郭水連，趙曉晴，莊鈺蓉，黃燕燕，余佳佳，趙珊，劉冬梅

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510641)

奶啤是一種以全脂或脫脂乳為原料，經(jīng)乳酸菌、酵母發(fā)酵而成的具有酸奶與啤酒糅合后的獨(dú)特香氣的低酒精乳飲料[1-2]，其風(fēng)味主要由微生物酶分解乳制品中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物而產(chǎn)生的醇類、酯類、醛類、酸類、酮類組成[3]。

酶法輔助生產(chǎn)在制取功能性多肽、提高澄清度等[4-5]方面應(yīng)用廣泛。蛋白水解產(chǎn)物對(duì)德氏乳桿菌及嗜熱鏈球菌有增殖作用，隋欣等[6]表明蛋白水解酶處理后的脫脂奶培養(yǎng)基適宜乳酸菌混合菌株的生長(zhǎng)。由于酶水解液含有大量苦肽，奶酪中常添加外肽酶來(lái)消除苦味，如氨肽酶等[7]。

奶啤通常由乳酸發(fā)酵及酒精發(fā)酵兩步制成，而本試驗(yàn)讓兩者同時(shí)發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中菌株的含量、種類及比例關(guān)系對(duì)奶啤風(fēng)味有一定程度的影響。付鴻等[8]表明乳酸單菌發(fā)酵沒(méi)有混合菌效果好,以桿菌和球菌按(1～2)∶1混合制得酸奶口感最佳。洪家麗等[9]表明乳酸菌因能顯著提高酵母菌有機(jī)酸含量而促進(jìn)其生長(zhǎng)。顧悅等[10]表明釀酒酵母因提高發(fā)酵乳中游離氨基氮、蘋果酸等含量和酒石酸等生成速率而促進(jìn)屎腸球菌的生長(zhǎng)。

本文采用共發(fā)酵酶解乳液制備新型奶啤，考察不同酶種類、酶活、桿菌和球菌比例、酵母含量等因素對(duì)奶啤發(fā)酵的影響，并通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)確定奶啤的最佳工藝，為新型奶啤的商業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉，雀巢(中國(guó))有限公司；嗜熱鏈球菌(DMST-H2，保藏編號(hào)GDMCC NO.60642)、德氏乳桿菌(DMLD-H1，保藏編號(hào)GDMCC NO.6045)，實(shí)驗(yàn)室保藏；安琪牌酵母，市售菌株；低聚果糖(95%)，江門量子高科生物股份有限公司公司；菠蘿蛋白酶(CAS：9001-00-7)、木瓜蛋白酶(CAS：9001-73-4)、中性蛋白酶(Neutrase 0.8 L)，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；白砂糖，市售食品級(jí)；MRS培養(yǎng)基、生理鹽水、孟加拉培養(yǎng)基，按標(biāo)準(zhǔn)方法配制。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MK3超凈工作臺(tái)，上海日島科學(xué)儀器有限公司；FA2004B分析天平，上海精科科學(xué)儀器有限公司；KDC-40恒溫培養(yǎng)箱，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；SHZ-88A立式高壓滅菌鍋，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；pHS-3C精密pH計(jì)，上海日島科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 奶啤制作工藝流程

奶啤制作工藝流程如下：

配制原乳液→分裝→酶水解→滅菌滅酶→冷卻→酶解液發(fā)酵→奶啤

配制原乳液：將脫脂奶粉、白砂糖、益生元、水以質(zhì)量比10∶10∶1∶79溶解；酶水解：常溫下水解4 h；滅菌滅酶：85 ℃，20 min；共發(fā)酵：酶水解液接種德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌及安琪酵母，于30 ℃發(fā)酵15 h。

1.3.2 奶啤發(fā)酵工藝的確定

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1配制的原乳液，分別選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶進(jìn)行酶解，酶活分別為200、400、600、800、1 000 U/mL，常溫下水解4 h，于85 ℃滅菌滅酶20 min。向酶水解液中添加桿菌和球菌比例分別為10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10，添加酵母數(shù)量為105、106、107、108CFU/mL，30 ℃共發(fā)酵15 h，考察奶啤的感官評(píng)分及pH值、活菌數(shù)(酵母和乳酸菌數(shù))[11-12]。

1.3.2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

參照段琳琳等[13]研究進(jìn)行改進(jìn)，篩選3個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化處理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面中心點(diǎn)，用Design Expert 8.0.6 Trial進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，具體如表1所示。

表1 采用 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3.3 感官評(píng)定

采用感官鑒定評(píng)分法，由10位感官評(píng)價(jià)員分別對(duì)奶啤顏色、口感、組織形態(tài)、氣泡、氣味進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分改進(jìn)參照胡曼等[14]的研究。評(píng)分細(xì)則如表2所示。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次；采用系統(tǒng)軟件Design-Expert 8.0.6 Trial進(jìn)行響應(yīng)面分析；采用系統(tǒng)軟件SPSS進(jìn)行顯著性分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

表2 奶啤感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory rating criteria of milk beer

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶種類對(duì)奶啤感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)的影響

木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及中性蛋白酶對(duì)奶啤感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)影響如圖1所示。由圖1-A可知，3種蛋白酶的感官評(píng)分存在顯著性差異(P<0.05)。唐霄等[15]表明中性蛋白酶酶水解鵝肉蛋白產(chǎn)生的游離氨基酸類型豐富，酶解液風(fēng)味好且鮮味濃郁。不同蛋白酶協(xié)同菌株發(fā)酵所得pH顯著不同(P<0.05)，其中菠蘿蛋白酶對(duì)應(yīng)pH最低,木瓜蛋白酶對(duì)應(yīng)pH最高。從圖1-B可以看出，中性蛋白酶酶解液對(duì)酵母和乳酸菌的生長(zhǎng)均起到較好的促進(jìn)作用；木瓜蛋白酶對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)效果最好，對(duì)酵母效果最差，但菠蘿蛋白酶作用效果與其相反。酶解所得的多肽和氨基酸可作為菌株的增殖因子，促進(jìn)乳酸菌和酵母的增殖。李雪霞等[16]表明酪蛋白酶解產(chǎn)物可有效促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)。馬宇驥等[17]和邵志芳等[18]表明中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶對(duì)乳酪蛋白的水解度分別為(25.25±0.35)%、(6.83±0.05)%、(9.56±0.2)%。綜合考量感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)，中性蛋白酶酶解液的發(fā)酵效果最好。

A-對(duì)pH值及感官評(píng)分的影響；B-對(duì)酵母菌數(shù)和球菌 與桿菌比例的影響圖1 不同酶種類對(duì)奶啤的影響Fig.1 The effects of different enzymes on milk beer

2.2 不同酶活對(duì)奶啤感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)的影響

不同酶活性對(duì)奶啤感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)影響如圖2所示。由圖2-A可知，隨著中性蛋白酶酶活性增強(qiáng)，感官評(píng)分升高，但當(dāng)酶活>800 U/mL時(shí)，感官風(fēng)味下降。CINDY等[19]表明蛋白質(zhì)水解液中存在含脯氨酸等疏水性氨基酸殘基,而此類殘基刺激味蕾產(chǎn)生苦味，故過(guò)高酶活會(huì)影響奶啤風(fēng)味。通過(guò)感官品嘗得知，向酶水解液中接入乳酸菌和酵母共發(fā)酵可降低苦味。劉萌等[20]表明酵母的脫苦效果優(yōu)于乳酸菌,因?yàn)槿樗峋x肽酶屬于胞內(nèi)酶,而釀酒酵母在細(xì)胞壁存在端肽酶，脫苦機(jī)理是乳酸菌先產(chǎn)生內(nèi)切酶將完整蛋白分子水解成肽鏈, 酵母菌再產(chǎn)生端肽酶將疏水性氨基酸殘基切除。隨著酶活性增強(qiáng)，pH值呈先降低后上升的趨勢(shì)(圖2-A)。從圖2-B可知，隨著酶活性增強(qiáng)，酵母數(shù)量顯著增多(P<0.05)。楊泓喆[21]表明中性蛋白酶水解產(chǎn)生的肽和氨基酸，為酵母發(fā)酵提供足夠氮源。隨著酶活性增強(qiáng)，乳酸菌數(shù)增加，但酶活性為400、600、800 U/mL協(xié)同混合菌共發(fā)酵之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。綜合考量感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)，最優(yōu)酶活性為800 U/mL。

2.3 桿菌和球菌比例關(guān)系對(duì)奶啤感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)的影響

接種德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌107CFU/mL，不同桿菌和球菌比例對(duì)感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)影響如圖3所示。由圖3-A可知，桿菌和球菌比例為1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1時(shí)，各組感官評(píng)分無(wú)顯著性差異(P>0.05)。隨著球菌接種量提高，比例為2∶1和1∶5的兩組pH值較低。除2∶1和1∶10外的各組別，隨著比例降低，菌落數(shù)逐漸增多(圖3-B)。桿菌和球菌比例趨近于1∶1時(shí)，酵母菌落數(shù)增多，在比例為2∶1時(shí)達(dá)到最高。李變變[22]表明桿菌∶球菌為1∶1時(shí), 兩菌共生效果較佳。綜合考量感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)，桿菌∶球菌最優(yōu)比例為2∶1。

A-對(duì)pH值及感官評(píng)分的影響；B-對(duì)酵母菌數(shù)和球菌 與桿菌比例的影響圖2 不同酶活性對(duì)奶啤的影響Fig.2 The effects of different enzyme activities on milk beer

A-對(duì)pH值及感官評(píng)分的影響；B-對(duì)酵母菌數(shù)和球菌 與桿菌比例的影響圖3 不同桿菌、球菌比例對(duì)奶啤的影響Fig.3 Influence of ratio of different Bacilli to Cocci on milk beer

2.4 不同酵母數(shù)量對(duì)奶啤感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)的影響

不同酵母量對(duì)感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)影響如圖4所示。由圖4-A可知，比較酵母數(shù)量為105、106、107CFU/mL組別，隨著酵母數(shù)量增加，感官評(píng)分增加，但組別之間差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)酵母數(shù)量為108CFU/mL，奶啤對(duì)應(yīng)pH最高，而酵母數(shù)量為105、107CFU/mL 時(shí)pH較低。由圖4-B可知，隨著酵母數(shù)量增多，乳酸菌數(shù)顯著增多(P<0.05)，說(shuō)明酵母菌與乳酸菌協(xié)同生長(zhǎng)。VILJOEN[23]表明酵母菌為乳酸菌提供丙酮酸鹽、氨基酸和維生素等必需營(yíng)養(yǎng)因子而促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)。這與ROOSTITA等[24]和REYES-SNCHEZ等[25]結(jié)果不同，他們認(rèn)為馬克斯克魯維酵母菌因分泌脂肪酶分解乳脂肪為游離脂肪酸而抑制乳酸乳球菌生長(zhǎng)。當(dāng)酵母數(shù)量達(dá)到108CFU/mL時(shí)，酵母死亡率大于出生率，原因可能是酵母數(shù)量過(guò)多，而糖含量有限，無(wú)法提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其次乙醇含量增多也會(huì)導(dǎo)致酵母生長(zhǎng)率降低。NISARUT等[26]表明高濃度乙醇會(huì)抑制葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致丙酮酸激酶和己糖激酶等關(guān)鍵糖酵解酶變性，并增加膜的通透性，使酵母喪失正常生理功能，但具體原因還有待研究。綜合考量感官評(píng)分和發(fā)酵參數(shù)指標(biāo)，并考慮生產(chǎn)成本，最優(yōu)酵母數(shù)量為107CFU/mL。

A-對(duì)pH值及感官評(píng)分的影響；B-對(duì)酵母菌數(shù)和球菌 與桿菌比例的影響圖4 不同酵母量對(duì)奶啤的影響Fig.4 Effects of different yeast contents on milk beer

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示，利用Design Expert 8.0 進(jìn)行分析和多元回歸擬合，建立以感官評(píng)分為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2.5.2 方差分析

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

表4方差分析顯示，該回歸模型顯著(P<0.05)，說(shuō)明感官評(píng)分與各個(gè)變量之間存在顯著的線性相關(guān)，失擬性在置信區(qū)間95%水平上不顯著，即方程失擬度較小，可利用該模型預(yù)測(cè)響應(yīng)值感官評(píng)分與變量之間的關(guān)系。

表4 回歸方程方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Test of significance for regression equation coefficients of sensory evaluation

回歸方程繪制等高線和響應(yīng)面圖如圖5所示，酵母數(shù)量與桿菌和球菌比例交互作用顯著，與表4中交互相P值的分析結(jié)果一致。響應(yīng)面的坡度較陡峭，表明感官品評(píng)的響應(yīng)值對(duì)酵母數(shù)量與桿球之比的變化較為敏感。在酵母數(shù)量不變的條件下，隨著桿球菌比值的提高，響應(yīng)值先逐漸升高再逐漸降低；在桿球菌比值不變的條件下，隨著酵母數(shù)量升高，響應(yīng)值先逐漸升高再逐漸降低。

a-桿球菌比例與酶活性的交互；b-桿球菌與酵母數(shù)量的交互；c-酵母數(shù)量與酵母活性的交互圖5 任意兩變量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of any two variables on sensory evaluation

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析,并根據(jù)擬合二階模型公式得到理論上感官評(píng)分最大值為84.3，此時(shí)奶啤發(fā)酵工藝的最優(yōu)理論條件為桿菌∶球菌值為1.7，酵母數(shù)量為5.3×107CFU/mL，酶活性為788 U/mL?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將上述最優(yōu)條件修正為桿菌∶球菌為1.5，酵母數(shù)量為5.0×107CFU/mL，酶活力為800 U/mL，此時(shí)理論的感官評(píng)分為84.2。

2.5.3 最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化奶啤生產(chǎn)工藝，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得感官評(píng)分為84.0，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法得到的最優(yōu)發(fā)酵條件可靠，具有參考價(jià)值。同時(shí)測(cè)定最優(yōu)生產(chǎn)工藝時(shí)其他理化指標(biāo)，酵母數(shù)量為6.5×107CFU/mL，細(xì)菌數(shù)量為4.0×1011CFU/mL，pH值為4.74。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化奶啤的最佳發(fā)酵條件為桿菌與球菌比例為1.5∶1，酵母數(shù)量為1.0×107CFU/mL，酶活力為800 U/mL。在該發(fā)酵條件下，奶啤中酵母數(shù)量為6.5×107CFU/mL，細(xì)菌數(shù)量為4.0×1011CFU/mL，pH值為4.74。本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化方法可為工業(yè)發(fā)酵優(yōu)化提供參考。