王珺，蘇本正，蔣海強(qiáng)，孫雨，楊鈺涵，崔寧，于宗淵*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

糖尿病是一種臨床常見(jiàn)的、多發(fā)的、因體內(nèi)胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足引起的代謝紊亂性疾病[1]。隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣不斷改變，糖尿病發(fā)病率也隨之持續(xù)增長(zhǎng)[2]。糖尿病病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上暫無(wú)特效、穩(wěn)定的治療與預(yù)防方法[3]，通常通過(guò)藥物、飲食療法、運(yùn)動(dòng)療法等綜合治療手段控制患者的血糖水平。雙胍類(lèi)降糖藥是糖尿病治療中常用的口服降糖藥，其降糖效果較好，但長(zhǎng)期使用仍會(huì)出現(xiàn)血糖過(guò)低、過(guò)敏等不良反應(yīng)[4-5]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療糖尿病方面取得了可喜的療效，中草藥的治療效果溫和而安全，已成為治療糖尿病的普遍選擇。

肉桂為樟科樟屬植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥樹(shù)皮[6]，是傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈的功效[7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，肉桂具有抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、降血糖、心血管保護(hù)、細(xì)胞保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂在治療糖尿病方面有很好的療效，可降低血糖、血脂[9-10]，具有明顯改善胰島素抵抗的作用，然而，對(duì)于肉桂在糖尿病治療中的藥效成分和作用機(jī)制仍缺乏全面了解。近年來(lái)，生物信息學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法逐漸成為系統(tǒng)揭示中藥分子機(jī)制的重要手段。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將藥物和靶點(diǎn)抽象成網(wǎng)絡(luò)模型，從網(wǎng)絡(luò)層面上系統(tǒng)、全面地揭示藥物作用機(jī)制[11-12]。因此，本研究旨在借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)，探索肉桂的藥效成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，闡明其治療糖尿病的生物學(xué)機(jī)制，為肉桂治療糖尿病的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)及新的思路。

1 材料與方法

1.1 肉桂有效成分與靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine system pharmacology datebase and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/)中，設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，檢索并篩選肉桂的化學(xué)成分信息[13]?；钚猿煞值陌悬c(diǎn)蛋白信息從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取，再利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/index.php)校正靶點(diǎn)蛋白為規(guī)范的基因名稱(chēng)，刪除無(wú)靶點(diǎn)成分，整理得肉桂的有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)信息。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中以“糖尿病(diabetes)”為關(guān)鍵詞，檢索已報(bào)道的與糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)的信息。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.1項(xiàng)下的成分靶點(diǎn)與1.2項(xiàng)下的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，以獲得肉桂治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)。為了更好地分析靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)，借助STRING Version 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，限定物種為人(Homo sapiens)，去除孤立靶點(diǎn)。再將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，分析網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及度值，得到核心靶點(diǎn)。

1.4 GO和KEGG富集分析

為說(shuō)明肉桂治療糖尿病有效成分的核心作用靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究采用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)Version 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，通過(guò)基因的富集分析預(yù)測(cè)肉桂治療糖尿病的可能機(jī)制。

1.5 成分與靶點(diǎn)對(duì)接

采用AutoDock vina軟件對(duì)核心靶點(diǎn)中度值(degree)排名前五的靶點(diǎn)蛋白與肉桂中的關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，并用傳統(tǒng)治療藥物二甲雙胍作對(duì)照分析。通過(guò)ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(https://zinc.docking.org/)獲取中藥小分子配體的3D結(jié)構(gòu)，全部保存為mol2格式。從RCSB PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org/)中獲得靶點(diǎn)蛋白和二甲雙胍的三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL 1.7軟件去除受體蛋白中的溶劑。利用AutoDock Tools軟件為受體和配體加氫、計(jì)算電荷并賦予原子類(lèi)型，再運(yùn)用Autodockvina軟件在Windows 10環(huán)境下批量對(duì)接，得到結(jié)合能，用PyMOL 1.7軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 肉桂主要活性成分及靶點(diǎn)篩選

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)查找收集篩選后，共獲得肉桂的有效成分32個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)244個(gè)，具體信息見(jiàn)表1。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)1592個(gè)。二者映射后得到交集基因131個(gè)。將篩選出的32個(gè)有效成分及131個(gè)交集基因?qū)隒ytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。該網(wǎng)絡(luò)包含163個(gè)節(jié)點(diǎn)和240條邊，六邊形代表肉桂成分，菱形代表靶點(diǎn)蛋白。分析各化學(xué)成分的度值，得到肉桂中度值排名前十的關(guān)鍵成分，包括槲皮素、油酸、丁香酚、萜基烯、異丁香酚甲醚、肉桂醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、茴香烯、原花青素B1和4-羥基-4-甲基-2-戊酮。其中，槲皮素的度值最大，說(shuō)明其在有效成分和靶點(diǎn)中起到關(guān)鍵作用。

表1 肉桂活性成分篩選結(jié)果

圖1 肉桂成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖2表示肉桂治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中共包含130個(gè)節(jié)點(diǎn)和2437條邊。節(jié)點(diǎn)越大，則靶點(diǎn)蛋白的度值越大[14]。節(jié)點(diǎn)顏色由藍(lán)色變?yōu)槌壬戆悬c(diǎn)蛋白的度值由大變小。節(jié)點(diǎn)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，以度值≥69、介數(shù)(betweenness)≥67.956為篩選條件，共得到20個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白CCL2、INS、PPARG、IL6、JUN、FOS、TNF、IL1B、CASP3、VEGFA、EGFR、EGF、CAT、AKT1、CXCL8、NOS3、PTGS2、TP53、MMP9、MAPK1(圖3和表2)，提示這些蛋白在肉桂抗糖尿病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖2 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 核心靶點(diǎn)信息

2.3 GO和KEGG富集分析結(jié)果

利用DAVAID 6.8平臺(tái)對(duì)肉桂治療糖尿病的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)P值得到GO條目45條(P<0.05)，其中生物過(guò)程32條，主要涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)的正調(diào)控等方面；細(xì)胞組成相關(guān)條目4條，主要涉及胞外間隙和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等方面；分子功能相關(guān)條目9條，主要涉及一氧化氮合酶調(diào)節(jié)因子活性、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合等方面。選取生物過(guò)程中P值較高的前20個(gè)條目以及細(xì)胞組成和分子功能條目進(jìn)行可視化(圖4)。

圖4 肉桂治療糖尿病的GO富集分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)20個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析(P<0.05)。根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果(圖5)，預(yù)測(cè)肉桂主要通過(guò)糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、癌癥通路和MAPK信號(hào)通路等途徑治療糖尿病(表3，詳細(xì)信息見(jiàn)OSID)。

表3 肉桂治療糖尿病的KEGG信號(hào)通路

圖5 肉桂治療糖尿病的KEGG信號(hào)通路分析

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的靶點(diǎn)蛋白(INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA)分別與二甲雙胍和10個(gè)關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證(表4)。結(jié)果顯示，10個(gè)關(guān)鍵成分與5個(gè)靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均良好，并且肉桂中部分活性成分與靶點(diǎn)對(duì)接的結(jié)合能明顯低于陽(yáng)性藥。其中，原花青素B1與INS、原花青素B1與IL6、槲皮素與TNF、槲皮素與IL6、原花青素B1與VEGFA的結(jié)合能較小，分子結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定(圖6)。結(jié)合上述結(jié)果，肉桂成分與核心靶點(diǎn)均具有良好的結(jié)合活性，表明肉桂可能通過(guò)作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)而對(duì)糖尿病發(fā)揮治療作用。

表4 成分與靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果

圖6 蛋白-配體對(duì)接模擬

3 討論

中醫(yī)學(xué)稱(chēng)糖尿病為“消渴”，其病機(jī)主要為陰虛燥熱、氣陰兩虛、陰損及陽(yáng)、陰陽(yáng)兩虛[15]。中醫(yī)臨床上常用肉桂治療糖尿病的陰陽(yáng)兩虛階段，尤其是陽(yáng)虛階段[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，肉桂能調(diào)節(jié)2型糖尿病患者的空腹血糖水平[16]，還能增加GLP-1(腸升糖素樣肽1)的分泌，抑制葡萄糖苷酶的活性，促進(jìn)GLUT-4(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4)的表達(dá)[17]。此外，肉桂中的多酚類(lèi)物質(zhì)還可以增加胰島素含量，改善胰島素敏感性[18]。由此可見(jiàn)，肉桂在治療糖尿病方面具有一定功效。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肉桂的主要有效成分進(jìn)行了研究，以O(shè)B≥30%作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出32個(gè)活性化合物，作用于131個(gè)糖尿病靶點(diǎn)。其中，槲皮素、油酸、丁香酚、萜基烯、異丁香酚甲醚、肉桂醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、茴香烯、原花青素B1和4-羥基-4-甲基-2-戊酮等10種成分的度值較高，提示這些成分可能是肉桂治療糖尿病的重要成分，值得進(jìn)一步研究。槲皮素的度值遠(yuǎn)高于其他成分，預(yù)測(cè)是肉桂中發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)。槲皮素是典型的黃酮類(lèi)化合物，具有多種生理活性，包括抗癌、抗氧化、抗纖維化、抗炎、抗菌、抗衰老、抗抑郁癥、抗白血病、抗糖尿病等多種生物活性[19]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠減輕高糖誘導(dǎo)的大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)，降低血糖，減輕大鼠外周胰島素抵抗，治療效果與二甲雙胍一致[20]。油酸可以直接刺激胰臟分泌胰島素，且會(huì)加強(qiáng)葡萄糖刺激胰島素分泌的作用。肉桂醛可以增加脂肪和骨骼肌組織對(duì)葡萄糖的攝取，促進(jìn)肝臟糖原合成，改善胰島素敏感性，維持糖尿病動(dòng)物的血糖和血脂穩(wěn)態(tài)[21]。原花青素能促進(jìn)肝糖原儲(chǔ)存以及胰島素抵抗細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖消耗[22]。在本研究中，槲皮素、油酸、肉桂醛、原花青素等成分能調(diào)節(jié)大多數(shù)糖尿病的靶點(diǎn)，說(shuō)明這些成分可能是治療糖尿病的代表性化合物，此外，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)它們還共同作用于前列腺素G/H合酶2(PTGS2)靶點(diǎn)，胰腺β細(xì)胞中PTGS2的表達(dá)與胰島素的表達(dá)密切相關(guān)，抑制PTGS2可劑量依賴(lài)性地促進(jìn)胰島素的分泌，調(diào)節(jié)血糖[23]。以上研究表明，肉桂治療糖尿病具有多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)。

肉桂與糖尿病的交集靶點(diǎn)共131個(gè)，說(shuō)明肉桂是通過(guò)多靶點(diǎn)協(xié)同起到治療糖尿病的作用。INS(胰島素)是血糖濃度的主要調(diào)節(jié)因子，可以阻斷糖原分解和糖異生，刺激脂肪生成、糖原和蛋白質(zhì)合成，增加肌肉和脂肪對(duì)葡萄糖的攝取，從而起到降低血糖濃度的作用[24]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是胰島素信號(hào)通路下游的重要靶點(diǎn)，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)代謝的作用，能夠阻止胰島素受體去磷酸化，調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)[25-27]。IL-6和TNF是具有多種功能的細(xì)胞因子，可直接損傷胰島β細(xì)胞，誘發(fā)胰島素抵抗。TNF可通過(guò)抑制胰島素信號(hào)的傳遞, 進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗[28]。在PPI網(wǎng)絡(luò)中, INS、AKT1、IL6、TNF和VEGFA的度值最高，說(shuō)明它們?cè)谥委熖悄虿∵^(guò)程中起到重要作用。這些結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接結(jié)果共同表明，INS、AKT1、IL6、TNF和VEGFA等靶點(diǎn)可能是肉桂抗糖尿病活性的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也提示使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)具有一定的科學(xué)性與準(zhǔn)確性。

此外，本文還對(duì)肉桂治療糖尿病的核心靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，這些靶點(diǎn)作用于糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、癌癥通路和MAPK信號(hào)通路等，這些通路之間相互影響，介導(dǎo)疾病的炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，為肉桂治療糖尿病的主要通路。MAPK可通過(guò)磷酸化靶蛋白來(lái)調(diào)控信號(hào)通路，促進(jìn)能量代謝[29]；還可通過(guò)上調(diào)GLUT-4的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖的吸收和利用，增強(qiáng)胰島素受體的敏感性，從而改善胰島素抵抗[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛能夠促進(jìn)分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGFA)，這與MAPK信號(hào)通路活性上調(diào)相關(guān)[31]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)中藥肉桂所含的藥效成分、靶點(diǎn)及作用途徑進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肉桂能夠通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多種生物途徑及多條通路達(dá)到治療糖尿病的目的，為肉桂臨床治療糖尿病提供了理論基礎(chǔ)。