余春林 楊禮 陳家磊 胡陳明 彭涵 邱莫寒 虎彪 楊朝武

1.四川省畜牧科學研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室 610066

2.四川大恒家禽育種有限公司 610066

3.四川省正鑫農業(yè)科技有限公司 610400

雞沙門氏菌、大腸桿菌和多殺性巴氏桿菌是危害雞群健康的常見細菌性病原，在我國各個代次雞群中普遍存在，嚴重危害產業(yè)健康發(fā)展。多重PCR法已廣泛用于病原菌的同時檢測和鑒定，具有高效性、系統(tǒng)性、經濟性和簡便性。

林下養(yǎng)殖是充分利用林地資源，兼顧生態(tài)與經濟效益的生產方式，在動物福利、生產性能、蛋肉風味、營養(yǎng)價值、植被保護等方面具有一定的優(yōu)勢。放牧及植物、土壤的攝取使雞更頻繁地暴露于環(huán)境污染物和病原體中，因此具有更高的食品安全和疾病感染風險[3]。本研究建立了一種能快速檢測禽沙門氏菌、大腸桿菌和多殺氏巴氏桿菌的多重PCR方法，并應用于林下養(yǎng)殖環(huán)境中細菌性病原感染情況調查。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集 采用五點法采集無污染荒坡0-5cm土層5-10g，研磨過篩、高溫滅菌后，-80℃保存?zhèn)溆?。臨床樣本采用同樣的方法采集，不經滅菌直接保存。

1.2 菌株 標準品沙門氏菌CVCC504、腸出血性大腸桿菌CVCC245、A型巴氏桿菌、腸毒性大腸桿菌CVCC196、鴨疫里默氏菌均為動物遺傳育種四川省重點實驗室保存。

1.3 引物設計 根據(jù)Genebank中登錄的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌（rfb E基因）和A型多殺巴氏桿菌序列設計引物（表1）。

表1 引物信息

1.4 細菌DNA提取 將3種標準品菌液等量混合，分為兩份，其中一份經72℃水浴15min制成死菌懸液。參考何偉等[4]研究，將3種標準品菌液、活菌懸液和死菌懸液分別按105cfu/g加入5份滅菌土壤中混勻。采用土壤DNA分離試劑盒提取DNA，經質量濃度測定后稀釋至50ng/ml。鴨疫里默氏菌和腸毒性大腸桿菌標準品采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取細菌DNA。

1.5 PCR擴增 單重PCR采用25ul反應體系，包括DNA模板1ul，上下游引物各1uL，2×PCRmix 18ul，ddH2O 4uL。采用50ul體系對多重PCR的引物濃度、退火溫度、反應程序等進行優(yōu)化。

擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6 方法驗證 以1.4中提取的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌和A型巴氏桿菌DNA混合液為模板，同時以鴨疫里默氏菌DNA、腸毒性大腸桿菌CVCC196 DNA、ddH2O為模板，經多重PCR擴增后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行特異性檢測檢測，并重復3次以檢測結果的可靠性。靈敏度檢測包括10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等5個梯度。以活菌懸液和死菌懸液DNA為模板進行死菌和活菌鑒別。

1.7 多重PCR對臨床樣品的檢測 樣本來源于38個放養(yǎng)場，樣本采集方法見1.1.1，并通過問詢記錄各場存欄品種、日齡、消毒方法等信息。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌DNA提取 經檢測OD260/OD280比值均在1.8-2.0之間，可以用于后續(xù)PCR檢測。

2.2 PCR方法的建立 3種標準品分別與土壤混合后提取的DNA，經單重PCR擴增，均能得到288bp、495bp和1044bp的特異性條帶。經優(yōu)化，多重PCR反應采用50ul反應體系，包括：DNA模板2ul，10umol/L上下游引物各2uL，2×PCRmix 36ul。最佳反應程序為：94℃預變性5min；加入引物P1，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，5個循環(huán)；加入引物P2，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，5個循環(huán)；加入引物P3，40個循環(huán)；72℃延伸10min。

2.3 方法驗證 特異性檢測結果發(fā)現(xiàn)僅活菌懸液能出現(xiàn)288bp、495bp和1044bp條帶，其他工作液不能擴增出特異性條帶；3次重復結果一致。DNA測序結果與Gen Bank中序列完全一致。說明該方法能特異性檢測出沙門氏菌、A型巴氏桿菌和腸出血性大腸桿菌，能區(qū)分樣品中的死菌與活菌。靈敏度分析顯示5個稀釋度的標準品混合液均能檢出特異性條帶。

2.4 對臨床樣品的檢測 基于上述建立的方法，對采集的38份土壤樣本的細菌性病原感染情況進行調查，結果顯示所有樣本均未檢出A型巴氏桿菌；腸毒性大腸桿菌和沙門氏菌陽性率分別為68.42%和89.47%；混合感染率為36.84%。不同品種、不同日齡雞群均有檢測到不同細菌性病原感染。

3 討論

多重PCR是針對待測病原設計特異性引物，在同一體系內反應并同時檢測出多種病原，能極大減少試劑、人工、時間成本，在疾病的及時確診方面具有優(yōu)勢。本研究中擴增特異性分析顯示該方法能有效擴增出沙門氏菌、A型巴氏桿菌和腸出血性大腸桿菌，而作為對照的鴨疫里默氏菌、腸毒性大腸桿菌不能檢出；試驗中設置的5個稀釋梯度的標準品混合液均能檢出特異性條帶，具有較高的靈敏性，能滿足臨床檢測的需要；死菌懸液不能檢出特異性條帶，能有效區(qū)分土壤樣本中的活菌和死菌；3次重復性試驗結果一致性為100%，具有較好的重復性。

雞沙門氏菌、大腸桿菌是長期存在于雞群的腸道病原菌，多殺性巴氏桿菌主要引起呼吸道癥狀。放養(yǎng)雞生產水平低下，環(huán)境可控性差，疾病防控壓力巨大。據(jù)報道四川7個地區(qū)養(yǎng)雞場雞沙門氏菌感染的場陽性率達50%[5]。本研究中所有場樣本均檢出1-2種病原感染，其中沙門氏菌和大腸桿菌感染以及混感情況嚴重；所有樣本均未檢出多殺性巴氏桿菌，可能與其流行病學特征有關。不同品種、不同日齡雞群均存在感染，提示各放養(yǎng)場均存在不同程度的生物安全漏洞，應從引種、飼養(yǎng)管理等多方面入手。