo)，是骨髓造血微環(huán)境中重要細(xì)胞成分之一，在HSC發(fā)育、增殖、分化及成熟過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[14]。成骨細(xì)胞數(shù)量減少將影響骨髓HSC的增殖和分化，也可直接影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞間的相互作用，導(dǎo)致造血微環(huán)境異常。另外有研究表明，骨髓脂肪細(xì)胞可過(guò)度分泌瘦素等細(xì)胞因子，而且AA患者HSC對(duì)干細(xì)胞因子(SCF)的反應(yīng)性降低并且其瘦素受體不完整，均破壞了瘦素與SCF刺激HSC增殖的協(xié)同效應(yīng)，可能進(jìn)一步導(dǎo)致AA患者瘦素水平增高及HSC數(shù)量減少。因此，BMSCs成脂性增強(qiáng)導(dǎo)致造血微環(huán)境改變可能是AA患者骨髓功能減弱的原因之一。

1.4 細(xì)胞凋亡增加 研究表明，AA患者BMSCs凋亡率明顯升高，導(dǎo)致BMSCs數(shù)量減少，同時(shí)也對(duì)HSC產(chǎn)生影響[15]。通過(guò)基因芯片分析骨髓BMSCs結(jié)果顯示，AA患者大量與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、造血發(fā)生及免疫應(yīng)答等相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生明顯改變，也進(jìn)一步證實(shí)了AA患者BMSCs的生物學(xué)特性發(fā)生異常[16]。

2 細(xì)胞外基質(zhì)改變

AA患者最主要的骨髓病理表現(xiàn)是造血細(xì)胞減少、脂肪細(xì)胞增多，同時(shí)伴有骨髓基質(zhì)細(xì)胞萎縮、成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)減少、靜脈竇壁水腫、毛細(xì)血管壞死等現(xiàn)象，其中急性AA較慢性AA更明顯。而骨髓基質(zhì)細(xì)胞受損的患者行HSC移植的成功率比較低，也提示造血微環(huán)境缺陷在AA發(fā)病中具有重要作用。

AA患者骨髓微環(huán)境中存在微血管破壞和血管新生減少[17]。Füredre等[18]應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)AA患者骨髓中微血管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)初診AA患者骨髓微血管密度及VEGF表達(dá)均明顯低于正常人群，而治療有效后的AA患者兩者水平明顯提高。VEGF是對(duì)血管生成和造血具有重要作用的因子之一。AA患者VEGF表達(dá)降低可減少骨髓血管生成，引起骨髓局部氧供和血供均降低，從而使造血組織萎縮，骨髓出現(xiàn)脂肪化，導(dǎo)致正常的造血功能受到抑制。VEGF可通過(guò)內(nèi)在的自分泌環(huán)調(diào)節(jié)和維持HSC生存和增殖，VEGF表達(dá)過(guò)低可直接影響HSC增殖、發(fā)育和分化，從而影響造血功能。因此，VEGF表達(dá)降低可能與AA的發(fā)生、進(jìn)展及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。國(guó)內(nèi)還有研究發(fā)現(xiàn)，AA患者骨髓源血管緊張素Ⅱ水平低于正常人群，推測(cè)骨髓血管緊張素Ⅱ水平降低也可能是AA患者造血微環(huán)境改變的重要因素之一。

AA患者血管細(xì)胞黏附分子1及細(xì)胞間黏附分子1等基因表達(dá)增高，而整合素1與整合素133等基因表達(dá)下降，說(shuō)明AA患者骨髓微環(huán)境中HSC與基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分間的黏附相互作用被破壞，導(dǎo)致HSC過(guò)早凋亡。另外TGF-β1參與了免疫調(diào)控及造血調(diào)控，可能也與AA的發(fā)病有關(guān)。TGF-β1是由Th3細(xì)胞分泌的，對(duì)免疫應(yīng)答發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，重型AA患者血漿TGF-β1水平明顯下降，且與Th3細(xì)胞比例及血小板數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明Th3細(xì)胞及其分泌TGF-β1水平可反映重型AA患者的病情。TGF-β1減少可能減弱了自身免疫耐受，使T淋巴細(xì)胞針對(duì)自身骨髓的免疫破壞功能亢進(jìn)。

3 HSC相關(guān)異常

HSC是由胚胎干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的各類(lèi)血細(xì)胞的祖源細(xì)胞，能夠自我更新、自我復(fù)制，且有較強(qiáng)的多向分化能力。AA患者的HSC異常已得到公認(rèn)[19]。AA患者應(yīng)用免疫抑制治療后有效率可達(dá)70%～80%，但仍有一部分患者存在緩解率低、造血功能恢復(fù)不理想和復(fù)發(fā)等問(wèn)題，而HSC移植成功后患者骨髓造血功能恢復(fù)，也表明其骨髓可能存在HSC數(shù)量及功能異常。

3.1 HSC細(xì)胞數(shù)量減少 HSC又被稱(chēng)為多能干細(xì)胞，CD34+是其特異性標(biāo)志，AA患者骨髓中的CD34+細(xì)胞比例明顯低于正常人，且其降低程度與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系；同時(shí)AA患者骨髓啟動(dòng)細(xì)胞(LTC-IC)數(shù)量明顯減少甚至缺乏，CFU-GM和紅細(xì)胞集落形成單位(CFU-E)形成能力降低。AA患者HSC異常主要是HSC數(shù)量減少造成的，尤其是表達(dá)CD34+、CD38-的早期HPC數(shù)量明顯減少甚至缺乏。研究證實(shí)，AA患者骨髓中不僅HSC數(shù)量降低，而且集落形成細(xì)胞或經(jīng)原始細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的純化CD34+細(xì)胞比例也低于正常人群[20]。Fischer等[21]研究發(fā)現(xiàn)，兒童AA患者骨髓CD34+細(xì)胞比例也明顯降低，而CD34+細(xì)胞表面相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)表達(dá)增加。CD34+主要表達(dá)于早期造血干細(xì)胞，在其黏附和歸巢過(guò)程中具有重要作用。因此，檢測(cè)骨髓中CD34+細(xì)胞的表達(dá)水平已成為診斷AA的方法之一，也可以初步評(píng)估AA患者的嚴(yán)重程度，并有助于治療方法的選擇以及預(yù)后判斷。CD34+細(xì)胞極度降低的患者往往免疫抑制治療效果不理想，可能與未從根本上糾正干細(xì)胞的內(nèi)在缺陷有關(guān)。但是經(jīng)同基因HSC移植成功后，患者的造血功能可得到恢復(fù)，也提示了AA患者存在HSC數(shù)量及功能異常。因此，臨床上應(yīng)用HSC移植和抗胸腺細(xì)胞球蛋白聯(lián)合環(huán)孢菌素A和雄激素治療AA的效果較好[22,23]。

3.2 HSC細(xì)胞功能異常 AA患者不僅存在HSC數(shù)量降低，還存在細(xì)胞功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，將AA患者CD34+細(xì)胞置于正常人的髓基質(zhì)中培養(yǎng)，可出現(xiàn)集落生成障礙；反之，將正常人CD34+細(xì)胞置于AA患者的骨髓基質(zhì)中培養(yǎng)，集落生成則無(wú)顯著差異；這表明AA患者的HSC可能存在功能缺陷或異常。臨床上部分AA患者經(jīng)正常人HSC進(jìn)行骨髓移植治療后取得良好效果，也證明了AA患者HSC存在功能異?；蛉毕荨Ｑ芯孔C實(shí)，雖然AA患者的骨髓造血功能衰退，但其體內(nèi)大部分造血生長(zhǎng)因子水平與正常人相比并沒(méi)有明顯變化。由此推測(cè)，HSC對(duì)造血生長(zhǎng)因子的反應(yīng)性降低甚至無(wú)反應(yīng)，可能是由于受體分布、功能、胞內(nèi)合成及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等因素異常而導(dǎo)致的，最終影響患者的骨髓造血功能。

3.3 HSC細(xì)胞凋亡增加 細(xì)胞凋亡異常是HSC損傷的重要機(jī)制之一，AA患者骨髓HSC細(xì)胞CD34+細(xì)胞上死亡或凋亡的相關(guān)基因及造血負(fù)調(diào)控因子表達(dá)明顯升高。AA患者HSC凋亡增加與造血生長(zhǎng)因子減少、促凋亡細(xì)胞因子增多、凋亡相關(guān)分子表達(dá)增加等因素有關(guān)。造血負(fù)調(diào)控因子可通過(guò)一些信號(hào)途徑參與誘導(dǎo)HSC凋亡，而Fas和Fas配體(FasL)是一對(duì)促凋亡基因，其中Fas(Apo-1/CD95)蛋白屬于TNF和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體成員之一，F(xiàn)asL屬于TNF家族成員。AA患者IFN-γ和TNF-β等造血負(fù)調(diào)控因子表達(dá)升高，可上調(diào)CD34+細(xì)胞上的Fas抗原表達(dá)；同時(shí)使其對(duì)Fas/FasL途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性增加，通過(guò)Fas/FasL途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，使凋亡細(xì)胞比例增加[24]。

研究表明，NO也可能參與了AA患者HSC異常凋亡，IFN-γ、TNF-α和IL-1等可誘導(dǎo)NO合酶的合成，NO生成增加，導(dǎo)致HSC的DNA損傷，從而引起細(xì)胞凋亡增加[25]。IL-1B也可通過(guò)IL-1B轉(zhuǎn)化酶途徑促進(jìn)HSC凋亡，而CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用可導(dǎo)致HSC的直接損傷。最近有研究顯示，正常CD34+細(xì)胞的存活與自噬密切相關(guān)，而AA患者CD34+細(xì)胞的自噬能力受損，導(dǎo)致CD34+細(xì)胞的分化和增殖減少，而對(duì)凋亡的敏感性增加[26]。因此，自噬可能在AA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

4 基因改變

4.1 人白細(xì)胞抗原(HLA)基因多態(tài)性 HLA是由200多個(gè)基因座位組成的基因復(fù)合體，其編碼的基因位于第6號(hào)染色體短臂上6p21.3，全長(zhǎng)4 000 kb。HLA與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答有關(guān)，在目前已知基因中HLA等位基因的多態(tài)性最高。國(guó)內(nèi)外報(bào)道均顯示，HLA等位基因多態(tài)性與AA發(fā)病易感性有關(guān)[27]。某些HLA表型在AA患者中的比例較高，呈連鎖不平衡，HLA-DR2陽(yáng)性可作為AA患者免疫抑制治療的預(yù)測(cè)指標(biāo)[28]。通過(guò)對(duì)AA患者的HLAⅡ類(lèi)抗原進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A依賴(lài)者具有共同的HLAⅡ類(lèi)單體型DRB1*1501、DQA1*0102、DQB1* 0602，且其第2外顯子無(wú)核苷酸序列多態(tài)性，而對(duì)環(huán)孢素A治療有效但不依賴(lài)者則不具備這些分型特征[29]。HLA-DRB1*150是HLA-DR2的主要亞型，很可能是AA的易感基因之一。Taj等[30]研究發(fā)現(xiàn)，AA患者的 HLA-B5基因頻率明顯高于正常人。Akram等[31]發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1*15和DQB1*06與巴基斯坦人群AA發(fā)病密切相關(guān)。而Wang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)北方漢族人群中，HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1等位基因多態(tài)性與AA的發(fā)病有關(guān)。HLA-B*1302、HLA-B*3501、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0901和 HLA-DQB1*0202可能是AA的易感基因 ，而HLA-A*3303和HLA-DQB1*0302可能是AA的保護(hù)基因。以上研究結(jié)果均提示，HLA-DR基因的某些亞型可能是導(dǎo)致AA發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

4.2 端粒酶改變 端粒是由DNA及其相關(guān)蛋白組成的富含G的DNA重復(fù)序列，存在于真核細(xì)胞染色體末端，能夠保護(hù)染色體末端不被降解、融合和重組，具有保證染色體完整性的作用。端粒的長(zhǎng)度決定了細(xì)胞的復(fù)制潛能，體細(xì)胞每分裂1次，端粒就會(huì)縮短50～200 bp，當(dāng)端?？s短到一定程度就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制的停止，細(xì)胞會(huì)因?yàn)閱适?fù)制能力而停滯在細(xì)胞生長(zhǎng)周期的某個(gè)階段，最終進(jìn)入凋亡程序[33]。端粒的長(zhǎng)度需要端粒酶的維持，端粒酶是一種核酸蛋白酶，具有延長(zhǎng)端粒末端的作用。端粒酶是以其內(nèi)源性RNA為模板，添加序列到端粒末端，以維持端粒長(zhǎng)度，并保持其結(jié)構(gòu)完整。人類(lèi)端粒酶主要組分包括端粒酶RNA組分(TERC)、端粒酶相關(guān)蛋白(TEP)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)3種。

骨髓衰竭尤其是遺傳性的骨髓衰竭可能與端粒酶缺陷有關(guān)，部分獲得性AA患者也存在端?？s短的現(xiàn)象[34]。近年來(lái)有關(guān)端粒縮短及端粒酶基因突變與AA之間的關(guān)系也是AA發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。Han等[35]對(duì)AA患者粒細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與同年齡段正常人相比，AA患者端粒長(zhǎng)度明顯縮短，推測(cè)可能與HSC造血功能缺陷有關(guān)。Shallis等[36]對(duì)AA患者TERT基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其編碼端粒酶RNA成分的TERT基因雜合性突變率高于正常對(duì)照組，端粒酶活性減低，該基因突變可能是導(dǎo)致AA發(fā)生的危險(xiǎn)因素。Wang等[36]研究也發(fā)現(xiàn)，AA患者HSC的端粒保護(hù)蛋白表達(dá)明顯降低，TERC和TERT基因發(fā)生突變，而且這些改變與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。Cui等[37]研究發(fā)現(xiàn)，AA患者線粒體基因突變和端粒長(zhǎng)度改變存在相關(guān)性，且兩者與骨髓造血功能衰竭均密切相關(guān)。端粒縮短是由于線粒體DNA受損，其功能受到影響所致，進(jìn)而可影響細(xì)胞的分裂復(fù)制，最終引起骨髓造血功能衰竭。因此，端粒酶相關(guān)基因突變和端?？s短均可能與AA易感性有關(guān)。

4.3 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因缺乏 GST是一種能夠?qū)φT導(dǎo)機(jī)體突變物質(zhì)解毒的親電子復(fù)合物，參與機(jī)體中毒物和一些致畸物，如苯及其衍生物等代謝。GSTT1缺乏可導(dǎo)致機(jī)體喪失對(duì)外界有毒物質(zhì)或致癌物質(zhì)的代謝作用，對(duì)致畸變物轉(zhuǎn)化能力下降，導(dǎo)致個(gè)體易于發(fā)生骨髓衰竭。Rehman等[38]對(duì)巴基斯坦137例AA患者和220例正常對(duì)照組進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，AA患者GSTM1基因缺陷比例高于正常對(duì)照組。因此，GSTT1缺乏或者GSTT1和GSTM1同時(shí)缺乏的個(gè)體罹患AA的風(fēng)險(xiǎn)更高。該研究GSTT1基因缺乏的AA患者中，部分在確診時(shí)即發(fā)現(xiàn)伴有染色體異常；這提示GSTT1基因缺乏人群可能由于外界有毒物質(zhì)而導(dǎo)致其染色體畸變和不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致AA易感性升高。

綜上所述，AA患者造血微環(huán)境中存在BMSCs增殖緩慢、數(shù)量減少、特性改變、抑制T淋巴細(xì)胞的作用減弱、成脂性增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞外基質(zhì)改變，HSC細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡增加、功能異常，HLA基因多態(tài)性、端粒酶改變、GST基因缺乏等基因改變。造血微環(huán)境對(duì)骨髓造血細(xì)胞起支持誘導(dǎo)作用，其中的各個(gè)成分參與AA的免疫病理過(guò)程，與AA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)AA造血微環(huán)境的研究有助于揭示其病理機(jī)制、指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后。