于 翔

（義縣畜牧獸醫(yī)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 義縣 121100）

牛鉤端螺旋體病，簡(jiǎn)稱(chēng)勾體病，是由病原性鉤端螺旋體引起的人畜共患病和自然疫源性傳染病。其主要病理特征：急性為暫短的發(fā)熱、黃疸和血紅素尿；亞急性和慢性為進(jìn)行性消瘦、貧血、流產(chǎn)和皮膚壞死等。本病在全世界都有分布，幾乎所有的溫血?jiǎng)游锒伎筛腥?，家畜中的牛感染率較高。因病原體的血清群和血清型較多又十分復(fù)雜，臨床癥狀和病理變化也是多種多樣，所以依據(jù)臨床癥狀和病毒剖檢難于確診，確診需進(jìn)行血清學(xué)檢驗(yàn)。發(fā)病初期的病牛血清中含有特異性抗體，采用已知抗原檢查對(duì)此血清中的抗體進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)于早期的病牛診斷極有價(jià)值。

1 凝集溶解定性實(shí)驗(yàn)

1.1 材料準(zhǔn)備

抗原為本菌多個(gè)（14～19個(gè)）血清群的標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別培養(yǎng)孵育5～7 d的生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)物，每暗視野含菌體＞50條（400倍），運(yùn)動(dòng)活潑而且無(wú)自凝現(xiàn)象，便可用作抗原。被檢血清按常規(guī)辦法分離的新鮮血清。

1.2 操作程序

將被檢血清以生理鹽水作1∶25稀釋?zhuān)又劣袡C(jī)玻璃板的小孔中，每孔加0.1 mL，然后各孔內(nèi)分別再加標(biāo)準(zhǔn)抗原各0.1 mL。搖勻，置28～30℃溫箱內(nèi)作用3～4 h。由每孔取1滴混合液置玻片上，覆蓋蓋玻片。在150～200倍暗視野顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)生理鹽水+抗原的系列對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

在抗原對(duì)照（用生理鹽水代替被檢血清）無(wú)誤的情況下，被檢血清出現(xiàn)凝溶反應(yīng)的一孔，即為被檢血清含有與該孔的抗原相應(yīng)的抗體，判為陽(yáng)性。

2 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

患鉤體病的病牛，其補(bǔ)體結(jié)合性抗體，于病后第3天可出現(xiàn)，第4周達(dá)到最高峰，抗體可持續(xù)1年，故可用于診斷。本試驗(yàn)操作方法同于常規(guī)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。但所用抗原是多種株型的混合抗原，雖然具有屬特異性，但不能準(zhǔn)確定型，一般多用于流行病學(xué)調(diào)查。被檢血清效價(jià)＞1∶20才有診斷意義。當(dāng)恢復(fù)血清效價(jià)比急性期增高＞4倍時(shí)，具有診斷價(jià)值。

3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)

本方法檢出率高達(dá)90%，具有早期診斷的優(yōu)點(diǎn)。首先根據(jù)各地流行的主要菌型制備抗原片，一般用培養(yǎng)5～7 d生長(zhǎng)良好的菌液涂片、干燥、火焰固定后，再將用PBS自1∶50、1∶100、1∶200、至1∶400等倍比稀釋的4個(gè)稀釋度滅活被檢血清分別滴于抗原涂片處。置37℃濕盒內(nèi)作用30 min，用pH 7.4 PBS沖洗剩余血清，干后滴加異硫氰酸熒光黃標(biāo)記的抗體染色30 min，再用PBS沖去游離染色經(jīng)鏡檢，如鉤體呈明亮的淡綠色熒光則為陽(yáng)性。效價(jià)≥1∶100或雙份血清效價(jià)增4倍則具有診斷依據(jù)。

4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

本法特異、敏感，其具體做法是：先將鉤體抗體與抗抗體分別按ELISA一般方法提取球蛋白，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，然后按下列方法進(jìn)行染色檢查。

4.1 直接染色法

先將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鉤體抗體球蛋白制劑用生理鹽水作1∶10稀釋后，直接加于用福爾馬林固定的鉤體涂片，置37℃溫盒中染色30～50 min，水洗兩次（約5～10 min）空氣中干燥后，用聯(lián)苯胺試劑顯影（5%乙二胺四乙酸1 mL，飽和氯化銨1 mL，飽和聯(lián)苯胺溶液9 mL及3%過(guò)氧化氫溶液1滴）4～5 min，水洗，加甘油緩沖液，鏡檢。

4.2 間接染色法

取福爾馬林固定的鉤體涂片，先加被檢血清，即相應(yīng)菌型抗體（效價(jià)1∶1 000），置37℃濕盒中染色30～50 min，水洗兩次后，再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體染色30～50 min，洗滌干燥后用聯(lián)苯胺試劑顯影，水洗，加甘油緩沖液，鏡檢。

上述兩種染色法，可見(jiàn)鉤體均呈棕黃色，即可判定為陽(yáng)性。

5 間接紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)

病牛血凝抗體出現(xiàn)較早，具有早期診斷意義。其實(shí)驗(yàn)方法和一般間接血凝實(shí)驗(yàn)相同。首先提取鉤體致敏物質(zhì)，制備醛化致敏紅細(xì)胞。然后按下述方法進(jìn)行試驗(yàn)：血清處理，將被檢血清0.1 mL加2.5%正常綿羊紅細(xì)胞液0.4 mL混勻置于37℃水浴中1 h，但要經(jīng)常搖動(dòng)，以吸收正常凝集素。離心沉淀后，再取其上清液即1∶5倍稀釋的血清，用生理鹽水按倍比稀釋成1∶20～1∶640，每個(gè)稀釋度各取0.8 mL，分別加入兩孔（一孔對(duì)照），在試驗(yàn)孔內(nèi)各加2.5%致敏紅細(xì)胞懸液1滴，而對(duì)照孔內(nèi)則加2.5%正常綿羊紅細(xì)胞1滴，充分搖勻，置于室溫或37℃溫箱內(nèi)2 h觀察結(jié)果。結(jié)果判定：以試驗(yàn)組紅細(xì)胞有引起“++”凝集的最高血清稀釋度作為抗體效價(jià)。效價(jià)＞1∶160，或雙份血清效價(jià)增高4倍以上，可作為臨床診斷依據(jù)。

6 炭抗原凝集實(shí)驗(yàn)

按一般炭凝集實(shí)驗(yàn)方法，先將鉤端螺旋體超聲粉碎制成炭抗原，然后將被檢血清56℃30 min滅活后，用1%正常兔血清鹽水稀釋成1∶2～1∶64。各取1滴于玻璃板上。再加炭抗原1滴，搖勻后，于22～37℃靜置10 min。結(jié)果判定：能引起“++”凝集最高稀釋度為效價(jià)終點(diǎn)。＞1∶4或雙份血清增高＞4倍，判為陽(yáng)性，但應(yīng)注意非特異性反應(yīng)。