李璟波，周少華，夏 暉，李少軍，劉 陽(yáng)

肺癌是一種常見(jiàn)的肺部惡性腫瘤，是目前對(duì)人類健康和生命威脅最嚴(yán)重的腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%以上，是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型[1]。miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA,其主要通過(guò)與靶基因3'UTR的完全或不完全配對(duì)，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)。余東虎等[2]運(yùn)用生物信息學(xué)方法研究肺腺癌相關(guān)的靶基因，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也有重要聯(lián)系。多種miRNA包括miR-486、miR-30d、miR-499、miR-137、miR-375、miR-182*、miR-221和let-7a等的異常表達(dá)與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3-6]。

hsa-miR-221最初從斑馬魚(yú)中克隆獲得并得到證實(shí)，其與多種腫瘤存在密切關(guān)系，包括肝癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、甲狀腺乳頭狀癌和NSCLC等[7]。有研究表明，在肺癌組織中hsa-miR-221表達(dá)上調(diào)，可以通過(guò)靶向抑制腫瘤抑制基因TIMP3的表達(dá)促進(jìn)NSCLC的生長(zhǎng)[8]。呂俊杰等[9]研究了117例NSCLC患者的hsa-miR-221表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-221高表達(dá)的患者預(yù)后較差，可以作為一個(gè)潛在的肺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物。另外，在HBEC4肺癌細(xì)胞系中，hsa-miR-221能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(EMT)[10]。越來(lái)越多的證據(jù)表明hsa-miR-221在NSCLC的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，研究hsa-miR-221上游轉(zhuǎn)錄因子、下游調(diào)控基因及其與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)之間的調(diào)控關(guān)系，推測(cè)其在NSCLC的發(fā)生與發(fā)展中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究其調(diào)控NSCLC的分子機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具軟件加州大學(xué)圣克魯斯分校(University of California,Santa Cruz，UCSC)基因組瀏覽器(http://genome.UCSC.edu/)；人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(http://202.38.125.151/hmdd/mima/md/)；TF-miRNA調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(http://202.38.126.151/hmdd/mima/ttY)；miRNA靶基因預(yù)測(cè)驗(yàn)證數(shù)據(jù)(http://www.ulnm.uni-heidelberg.de/apps/zm/mirwalk/micronapredietedtarget.htm1)；Genecards在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneeards.org/index.php?path=/HTML/page/gcPeople)；肺癌相關(guān)因子整合數(shù)據(jù)庫(kù)IHLDB.rf(http://www.lungcancerdatabase.com/)；ConSite數(shù)據(jù)庫(kù)(http://consite.genereg.net)。美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心的基因表達(dá)譜(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

1.2 方法

1.2.1 分析miR-221在人類基因組中的位置、保守性及相關(guān)疾病 UCSC基因組在線瀏覽工具包含有人類及動(dòng)物的基因組相關(guān)數(shù)據(jù)。采用UCSC分析hsa-miR-221在人類基因組中的位置及保守性，在人類基因組hg19版本中得到hsa-miR-221的注釋信息。人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(the Human microRNA Disease Database，HMDD)通過(guò)對(duì)遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、循環(huán)miRNA和miRNA與靶基因相互作用分析得到miRNA與疾病的關(guān)系，目前其版本為v3.2更新版，在其中查詢與has-miR-221相關(guān)的疾病。

1.2.2 預(yù)測(cè)hsa-miR-221轉(zhuǎn)錄因子 利用TransmiR在線預(yù)測(cè)hsa-miR-221的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.3 查詢hsa-miR-221靶基因 MiRwalk綜合了多種miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件的結(jié)果，提供來(lái)自人類、小鼠和大鼠的miRNA的預(yù)測(cè)信息，利用該預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)hsa-miR-221靶基因。

1.2.4 篩選與NSCLC相關(guān)的hsa-miR-221靶基因 在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中查找已證實(shí)與NSCLC相關(guān)的基因，并與預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)得到的結(jié)果取交集篩選出與NSCLC相關(guān)的hsa-miR-221靶基因。

1.2.5 搜索與NSCLC相關(guān)的lncRNA 肺癌相關(guān)因子整合數(shù)據(jù)庫(kù)IHLDB.rf收錄了69種與肺癌相關(guān)的lncRNA，并提供了536對(duì)lncRNA與miRNA的相互作用。因此在該數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與NSCLC相關(guān)的lncRNA并篩選出于hsa-miR-221相互作用的lncRNA。

1.2.6 預(yù)測(cè)lncRNA轉(zhuǎn)錄因子 ConSite是兩序列間保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位預(yù)測(cè)軟件，運(yùn)用ConSite軟件輸入前面預(yù)測(cè)所得lncRNA的啟動(dòng)子序列，預(yù)測(cè)得該lncRNA的轉(zhuǎn)錄因子，匯總并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，最后篩選出與NSCLC相關(guān)的lncRNA的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.7 推測(cè)hsa-miR-221在NSCLC中分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 綜合上述結(jié)果，分析各基因間的關(guān)系，繪制hsa-miR-221在NSCLC中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.8 驗(yàn)證hsa-miR-221在NSCLC中的作用 為了評(píng)估hsa-miR-221在肺癌中的作用，本研究研究了hsa-miR-221過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞系影響。通過(guò)R軟件及affy和ggplot2等軟件進(jìn)行差異基因分析。選擇差異倍數(shù)2倍(|logFC|≥1)以上，P<0.05的差異基因找出差異基因，進(jìn)而與推測(cè)hsa-miR-221在NSCLC中分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步確認(rèn)hsa-miR-221調(diào)控的主要基因，對(duì)這些主要基因進(jìn)行GO及KEGG功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 hsa-miR-221在人類基因組中的位置、保守性及相關(guān)疾病 根據(jù)人類基因組hg19的結(jié)果發(fā)現(xiàn)has-miR-221定位于人類第X號(hào)染色體上，處在P11.3區(qū)域的染色體45 605 584～45 605 693 bp位置，長(zhǎng)度共107 bp，其在人、大鼠、小鼠、大象、狗、雞和斑馬魚(yú)等動(dòng)物中呈高度保守，圖1。

圖1 hsa-miR-122在人類基因組中的位置

對(duì)HMDD分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-221與多種疾病相關(guān)，包括多種腫瘤、心血管疾病以及哮喘和禿頭癥等(表1)。在腫瘤疾病中包括NSCLC，暗示其可能與NSCLC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

表1 HMDD中與hsa-miR-221相關(guān)的疾病

2.2 hsa-miR-221的轉(zhuǎn)錄因子 運(yùn)用TransmiR軟件預(yù)測(cè)的hsa-miR-221的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子上游可以被多種轉(zhuǎn)錄因子如MYC、MYCN、PDGF、ERS1、SF2/ASF、p27和FOS1所識(shí)別。其中MYC、MYCN、PDGF、ERS1、SF2/ASF、p27被證實(shí)與NSCLC有關(guān)。例如，C-MYC被證實(shí)與NSCLC的轉(zhuǎn)移有重要聯(lián)系[11]。MYCN(V-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog)是一個(gè)癌基因，在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，其過(guò)量表達(dá)也與NSCLC的增殖有關(guān)[12]。

2.3 hsa-miR-221的靶基因 用miRwalk軟件預(yù)測(cè)hsa-miR-221的靶基因?yàn)?17個(gè)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與NSCLC相關(guān)的基因共86個(gè)，對(duì)2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較取交集，得到26個(gè)基因。其中包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的相關(guān)酶類CDK2、CDK6、CDKN1B和CDKN2B等。同時(shí)包括轉(zhuǎn)錄因子E2F2和E2F3以及多種整合素基因。也包含磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PIK3)家族基因PIK3CD、PIK3CG和PIK3R1等。另外包含原癌基因BCL-2和抑癌基因PTEN和RB1等。

2.4 hsa-miR-221與lncRNA 利用肺癌整合因子數(shù)據(jù)庫(kù)IHLDB.rf查找與肺癌相關(guān)的lncRNAs，發(fā)現(xiàn)有GAS5、CCAT1、H19、HOTAIR、MALAT1、MEG3、PVT1、TP73-AS1、TUG1和XIST共10個(gè)lncRNAs與miRNA有相互作用的數(shù)據(jù)，這10個(gè)lncRNA都與NSCLC有關(guān)。繼續(xù)在IHLDB.rf數(shù)據(jù)庫(kù)中查找發(fā)現(xiàn)，GAS5、HOTAIR和TUG1預(yù)測(cè)的靶miRNA包含hsa-miR-221，推測(cè)這3個(gè)lncRNA與hsa-miR-221的相互調(diào)控在NSCLC發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

2.5 預(yù)測(cè)lncRNA的轉(zhuǎn)錄因子 運(yùn)用ConSite軟件預(yù)測(cè)上游1 kb啟動(dòng)子序列可能與lncRNAGAS5、HOTAIR和TUG1的結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，采用cutoff值為95%。在GAS5中預(yù)測(cè)得到5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以與之結(jié)合，HOTAIR中有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以與之結(jié)合，TUG1中有5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以與之結(jié)合(圖2)。其中3個(gè)lncRNA都可以被SOX-5識(shí)別。全基因組芯片分析發(fā)現(xiàn)，在NSCLC組織中SOX-5的基因組區(qū)域發(fā)生了較大改變[13]。E74A可以識(shí)別GAS5和TUG1，其與NSCLC的關(guān)系尚不清楚。其它轉(zhuǎn)錄因子如Snail、n-MYC、ARNT均與NSCLC相關(guān)[13]。

A.GAS5

2.6 hsa-miR-221在NSCLC中的分子作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖 根據(jù)以上結(jié)果，綜合識(shí)別hsa-miR-221啟動(dòng)子的MYC、MYCN和PDGF等6個(gè)上游轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶基因PTEN、RB1和BCL2等，和預(yù)測(cè)所得的與其相關(guān)的lncRNA GAS5、HOTAIR和TUG1及它們的轉(zhuǎn)錄因子Snail、n-MYC、ARNT和SOX5，這些因子均已證實(shí)與NSCLC相關(guān)，最后可以推測(cè)得hsa-miR-221在NSCLC中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。hsa-miR-221在表達(dá)過(guò)程中受到多種途徑的調(diào)控，在每個(gè)途徑中都有多種因子的參與，暗示其在調(diào)控NSCLC的發(fā)生和發(fā)展時(shí)處于一個(gè)十分復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，圖3。

圖3 hsa-miR-221在NSCLC組織中表達(dá)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖

2.7 hsa-miR-221過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄組差異基因分析 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出364個(gè)差異基因，其中上調(diào)274個(gè)，下調(diào)90個(gè)，圖4A。

將差異基因與預(yù)測(cè)的hsa-miR-221在NSCLC組織中表達(dá)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因取交集，最終確定5個(gè)基因，這5個(gè)基因分別為APAF1、COL4A4、ITGA6、CCNE2、E2F2，圖4B。GO功能注釋發(fā)現(xiàn)這些基因主要調(diào)控DNA分解代謝過(guò)程、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、DNA復(fù)制起始及凋亡執(zhí)行階段的調(diào)控等功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn)主要調(diào)控細(xì)胞周期信號(hào)通路、P53信號(hào)通路及PI3K-AKT信號(hào)通路等。

圖4 A:hsa-miR-221在NSCLC細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)差異

3 討論

隨著研究技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。NSCLC是肺癌的主要類型，受多種miRNA的調(diào)控，因此研究NSCLC中miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)闡明癌癥發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制具有十分重要的意義。應(yīng)用生物信息學(xué)手段，通過(guò)預(yù)測(cè)miRNA的調(diào)控因子、靶基因及其相互作用的lncRNA和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，張皓旻等[14]研究了kras基因突變對(duì)人肺腺癌轉(zhuǎn)錄組的影響，韓澤平等[15]繪制了hsa-miR-221在肝癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，呂燕妮等[16]繪制了hsa-miR-181a在腦卒中發(fā)病中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，明確了這些miRNA在疾病發(fā)生中的重要調(diào)控作用。

最近研究表明，hsa-miR-221在NSCLC中起重要作用，然而其具體機(jī)制并不清楚，因此本研究用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)其在NSCLC中的作用。hsa-miR-221在脊椎動(dòng)物甚至斑馬魚(yú)中保守，暗示其有十分重要的意義。其與多種癌癥包括NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。通過(guò)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)現(xiàn)，其可以被多種與NSCLC相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子所識(shí)別，其中MYC和MYCN都被證實(shí)與NSCLC的轉(zhuǎn)移和增殖有重要聯(lián)系。在受到與NSCLC相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的同時(shí)，hsa-miR-221也可以結(jié)合到許多與NSCLC相關(guān)的基因上，調(diào)節(jié)它們的表達(dá)。結(jié)合miRWalk預(yù)測(cè)得到的靶基因及Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中與NSCLC相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)其下游有26個(gè)基因與NSCLC有關(guān)，包括PTEN、RB1和BCL2等。hsa-miR-221的升高能抑制PTEN的表達(dá)[8]。在NSCLC中，抑癌基因PTEN的表達(dá)受到抑制，PTEN表達(dá)的抑制與NSCLC患者的預(yù)后較差有很重要的聯(lián)系[17]。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC中，hsa-miR-221的表達(dá)還受到lncRNA的調(diào)節(jié)，這些lncRNA已被證實(shí)與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展有重要關(guān)系，包括GAS5、HOTAIR和TUG1。這些lncRNA自己也受到多種與NSCLC相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。因此通過(guò)上游轉(zhuǎn)錄因子，lncRNA以及下游靶基因，構(gòu)成了NSCLC中以hsa-miR-221為核心的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在每個(gè)步驟中都有多種分子的參與，暗示了該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，hsa-miR-221可以通過(guò)多種途徑對(duì)NSCLC的發(fā)生和發(fā)展起調(diào)控作用。

通過(guò)以上生物信息學(xué)的分析，本研究繪制了hsa-miR-221調(diào)控NSCLC的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為以后進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究提供了十分重要的線索，同時(shí)為闡明其在NSCLC中的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。