霍 影， 王先流， 易兵成， 沈炎冰， 張彥中

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

生物支架材料是運(yùn)用組織工程策略完成組織缺損修復(fù)與再生的一個(gè)基本要素，如何最大程度地對(duì)天然組織的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行仿生是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-3]。常見的制備組織工程支架的方法中，電紡絲技術(shù)制備的纖維支架由于具有較高的比表面積和仿生天然組織的細(xì)胞外基質(zhì)的納-微米纖維形態(tài)等優(yōu)勢，在組織工程領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注。

肌腱組織由高度取向的納-微米膠原纖維與散布其中的肌腱細(xì)胞構(gòu)成。目前基于電紡絲技術(shù)已經(jīng)可以構(gòu)建出仿生肌腱組織取向纖維結(jié)構(gòu)的生物材料支架[4-6]。肌腱作為一種承力組織，在其支架的構(gòu)建中，賦予仿生纖維支架力學(xué)刺激功能，給肌腱細(xì)胞提供合適的力學(xué)微環(huán)境，對(duì)于增強(qiáng)肌腱組織的再生功效十分必要。如：Morita 等[7]的研究表明在2D 硅膜上，與施加5%或15%的應(yīng)變相比，10%的循環(huán)拉伸更有利于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的成肌腱分化。Farng 等[8]證明，在聚己內(nèi)酯3D 支架上接種間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）并在定制的生物反應(yīng)器中對(duì)其進(jìn)行機(jī)械拉伸（10%應(yīng)變，0.33 Hz）48 h 后，肌腱標(biāo)志基因（Scleraxis、膠原蛋白I、膠原蛋白II）的表達(dá)量增加，結(jié)果表明適宜的力學(xué)微環(huán)境能夠有效提升肌腱組織的形成能力。但當(dāng)前對(duì)于構(gòu)建力學(xué)微環(huán)境的研究主要集中在2D、3D 拉伸裝置[9,10]和生物反應(yīng)器[11-13]，均需借助外部裝置的協(xié)助，存在一定的局限性。若構(gòu)建的肌腱組織工程支架不僅可以模擬生物學(xué)基質(zhì)微環(huán)境，還能自發(fā)、可控地為種子細(xì)胞提供力學(xué)刺激，將對(duì)肌腱等力學(xué)相關(guān)性組織的再生具有重要意義。

形狀記憶聚合物（SMPs）是一種具有形狀記憶效應(yīng)的智能材料，已受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者的關(guān)注。SMPs 易于塑形，可在施加特定刺激（如熱[14]、光[15]、超聲[16]等）時(shí)發(fā)生形狀變形并固定，當(dāng)重新施加這種刺激時(shí)，又可以從這種臨時(shí)形狀自發(fā)回復(fù)到其初始形狀[17]，從而達(dá)到對(duì)肌腱組織工程種子細(xì)胞施加主動(dòng)式力學(xué)刺激的目的。將這類智能材料制備成纖維在發(fā)展智能手術(shù)縫合線[18]和組織再生[19]等與生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域有著較好的應(yīng)用前景，但針對(duì)調(diào)控形狀記憶纖維形狀回復(fù)力的研究還鮮有報(bào)道。

本文基于本課題組近年來發(fā)展的穩(wěn)定射流電紡絲方法（SJES）[20]，制備了具有形狀記憶特性的左旋聚乳酸/聚羥基丁酸戊酸共聚酯（PLLA/PHBV）取向纖維，通過在一定溫度下的拉伸塑形、冷卻固定及受熱刺激形狀回復(fù)處理和測試表征，研究該取向纖維形狀回復(fù)時(shí)的回復(fù)力與拉伸應(yīng)變的關(guān)系。本研究將為利用形狀記憶取向纖維的形狀回復(fù)效應(yīng)研究對(duì)工程化結(jié)構(gòu)特異性組織（如肌腱、韌帶等）的細(xì)胞功能調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

PLLA：Mn=1.0 × 105，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司；PHBV：Mn=5.2 × 105，寧波天安生物材料有限公司；六氟異丙醇（HFIP）：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 測試與表征

利用掃描電子顯微鏡（日本日立公司TM-1000）觀察纖維膜形貌；用X 射線衍射儀（日本理光公司Rigaku D/MAX-2550PC）和傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛有限公司Nicolet 6700）對(duì)纖維膜的組成、結(jié)構(gòu)及分子取向度進(jìn)行測試分析；通過差示掃描量熱分析儀（德國耐馳儀器制造有限公司DSC-822）分析纖維膜熱性能；使用動(dòng)態(tài)熱機(jī)械分析儀（德國耐馳儀器制造有限公司TA Instruments Q800）測試?yán)w維膜形狀記憶性能；用電子力學(xué)測試機(jī)（中國上海恒馭儀器有限公司HY-940FS）對(duì)拉伸后的纖維膜進(jìn)行力學(xué)性能檢測；恒溫加熱水浴鍋（中國上海豫明儀器有限公司HHS-2S）和數(shù)顯拉力計(jì)（中國艾普計(jì)量儀器有限公司SF-5）用于測定纖維膜的形狀回復(fù)力。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 PLLA/PHBV 取向纖維膜的制備 室溫下按照質(zhì)量比6∶4 分別稱取PLLA 和PHBV 溶解于HFIP 溶液中，配制成質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL 的紡絲溶液?；赟JES[20]制備PLLA/PHBV 取向纖維膜，參數(shù)如下：電壓6 kV，注射速率0.5 mL/h，接收距離10 cm，滾筒轉(zhuǎn)速1 000 r/min，室溫，環(huán)境濕度70%～90%。電紡結(jié)束后，將制備的PLLA/PHBV 取向纖維膜置于真空干燥箱中干燥72 h 以上，以除去纖維中殘留的有機(jī)溶劑。

1.3.2 PLLA/PHBV 取向纖維膜的形狀記憶性能 將PLLA/PHBV 取向纖維膜裁剪成尺寸為15 mm × 6 mm ×0.06 mm 的樣品，利用動(dòng)態(tài)熱機(jī)械分析儀（DMA）評(píng)估其形狀記憶性能[21]。測試前將樣品固定于DMA 儀器上，升溫至高于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）5 ℃，保溫2 min，記錄初始應(yīng)變值（εbegin），然后按如下步驟測試：（1）關(guān)閉數(shù)據(jù)儲(chǔ)存；（2）升溫到50 ℃；（3）保溫3 min，得到初始應(yīng)變?chǔ)舃egin；（4）打開數(shù)據(jù)儲(chǔ)存；（5）以0.25 MPa/s施加應(yīng)力到2.5 MPa，得到臨時(shí)應(yīng)變值εdeform；（6）維持應(yīng)力2.5 MPa；（7）以3 ℃/min 降溫到0 ℃；（8）保溫2 min；（9）以0.25 MPa/s 撤去應(yīng)力，得到固定應(yīng)變值εfix；（10）以3 ℃/min 升溫到50 ℃；（11）保溫30 min，得到回復(fù)后應(yīng)變值εfinal。按公式（1，2）分別計(jì)算形狀固定率（Rf）和形狀回復(fù)率（Rr）。

同時(shí)，對(duì)PLLA/PHBV 取向纖維膜的形狀記憶性能進(jìn)行3D 宏觀演示：將紡制2 h 的取向纖維膜卷成纖維束，在50 ℃熱水中使其變形為臨時(shí)形狀“S”，并將其迅速轉(zhuǎn)移至0 ℃冰水中進(jìn)行固定；然后將其重新置于50 ℃熱水中，觀察并記錄其形狀回復(fù)情況。

1.3.3 PLLA/PHBV 取向纖維膜不同拉伸應(yīng)變的調(diào)控及表征 將1.3.1 制備的PLLA/PHBV 取向纖維膜裁剪成正方形（40 mm×40 mm），將裁剪好的纖維膜固定在夾具上，置于50 ℃蒸餾水中對(duì)纖維膜進(jìn)行不同應(yīng)變（40%、70%、100%）的拉伸；然后將不同應(yīng)變下拉伸后的纖維膜在固定狀態(tài)下置于0 ℃冰水混合液中降溫固定；最后取下纖維膜置于4 ℃冰箱中保存。未經(jīng)拉伸變形和降溫固定的纖維膜（ε = 0）作為對(duì)照組。

利用SEM 對(duì)不同拉伸應(yīng)變（0、40%、70%、100%）的PLLA/PHBV 取向纖維膜的形貌進(jìn)行表征，方法同上。

按照1.3.1 節(jié)所述方法紡絲2 h 制備纖維膜，剪成適當(dāng)長度后粘貼在中空紙框上，按照上述方法進(jìn)行拉伸、固定，干燥后進(jìn)行拉伸力學(xué)測試（力傳感器范圍10 N，拉伸速率為15 mm/min）。

利用偏振紅外光譜法（p-FTIR）檢測纖維的分子取向度。將不同拉伸應(yīng)變處理后的纖維固定于偏振紅外器上，調(diào)整偏振光片的角度，在400～4 000 cm-1進(jìn)行掃描，分別得到平行纖維取向方向（//）和垂直纖維取向方向（⊥）的偏振紅外光譜圖。通過公式Dr= A///A⊥計(jì)算紅外二向色性（Dr）值，其中，A//和A⊥分別是偏振片平行和垂直于纖維取向方向的紅外吸收值。衡量分子取向度的Dr值越接近于1，材料的分子取向度越低；當(dāng)Dr值遠(yuǎn)大于或遠(yuǎn)小于1 時(shí)，表示材料的分子取向度很高。

1.3.4 不同拉伸應(yīng)變下PLLA/PHBV 取向纖維膜的形狀回復(fù)力檢測 將電紡2 h 制備的纖維膜裁剪成40 mm長的樣品，粘貼在中空紙框上，按照上述方法進(jìn)行拉伸、固定，然后將拉伸固定后的纖維膜一端固定于焊接在恒溫水浴鍋底部的夾子上，一端固定于數(shù)顯拉力計(jì)上。調(diào)整數(shù)顯拉力計(jì)的距離至剛好出現(xiàn)數(shù)值，表明此時(shí)纖維膜處于臨界受力狀態(tài)。接著，緩慢加入50 ℃的蒸餾水，并通過拍攝視頻的方式記錄數(shù)顯拉力計(jì)上的數(shù)值，即纖維膜的形狀回復(fù)力，統(tǒng)計(jì)出形狀回復(fù)力與時(shí)間的關(guān)系，從而得到形狀回復(fù)應(yīng)力與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用Origin 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品間是否存在顯著性差異。組間比較采用t 檢驗(yàn)和單因素方差分析（One way ANOVA）。當(dāng)*P ＜ 0.05 時(shí)，表示數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異；當(dāng)**P ＜ 0.01 時(shí)，表示數(shù)據(jù)之間存在極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLLA/PHBV 取向纖維膜的形貌與組成

從PLLA/PHBV 纖維膜的SEM 形貌圖（圖1（a））可以看出，電紡制備的PLLA/PHBV 復(fù)合纖維取向排列、形貌均一，平均直徑（d）為（1.37 ± 0.15）μm（圖1(b)）。從PLLA/PHBV 取向纖維及其組分的紅外光譜（圖1（c））可以看出：純PHBV 于1 728 cm-1處的強(qiáng)吸收峰為C＝O 的伸縮振動(dòng)峰；1 188 cm-1和1 053 cm-1處是C―O―C 的振動(dòng)吸收峰[22]；純PLLA 于1 754、1 080 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別歸屬于C＝O 的伸縮振動(dòng)峰和C―O―C 的伸縮振動(dòng)峰[23,24]。這兩種組分的特征吸收峰均在電紡PLLA/PHBV 復(fù)合纖維的紅外光譜圖中呈現(xiàn)，驗(yàn)證了PLLA/PHBV 纖維的組成。比較X 射線衍射圖譜（圖1（d）），PHBV 衍射圖譜中的兩個(gè)較強(qiáng)的衍射峰（位于13.6°和17.0°[22]）和PLLA 由于結(jié)晶度較低在16.0°左右出現(xiàn)的駝峰[25]，經(jīng)電紡復(fù)合后各自的特征衍射峰依然比較明顯呈現(xiàn)，進(jìn)一步說明PLLA 和PHBV 成功復(fù)合。

圖 1 PLLA/PHBV 取向纖維膜的形貌（a）；直徑分布（b）；紅外光譜圖（c）和XRD 圖譜（d）Fig. 1 Morphology （a）, diameter distribution （b）, FT-IR spectra （c） and XRD pattern （d） of the aligned PLLA/PHBV fibrous films

2.2 PLLA/PHBV 取向纖維膜的形狀記憶性能

電紡PLLA/PHBV 取向纖維膜及各組分的DSC 熱分析結(jié)果見圖2（a）。由圖可以看出，PLLA 的Tg為59 ℃，而PLLA/PHBV 的Tg為46 ℃，表明PLLA 和PHBV 復(fù)合可以降低Tg，使該形狀記憶材料的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Ttrans）更接近體溫，方便運(yùn)用間接熱刺激（如近紅外光、超聲等）手段在稍高于體溫條件下按需實(shí)現(xiàn)其形狀記憶效應(yīng)。DMA 對(duì)PLLA/PHBV 取向纖維膜進(jìn)行形狀記憶性能測試的結(jié)果見圖2（b）。在3 次形狀記憶測試循環(huán)中，PLLA/PHBV 均能較好地實(shí)現(xiàn)形狀回復(fù)；對(duì)其形狀固定率和形狀回復(fù)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其平均形狀固定率和平均形狀回復(fù)率分別達(dá)到（96.79 ± 0.64）%和（71.64 ± 8.87）%。這些結(jié)果表明PLLA/PHBV 取向纖維膜具有良好的形狀記憶性能。

為更直觀證明PLLA/PHBV 取向纖維膜具有的形狀記憶特性，對(duì)其形狀記憶性能進(jìn)行的宏觀演示見圖2（c）?？梢钥闯?，變形固定后的臨時(shí)形狀“S”可以在50 ℃的熱水中10 s 內(nèi)基本回復(fù)至其初始直條形狀。

2.3 經(jīng)應(yīng)變固定處理的PLLA/PHBV 取向纖維膜的形貌

形狀記憶型支架具有回復(fù)初始形狀的能力，即高于Ttrans時(shí)對(duì)支架結(jié)構(gòu)性能進(jìn)行重塑，將溫度降低至Ttrans后對(duì)支架重塑形狀進(jìn)行固定，稱之為臨時(shí)形狀；再次將支架升溫至Ttrans后，支架的內(nèi)應(yīng)力會(huì)使支架從臨時(shí)形狀回復(fù)到初始形狀。針對(duì)同一種初始形狀，如果將支架重塑成不同的臨時(shí)形狀，形狀回復(fù)過程產(chǎn)生的形狀回復(fù)力將不同?；诖嗽?，本文在2.2 節(jié)中驗(yàn)證了所制備的PLLA/PHBV 取向纖維膜具有形狀記憶特性后，嘗試對(duì)該形狀記憶型PLLA/PHBV 取向纖維膜進(jìn)行不同應(yīng)變的固定，研究不同固定應(yīng)變處理后PLLA/PHBV取向纖維膜的拉伸性能、分子取向特征及對(duì)形狀回復(fù)力的調(diào)控作用。

由宏、微觀形貌圖（圖3（a））可見，對(duì)取向纖維膜進(jìn)行高溫拉伸和低溫固定的形狀編程后，纖維取向度趨于更優(yōu)（圖3（b））。同時(shí)，纖維直徑降低，由ε = 0 時(shí)的（1.37 ± 0.15） μm 下降到ε = 100%時(shí)的（0.91 ± 0.08） μm（圖3（c））。拉伸變形處理引起的纖維直徑的變化，如果結(jié)合形狀記憶纖維膜的形狀回復(fù)效應(yīng)，將有可能在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)嘗試通過纖維直徑的動(dòng)態(tài)變化影響細(xì)胞的生物功能，這為動(dòng)態(tài)調(diào)控細(xì)胞行為提供了較好的研究平臺(tái)。

圖 2 PLLA/PHBV 取向纖維膜的DSC 曲線（a），形狀記憶測試的應(yīng)力-應(yīng)變-溫度曲線（b）和在50 ℃ 熱水中進(jìn)行的形狀記憶宏觀演示（c）Fig. 2 DSC curves （a）, stress-strain-temperature curves in shape memory testing （b） and macroscopic demonstration of shape recovery （c） of the aligned PLLA/PHBV fibrous sticks performed in warm water （50 ℃）

圖 3 不同拉伸應(yīng)變PLLA/PHBV 取向纖維膜形貌（a），取向度（b）和直徑（c）（標(biāo)尺30 μm，*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01）Fig. 3 Morphology （a）, orientation （b） and diameter （c） of the aligned PLLA/PHBV fibrous films stretched at different strain ratios （Scale bar is 30 μm, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01）

2.4 經(jīng)應(yīng)變固定處理的PLLA/PHBV 取向纖維膜的拉伸性能與分子取向

對(duì)不同拉伸變形處理后的PLLA/PHBV 取向纖維膜進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測試。由應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖4（a））可知，隨著拉伸應(yīng)變?cè)黾樱琍LLA/PHBV 取向纖維的力學(xué)性能也相應(yīng)提高。以楊氏模量為例，未經(jīng)拉伸（ε = 0）處理的PLLA/PHBV 取向纖維膜的楊氏模量是（1 489.27 ± 86.31） MPa；隨著拉伸應(yīng)變的增大，其楊氏模量分別增加到（1 758.01 ± 94.99） MPa（ε = 40%）、（1 971.83 ± 73.57） MPa（ε = 70%）和（2 011.99 ± 97.45） MPa（ε =100%）（圖4（b））。這表明拉伸處理能夠提高纖維膜的拉伸力學(xué)性能。

不同拉伸應(yīng)變PLLA/PHBV 取向纖維膜的偏振紅外測試[26]結(jié)果見圖4（c），根據(jù)公式Dr= A///A⊥計(jì)算出特征基團(tuán)C―O―C（1 188 cm-1處）的Dr，得到圖4（d），通過Dr定量評(píng)價(jià)取向纖維分子鏈的取向度[27]。由結(jié)果可以看出，隨著拉伸應(yīng)變由0 增加到100%，PLLA/PHBV 取向纖維分子鏈取向度呈現(xiàn)遞增的趨勢，說明通過調(diào)節(jié)拉伸應(yīng)變可以調(diào)節(jié)纖維中的分子取向度，PLLA/PHBV 取向纖維膜的力學(xué)性能增強(qiáng)與其分子取向結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。

圖 4 不同拉伸應(yīng)變PLLA/PHBV 取向纖維膜應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖（a），楊氏模量（b），偏振紅外圖譜（c）及分子取向度統(tǒng)計(jì)（d）Fig. 4 Typical stress-strain curves （a），Young’s modulus （b），p-FTIR spectra （c） and Dr （d） with respect to the C―O―C group of the aligned PLLA/PHBV fibrous films stretched at different strains （*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01）

2.5 經(jīng)應(yīng)變固定處理的PLLA/PHBV 取向纖維膜的形狀回復(fù)力

圖5 是對(duì)不同拉伸應(yīng)變的PLLA/PHBV 取向纖維膜在50 ℃下形狀回復(fù)時(shí)檢測的形狀回復(fù)應(yīng)力測試結(jié)果。由形狀回復(fù)應(yīng)力-回復(fù)時(shí)間關(guān)系曲線（圖5（a））可以看出，形狀回復(fù)應(yīng)力均呈現(xiàn)隨著回復(fù)時(shí)間的增加先增大到最大值然后再略降低的趨勢特征，這可能是伴隨形狀回復(fù)時(shí)間的延長發(fā)生的應(yīng)力松弛現(xiàn)象。對(duì)最大形狀回復(fù)應(yīng)力與拉伸應(yīng)變的對(duì)應(yīng)關(guān)系（圖5（b））進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明增大拉伸應(yīng)變，纖維膜的最大形狀回復(fù)應(yīng)力也增大，即從0（ε = 0）分別增加到 （5.32 ± 0.32）MPa （ε = 40%）、（7.63 ± 0.26）MPa （ε = 70%） 和 （9.24 ± 0.13）MPa（ε = 100%）。分析原因可能是對(duì)取向纖維膜進(jìn)行拉伸、固定過程中，聚合物分子趨向規(guī)整排列（圖6（a）），拉伸應(yīng)變?cè)酱?，纖維儲(chǔ)存能量也越多；升高溫度后，纖維膜發(fā)生形狀回復(fù)，儲(chǔ)存的能量隨之釋放，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的形狀回復(fù)力呈現(xiàn)梯度變化（圖6（b））。這些結(jié)果表明可以通過改變形狀記憶型取向纖維膜的拉伸應(yīng)變調(diào)節(jié)其形狀回復(fù)（應(yīng)）力的大小，這一特性使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖 5 不同拉伸應(yīng)變PLLA/PHBV 取向纖維形狀回復(fù)應(yīng)力-時(shí)間曲線（a）和最大形狀回復(fù)應(yīng)力（b）Fig. 5 Shape recovery stress-time curves （a） and the derived ultimate recovery stress （b） of the aligned PLLA/PHBV fibrous films stretched at different strains （**P ＜ 0.01）

圖 6 形狀記憶取向纖維膜形狀記憶效應(yīng)的宏、微觀機(jī)制示意圖（a）及不同拉伸應(yīng)變形狀記憶纖維儲(chǔ)存和釋放能量示意圖（b）Fig. 6 Schematic of molecular mechanism （a） and energy storage and release （b） of the fibrous shape memory polymer films

3 結(jié) 論

（1）將PLLA 和PHBV 兩種生物相容性良好的聚合物通過共混電紡的方式成功制備出了形貌均一的取向復(fù)合纖維膜；且該取向纖維膜具有較好的形狀記憶效應(yīng)，其形狀固定率和形狀回復(fù)率分別為（96.79 ± 0.64）%和（71.64 ± 8.87）%，其3D 結(jié)構(gòu)可在50 ℃熱水中10 s 左右由臨時(shí)形狀基本回復(fù)至初始形狀。

（2）對(duì)PLLA/PHBV 取向纖維膜進(jìn)行不同拉伸應(yīng)變下的高溫拉伸和低溫固定處理，可使該復(fù)合纖維的取向度提高，直徑變小，拉伸力學(xué)性能顯著提高。

（3）不同拉伸應(yīng)變（0～100%）處理的PLLA/PHBV 取向纖維膜的形狀回復(fù)應(yīng)力在0～（9.24 ± 0.13） MPa 可調(diào)。