胡嘉影 陳雨萍 羅志飛 蔡仁桑 馬夢(mèng)晨 黃幼生* 陳夢(mèng)柚

蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一，在組織學(xué)、病理學(xué)等研究方面使用非常廣泛[1]。早期胃癌是指癌組織限于胃黏膜層及黏膜下層，不論其范圍大小和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，多見(jiàn)于中老年人，早期胃癌患者經(jīng)過(guò)有效治療后5年生存率達(dá)90%以上[2]。HE染色活檢組織病理學(xué)檢查是診斷早期胃癌的主要手段，近年來(lái)隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展，利用計(jì)算機(jī)輔助數(shù)字病理的過(guò)程中，將顯微鏡下觀(guān)察到的圖像通過(guò)電腦掃描制作成數(shù)字病理圖像，能夠極大提高診斷效率和準(zhǔn)確性[3]。

醫(yī)學(xué)圖像分割是醫(yī)學(xué)圖像處理與分析領(lǐng)域的復(fù)雜而關(guān)鍵的步驟，其目的是分割和提取醫(yī)學(xué)圖像中具有特殊含義的相關(guān)特征，為臨床診療和病理學(xué)研究提供可靠的依據(jù)。本研究利用訓(xùn)練邏輯回歸(logistic regression，LR)、支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)和樸素貝葉斯(naive Bayes，NB)3個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)算法分類(lèi)器對(duì)像素點(diǎn)進(jìn)行癌巢區(qū)域和間質(zhì)區(qū)域進(jìn)行區(qū)分，對(duì)比癌巢分割效果，選擇效果最佳的分類(lèi)算法觀(guān)察其圖像組織學(xué)分級(jí)效果。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選用2018年1月至2019年12月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科的420幅原始HE染色胃癌組織病理圖，其中黏膜內(nèi)癌[cT1a(M)]185幅，黏膜下癌[cT1b(SM)]235幅。使用Matlab7.0軟件對(duì)病理圖像進(jìn)行灰度化、去噪、增強(qiáng)對(duì)比度、特征提取及圖像分割等處理。

1.2 儀器設(shè)備

采用數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)(廈門(mén)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，閩械注準(zhǔn)20162220080)。

1.3 采集圖像

將收集的420幅病理切片均運(yùn)用數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)字化掃描(20倍物鏡)形成數(shù)字化病理切片，并制作成TIFF格式圖像集，其分辨率為1024×1360。

1.4 圖像處理方法

1.4.1 癌巢分割

對(duì)原始的HE染色胃癌組織病理圖像進(jìn)行預(yù)處理，包括灰度化、去噪和對(duì)比度增強(qiáng)。

(1)灰度化。根據(jù)重要性及其他指標(biāo)，將紅、綠、藍(lán)(Red，Green，Blue，RGB)3個(gè)分量以不同的權(quán)值進(jìn)行加權(quán)平均。由于人眼對(duì)綠色敏感最高，對(duì)藍(lán)色敏感最低，因此，對(duì)RGB的3個(gè)分量進(jìn)行加權(quán)平均得到較合理的灰度圖像，其轉(zhuǎn)換算法為公式1：

式中L為灰度值；R為紅色分量；G為綠色分量；B為藍(lán)色分量。

(2)去噪。為消除圖像中的噪聲并對(duì)圖像平滑化，選擇3×3模板掃描圖像中的每一個(gè)像素，用模板確定的鄰域內(nèi)像素的加權(quán)平均值替代模板中心像素點(diǎn)的值。

(3)對(duì)比度調(diào)整。將給定圖像的直方圖分布改變成“均勻”分布直方圖分布。根據(jù)圖像灰度計(jì)算概率密度函數(shù)(probability density function，PDF)；計(jì)算累積概率分布函數(shù)的累積分布函數(shù)(cumulative distribution function，CDF)；將CDF歸一化到原圖灰度取值范圍，如[0,255](灰度圖像像素值的取值范圍為[0,255])之后CDF四舍五入取整，得到灰度轉(zhuǎn)換函數(shù)，其算法為公式2：

式中sk為目標(biāo)圖像灰度值；T為輸入灰度級(jí)和輸出灰度級(jí)之前的映射關(guān)系；rk為原始圖像灰度值；將CDF作為轉(zhuǎn)換函數(shù)，將灰度為rkrk的點(diǎn)轉(zhuǎn)換為sksk灰度。

1.4.2 特征提取

(1)顏色特征提取。將顏色空間RGB模型轉(zhuǎn)化成六角錐體(Hue，Saturation，Value，HSV)模型，RGB轉(zhuǎn)換到HSV的算法：

(2)紋理特征提取。應(yīng)用局部二進(jìn)制模式(local binary pattern，LBP)算子的過(guò)程類(lèi)似于濾波過(guò)程中的模板操作，逐行掃描圖像，對(duì)于圖像中的每一個(gè)像素點(diǎn)，以該點(diǎn)的灰度作為閾值，對(duì)周?chē)?×3的8鄰域進(jìn)行二值化，按照一定的順序?qū)⒍祷慕Y(jié)果組成一個(gè)8位二進(jìn)制數(shù)，以此二進(jìn)制數(shù)的值(0～255)作為該點(diǎn)的響應(yīng)。3×3區(qū)域的中心點(diǎn)，以其灰度值68作為閾值，對(duì)其8鄰域進(jìn)行二值化，并且從左上點(diǎn)開(kāi)始按照順時(shí)針?lè)较?具體的順序可以任意，只要統(tǒng)一即可)將二值化的結(jié)果組成一個(gè)二進(jìn)制數(shù)10 001 011，即十進(jìn)制的139，作為中心點(diǎn)的響應(yīng)。局部二進(jìn)制模式算子見(jiàn)圖1。

圖1 局部二進(jìn)制模式算子示意圖

1.4.3 細(xì)胞核分割

先對(duì)HE染色的早期胃癌組織病理圖像進(jìn)行主成分分析，得到含有蘇木精顏色信息的灰度圖像后進(jìn)行形態(tài)學(xué)預(yù)處理，得到較好的細(xì)胞核輪廓，運(yùn)用快速?gòu)较驅(qū)ΨQ(chēng)變換提取種子點(diǎn)，將種子點(diǎn)標(biāo)記在原圖中，進(jìn)行后景標(biāo)記后完成預(yù)分割，得到初始輪廓；進(jìn)行曲線(xiàn)演化得到最終輪廓。分割算法步驟為：原始圖像→提取蘇木精染色通道的灰度圖→形態(tài)學(xué)操作→圖像預(yù)處理→快速?gòu)较驅(qū)ΨQ(chēng)變換→前景、后景標(biāo)記→分水嶺變換→分水嶺分割線(xiàn)→主動(dòng)輪廓模型→細(xì)胞核區(qū)域。

1.4.4 圖像組織學(xué)分級(jí)

應(yīng)用SVM進(jìn)行圖像分類(lèi)時(shí)，整個(gè)過(guò)程劃分為訓(xùn)練階段分類(lèi)階段。在試驗(yàn)步驟中，對(duì)所采集的圖像特征提取，然后分別對(duì)圖像分配類(lèi)標(biāo)簽1和2以組成樣本。將每個(gè)類(lèi)別圖像總數(shù)的4/5作為訓(xùn)練集，1/5作為測(cè)試集。即cT1a(M)級(jí)患者148幅圖像用于訓(xùn)練，37幅圖像用于測(cè)試；cT1b(SM)級(jí)患者188幅圖像用于訓(xùn)練，47幅圖像用于測(cè)試。每次劃分均采用隨機(jī)方法將圖像劃分為5份，共進(jìn)行10次試驗(yàn)，記錄每一次試驗(yàn)被正確分類(lèi)的各個(gè)類(lèi)別的數(shù)量，取其平均數(shù)。分別在像素級(jí)別特征(pixel level features，PLF)、對(duì)象級(jí)別特征(object level features，OLF)及兩者組合(PLF+OLF)上進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)被正確分類(lèi)和錯(cuò)誤分類(lèi)的正例與負(fù)例的平均數(shù)，SVM分類(lèi)器的核函數(shù)為徑向基核函數(shù)，參數(shù)sigma=5。

1.5 觀(guān)察與評(píng)價(jià)指標(biāo)

選取一幅典型的圖像并請(qǐng)病理科醫(yī)生對(duì)此圖像中的癌巢與間質(zhì)作分割，在病理醫(yī)生的指導(dǎo)下隨機(jī)地劃分癌巢區(qū)域，選取100個(gè)典型的像素點(diǎn)，提取其顏色特征和紋理特征，一起組成正例樣本，同樣地在圖像中被劃分為間質(zhì)區(qū)域里選取100個(gè)典型的像素點(diǎn)，也提取其顏色特征與紋理特征，一起組成負(fù)例樣本，將正例樣本和負(fù)例樣本組合在一起組成訓(xùn)練樣本，并訓(xùn)練LR、NB和SVM 3種分類(lèi)器。

評(píng)估分類(lèi)效果，以像素點(diǎn)數(shù)作為定量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。將圖像分割成癌巢和間質(zhì)兩個(gè)部分，因此定義真正例(TP)為被正確分割為癌巢區(qū)域的像素點(diǎn)數(shù)，假正例(FP)為被錯(cuò)誤分割為癌巢區(qū)域的像素點(diǎn)數(shù)，真負(fù)例(TN)為正確分割為間質(zhì)區(qū)域的像素點(diǎn)數(shù)，假負(fù)例(FN)為被錯(cuò)誤分割為間質(zhì)域的像素點(diǎn)數(shù)，查準(zhǔn)率P=TP÷(TP+FP)，查全率R=TP÷(TP+FN)。對(duì)比不同算法下癌巢分割效果。

2 結(jié)果

2.1 癌巢分割效果對(duì)比

SVM分類(lèi)器的查準(zhǔn)率和查全率分別為85.4%和81.6%，高于LR分離器(83.0%和80.0%)及NB分離器(82.2%和79.4%)，3種分類(lèi)器間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

表1 三種分類(lèi)器的分類(lèi)效果

2.2 圖像組織學(xué)分級(jí)效果對(duì)比

在圖像組織學(xué)分級(jí)準(zhǔn)確率中，cT1 a(M)級(jí)患者圖像與cT1 b(S M)級(jí)患者圖像二分類(lèi)時(shí)，分類(lèi)器在PLF 上的圖像組織學(xué)分級(jí)準(zhǔn)確率為(23.6+36.8)÷(37+47)=71.9%，在OLF上的圖像組織學(xué)分級(jí)準(zhǔn)確率為(23.0+36.5)÷(37+47)=70.8%，在兩者組合(PLF+OLF)上的圖像組織學(xué)分級(jí)準(zhǔn)確率為(25.8+38.6)÷(37+47)=76.7%，相比于單獨(dú)PLF或OLF，兩者組合的圖像組織學(xué)分級(jí)準(zhǔn)確率較高，與其他兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。cT1a(M)被正確分級(jí)的準(zhǔn)確率為25.8÷37=69.7%，cT1b(SM)被正確分級(jí)的準(zhǔn)確率為38.6÷47=82.1%，見(jiàn)表2；患者早期胃癌組織學(xué)分級(jí)圖像見(jiàn)圖2。

3 討論

HE病理圖像分析中，圖像質(zhì)量的好壞直接影響識(shí)別算法的設(shè)計(jì)與效果的精度，原始的HE染色胃癌組織病理圖像中存在噪聲，因此在圖像分析(特征提取、分割、匹配和識(shí)別)前需要進(jìn)行預(yù)處理[4]。圖像預(yù)處理的主要目的是消除圖像中無(wú)關(guān)的信息，恢復(fù)有用的真實(shí)信息，增強(qiáng)有關(guān)信息的可檢測(cè)性，最大限度地簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)，從而改進(jìn)特征提取、圖像分割、匹配和識(shí)別的可靠性[5]。圖像預(yù)處理主要包括灰度化、去噪及對(duì)比度增強(qiáng)。

表2 cT1a(M)與cT1b(SM)患者圖像的分級(jí)情況(%)

圖2 早期胃癌組織病理圖

對(duì)HE染色圖像進(jìn)行處理時(shí)，往往需要對(duì)3個(gè)通道依次進(jìn)行處理，將會(huì)消耗很多時(shí)間。因此，為了達(dá)到提高整個(gè)應(yīng)用系統(tǒng)的處理速度的目的，需要對(duì)彩色圖像進(jìn)行灰度化以減少所需處理的數(shù)據(jù)量。在RGB模型中，如果R=G=B時(shí)，則彩色表示一種灰度顏色，其中R=G=B的值叫灰度值，因此，灰度圖像每個(gè)像素只需一個(gè)字節(jié)存放灰度值(又稱(chēng)強(qiáng)度值、亮度值)，灰度范圍為0～255[5]。根據(jù)重要性及其他指標(biāo)，將3個(gè)分量以不同的權(quán)值進(jìn)行加權(quán)平均。由于人眼對(duì)綠色的敏感最高，對(duì)藍(lán)色敏感最低，因此，對(duì)RGB3個(gè)分量進(jìn)行加權(quán)平均能得到較合理的灰度圖像。

對(duì)圖像去噪時(shí)，濾波器有抑制噪聲和光滑化的作用，常用的濾波器有均值濾波、中值濾波和高斯濾波等[6]。高斯濾波器是一種線(xiàn)性濾波器，能夠有效的抑制噪聲，平滑圖像，其作用原理和均值濾波器類(lèi)似，都是取濾波器窗口內(nèi)的像素的均值作為輸出，其窗口模板的系數(shù)和均值濾波器不同，均值濾波器的模板系數(shù)都是相同的為1；而高斯濾波器的模板系數(shù)，則隨著距離模板中心的增大而系數(shù)減小[7]。因此，高斯濾波器相比于均值濾波器對(duì)圖像模糊程度較小。在比較各種濾波器效果之后選擇3×3模板大小的高斯濾波。

在對(duì)比度調(diào)整時(shí)，基于直方圖的對(duì)比度調(diào)整方法：直方圖均衡化通過(guò)使用累積函數(shù)對(duì)灰度值進(jìn)行“調(diào)整”以實(shí)現(xiàn)對(duì)比度的增強(qiáng)。直方圖均衡化處理的“中心思想”是將原始圖像的灰度直方圖從比較集中的某個(gè)灰度區(qū)間變成在全部灰度范圍內(nèi)的均勻分布。直方圖均衡化是對(duì)圖像進(jìn)行非線(xiàn)性拉伸，重新分配圖像像素值，使一定灰度范圍內(nèi)的像素?cái)?shù)量大致相同，也是把給定圖像的直方圖分布改變成“均勻”分布直方圖分布。

在顏色特征提取中由于組織或細(xì)胞的不同成分，對(duì)蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細(xì)胞核及鈣鹽粘液等呈藍(lán)色；再利用胞漿染料伊紅染胞漿，使胞漿的各種不同成分又呈現(xiàn)出深淺不同的粉紅色，這是區(qū)分不同組織對(duì)象的一個(gè)重要信息[8-10]。在圖像處理中，可以將一個(gè)具體的像素點(diǎn)所呈現(xiàn)的顏色分多種方法分析，并提取出其顏色特征分量。顏色特征是一種全局特征，描述了圖像或圖像區(qū)域所對(duì)應(yīng)的景物的表面性質(zhì)。一般顏色特征是基于像素點(diǎn)的特征，此時(shí)所有屬于圖像或圖像區(qū)域的像素都有各自的貢獻(xiàn)[9]。由于顏色對(duì)圖像或圖像區(qū)域的方向、大小等變化不敏感，所以顏色特征不能很好地捕捉圖像中對(duì)象的局部特征。此外，僅使用顏色特征查詢(xún)時(shí)，如果數(shù)據(jù)庫(kù)很大，常會(huì)將許多不需要的圖像也檢索出來(lái)。顏色直方圖是最常用的表達(dá)顏色特征的方法，不受圖像旋轉(zhuǎn)和平移變化的影響，進(jìn)一步借助歸一化還可不受圖像尺度變化的影響。

紋理特征也是一種全局特征，其描述了圖像或圖像區(qū)域所對(duì)應(yīng)景物的表面性質(zhì)[11]。但由于紋理只是一種物體表面的特性，并不能完全反映出物體的本質(zhì)屬性，所以?xún)H僅利用紋理特征是無(wú)法獲得高層次圖像內(nèi)容的。與顏色特征不同，紋理特征不是基于像素點(diǎn)的特征，需要在包含多個(gè)像素點(diǎn)的區(qū)域中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。圖像的紋理特征有很多種，如灰度共生矩陣、Tamura紋理特征、自回歸紋理模型、小波變換、Gabor以及LBP等。

LBP方法是一種用來(lái)描述圖像局部紋理特征的算子，其作用是進(jìn)行特征提取，提取圖像的局部紋理特征[12-13]。LBP是計(jì)算機(jī)視覺(jué)中用于圖像特征分類(lèi)的一個(gè)方法，用于紋理特征提取。LBP紋理特征向量，一般以圖像分塊LBP直方圖表示。得到了整幅圖像的LBP紋理特征后，便可利用SVM或者其他機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行分類(lèi)。

分水嶺分割方法是一種基于拓?fù)淅碚摰臄?shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的分割方法，其基本思想是將圖像看作測(cè)繪學(xué)上的拓?fù)涞孛?，圖像中每一點(diǎn)像素的灰度值表示該點(diǎn)的海拔高度，每個(gè)局部極小值及其影響區(qū)域稱(chēng)為集水盆，而集水盆的邊界則形成分水嶺[14]。分水嶺算法是一種圖像區(qū)域分割法，在分割的過(guò)程中會(huì)把跟臨近像素間的相似性作為重要的參考依據(jù)，對(duì)圖像每個(gè)像素的灰度級(jí)進(jìn)行從低到高排序，再?gòu)牡偷礁邔?shí)現(xiàn)淹沒(méi)過(guò)程中，對(duì)每一個(gè)局部極小值在h階高度的影響域采用先進(jìn)先出(first in first out，F(xiàn)IFO)結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷及標(biāo)注[15]。

本研究中，通過(guò)將顯微鏡下觀(guān)察的患者組織切片掃描到計(jì)算機(jī)上并制作成TIFF格式，該圖像集的分辨率為1024×1360。選取一幅典型的圖像并請(qǐng)病理科醫(yī)生對(duì)此圖像中的癌巢與間質(zhì)作分割，在病理醫(yī)生的指導(dǎo)下隨機(jī)劃分癌巢區(qū)域，選取100個(gè)典型的像素點(diǎn)，提取其顏色特征和紋理特征，一起組成正例樣本，同樣的在圖像中被劃分為間質(zhì)區(qū)域里選取100個(gè)典型的像素點(diǎn)，也提取其顏色特征與紋理特征，一起組成負(fù)例樣本，將正例樣本和負(fù)例樣本組合在一起組成訓(xùn)練樣本，并訓(xùn)練LR、NB和SVM的3個(gè)分類(lèi)器。為評(píng)估分類(lèi)效果，本研究以像素點(diǎn)數(shù)作為定量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，將圖像分割成癌巢和間質(zhì)兩個(gè)部分，因此定義真正例(TP)為被正確分割為癌巢區(qū)域的像素點(diǎn)數(shù)，假正例(FP)為被錯(cuò)誤分割為癌巢區(qū)域的像素點(diǎn)數(shù)，真負(fù)例(TN)為正確分割為間質(zhì)區(qū)域的像素點(diǎn)數(shù)，假負(fù)例(FN)為被錯(cuò)誤分割為間質(zhì)域的像素點(diǎn)數(shù)。結(jié)果顯示SVM分類(lèi)器的查準(zhǔn)率和查全率高于LR和NB分類(lèi)器。

細(xì)胞核分割中，對(duì)HE染色的早期胃癌組織病理圖像進(jìn)行主成分分析，得到含有蘇木精顏色信息的灰度圖像，然后用形態(tài)學(xué)操作進(jìn)行預(yù)處理，去除干擾成分，得到較好的細(xì)胞核輪廓，再運(yùn)用快速?gòu)较驅(qū)ΨQ(chēng)變換提取種子點(diǎn)，將種子點(diǎn)標(biāo)記在原圖中，在進(jìn)行后景標(biāo)記后運(yùn)用分水嶺變換完成預(yù)分割，將預(yù)分割得到的輪廓線(xiàn)作為主動(dòng)輪廓模型的初始輪廓，進(jìn)行曲線(xiàn)演化得到最終輪廓。

組織病理學(xué)上根據(jù)浸潤(rùn)深度將早期胃癌分為cT1a(M)、cT1b(SM)，在圖像組織學(xué)分級(jí)的試驗(yàn)中，先提取圖像相關(guān)特征，如PLF及OLF等，OLF提取包括前面提到的分割的癌巢特征與細(xì)胞核特征，然后使用分類(lèi)模型將圖像分類(lèi)為1和2，分別為cT1a(M)和cT1b(SM)。本研究中，在cT1a(M)患者圖像與cT1b(SM)患者圖像二分類(lèi)時(shí)，分類(lèi)器在PLF上準(zhǔn)確率為71.9%，在OLF上準(zhǔn)確率為70.8%，在兩者組合(PLF+OLF)上的準(zhǔn)確率為76.7%，相比于單獨(dú)PLF或OLF，兩者組合的準(zhǔn)確率較高。cT1a(M)被正確分類(lèi)的準(zhǔn)確率為69.7%，cT1b(SM)被正確分類(lèi)的準(zhǔn)確率為82.1%。結(jié)果表明，從圖像分析的角度對(duì)圖像的組織學(xué)分級(jí)可行，而HE染色的早期胃癌組織病理圖像可以直接反映患者的胃癌狀態(tài)。

4 結(jié)論

HE染色的早期胃癌組織病理圖像的組織學(xué)分級(jí)可以在一定程度上代表患者的組織學(xué)分級(jí)。在HE染色早期胃癌組織病理圖像中癌巢分割中，SVM分類(lèi)器的查準(zhǔn)率和查全率較高，同時(shí)其對(duì)圖像組織學(xué)分級(jí)效果較好。