孫瑗璟 范玉華

常染色體顯性遺傳性腦動脈病伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦?。–ADASIL）是Notch3基因突變導(dǎo)致的非淀粉樣變性、非動脈粥樣硬化性、常染色體顯性遺傳性腦小血管?。–SVD）。通常于中青年發(fā)病，臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)的短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）和缺血性卒中、認知功能障礙、情感障礙、偏頭痛等。亞洲人群以缺血性卒中為首要或主要表現(xiàn)，偏頭痛少見，歐美人群則常以偏頭痛為首發(fā)癥狀。影像學(xué)表現(xiàn)包括腦白質(zhì)高信號（WMH）、皮質(zhì)下梗死和腦微出血（CBMs），T2WI和FLAIR成像高信號好發(fā)于側(cè)腦室周圍和前顳極、外囊、額頂葉白質(zhì)，目前認為雙側(cè)前顳葉長T2信號即“O'Sullivan征”在CADASIL的診斷中具有較高的敏感性和特異性，可資與其他腦小血管病相鑒別。病變主要累及微小動脈，光學(xué)顯微鏡下可見血管平滑肌細胞（VSMC）缺失變性，血管中膜纖維化，管壁增厚，病變廣泛，多位于側(cè)腦室周圍、基底節(jié)和腦干；超微結(jié)構(gòu)可見顆粒性電子致密嗜鋨物質(zhì)（GOM）沉積于血管平滑肌細胞基膜凹陷處，是CADASIL的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。基因檢測檢出Notch3突變是確診依據(jù)，目前文獻報道Notch3基因有200余種突變與CADASIL發(fā)病相關(guān)。本文擬對CADASIL病理改變、基因突變及可能的相關(guān)分子機制進行綜述。

一、CADASIL血管病理改變

CADASIL主要累及直徑50~100 μm的微小動脈。光學(xué)顯微鏡下可見皮下組織小動脈纖維化，管壁增厚，血管中膜平滑肌細胞缺失變性等退行性變，且隨病程進展，管腔進行性狹窄，出現(xiàn)血管功能障礙。電子顯微鏡觀察，皮膚組織活檢標(biāo)本在血管平滑肌細胞基膜處可見特征性GOM沉積，小動脈和毛細血管周圍均有沉積，多圍繞血管平滑肌細胞，而血管內(nèi)皮細胞和周細胞周圍較少見。此外，亦累及血管平滑肌細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞，胞質(zhì)嗜鋨染色深，吞飲小泡、空泡和致密顆粒形成突向管腔，胞核形狀不規(guī)則，充滿異染色質(zhì)。針對GOM化學(xué)性質(zhì)、來源和功能的研究是目前重點。Joutel等［1］在CADASIL患者腦組織中發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量為210×103的Notch3裂解產(chǎn)物沉積，但并未發(fā)現(xiàn)Notch3蛋白細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch3ICD），表明Notch3基因突變可破壞細胞表面Notch3蛋白細胞外結(jié)構(gòu)域（Notch3ECD）的清除，表明Notch3ECD是GOM的主要成分。晚近一項研究采用斑點免疫結(jié)合試驗（DIBA）在CADASIL患者皮膚組織勻漿中觀察到Notch3ECD沉 積 物［2］。晚 近 一 項CADASIL轉(zhuǎn) 基 因小鼠模型顯示，GOM沉積并非靜止過程，其大小、形態(tài)和數(shù)目不斷變化，位于管壁細胞管腔側(cè)的GOM隨疾病進展自最初的小圓形，逐漸演變至無定形的塊狀沉積物，導(dǎo)致基膜突起和管壁細胞凹陷［3］。還可在老年小鼠腦部微血管觀察到各時期形態(tài)的GOM共存，進一步證實GOM在CADASIL病程中是不斷演 變 的。Ruchoux等［4］制備CADASIL轉(zhuǎn)基 因 小 鼠模型，并在電子顯微鏡下無GOM沉積的血管觀察到血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞退行性變，表明CADASIL病程中Notch3基因產(chǎn)物積聚或GOM沉積對血管平滑肌細胞損傷均非必要條件，提示血管內(nèi)皮損傷可能發(fā)生于GOM沉積前。Pescini等［5］發(fā)現(xiàn)，CADASIL嚴(yán)重損傷血管平滑肌細胞，周細胞周圍的Notch3基因突變造成周細胞數(shù)目顯著減少，周細胞足突覆蓋毛細血管的范圍縮小，使與毛細血管接觸的星形膠質(zhì)細胞末端脫離微血管，神經(jīng)元?神經(jīng)膠質(zhì)細胞?血管單元整體受損，影響神經(jīng)血管耦合過程，表明CADASIL主要累及神經(jīng)血管單元（NVU）［6?7］。周細胞的退行性變破壞腦白質(zhì)微循環(huán)，導(dǎo)致纖維蛋白沉積和腦灌注減少，造成腦白質(zhì)功能障礙［8］，與血小板源性生長因子受體?β（PDGFR?β）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常相關(guān)，但周細胞覆蓋率的減少以及血?腦屏障破壞無法解釋腦白質(zhì)病變的相關(guān)機制［9］。此外，Notch3基因突變還上調(diào)微血管環(huán)境中纖維母細胞平滑肌蛋白的表達［10］，亦參與GOM形成和管壁增厚的病理生理學(xué)過程。Zellner等［11］采用免疫熒光染色在CADASIL患者腦血管中觀察到高溫需求因子A1（HTRA1，絲氨酸蛋白酶家族成員）與Notch3ECD沉積物的共定位，前者對維持血管完整性具有重要作用，缺乏HTRA1介導(dǎo)的細胞外基質(zhì)蛋白加工亦是血管病變的影響因素之一。

二、Notch3基因突變

CADASIL的致病基因為定位于19p13.2~13.1的Notch3，包含33個外顯子，編碼跨膜蛋白Notch3。目前報道的CADASIL相關(guān)Notch3基因突變多達200余種，多位于外顯子3和4，尤其常見于外顯子4。

1.CADASIL相關(guān)基因突變目前發(fā)現(xiàn)的CADASIL相關(guān)基因突變類型主要是錯義突變（95%），而框內(nèi)缺失、移碼缺失或剪接位點突變較少見。大多數(shù)突變可導(dǎo)致半胱氨酸殘基丟失或增加，產(chǎn)生奇數(shù)個半胱氨酸，未配對的半胱氨酸破壞正常的二硫鍵形成，導(dǎo)致受體錯誤折疊，形成Notch3聚集體。除半胱氨酸數(shù)目改變外，其他氨基酸變異也可能導(dǎo)致受體錯誤折疊。Arnardottir等［12］報告不涉及半胱氨酸的基因突變類型，導(dǎo)致其他氨基酸替換，并不改變表皮生長因子樣重復(fù)序列（EGFr）中半胱氨酸數(shù)目，但其致病作用尚不明確。Mizuno等［13］在兩個R75P突變家系中發(fā)現(xiàn)，Notch3蛋白結(jié)構(gòu)變化可能與脯氨酸替代有關(guān)，阻礙受體β?折疊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，亦有觀點認為上述突變可能是與CADASIL無關(guān)的多態(tài)性。研究顯示，累及半胱氨酸的Notch3突變體在普通人群中較預(yù)期的更普遍［14］，但其臨床意義目前尚不清楚。

2.基因突變類型與臨床表型的相關(guān)性Rutten等［15］發(fā)現(xiàn)，基因型與臨床表型的相關(guān)性取決于表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)構(gòu)域的突變位點：與EGFR7~34變異患者相比較，EGFR1~6變異患者腦卒中發(fā)病更早，MRI病變更加嚴(yán)重，生存率更低。Baron?Menguy等［16］在TgNotch3R169C小鼠 模 型中觀察到，與配體結(jié)合域中的突變相比，R169C及類似突變所對應(yīng)的臨床表型更嚴(yán)重，與既往認為的存在熱點突變患者較配體結(jié)構(gòu)域突變具有更嚴(yán)重的認知功能下降相吻合。晚近一項回顧性研究顯示，Notch3基因突變的致病性與突變位點有關(guān)［17］。Liu等［18］的橫斷面研究顯示，國人在Notch3表皮生長因子樣重復(fù)序列位點的基因突變在遺傳學(xué)上易患年齡相關(guān)的腦小血管病，且較之表皮生長因子樣重復(fù)序列保留的突變類型，對應(yīng)更明顯的腦白質(zhì)高信號和更高的疾病負擔(dān)。目前認為，遺傳和環(huán)境因素均可影響疾病進程，同一家族中甚至同卵雙生子之間也存在明確差異，表明除基因突變類型外，環(huán)境、生活習(xí)慣等因素對臨床表型的影響更甚，二者之間存在復(fù)雜的相互作用［19］。SQSTM1基因編碼一種多功能泛素結(jié)合蛋白SQSTM1/P62，參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激和自噬調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)，Notch3和SQSTM1致病性變異（p.Ser275Phefs*17）共存可能加重 疾 病 進 程［20］。但SQSTM1基 因 對CADASIL臨 床異質(zhì)性的作用尚不明確，需擴展到與CADASIL表型譜相關(guān)的其他基因行基因組學(xué)分析以進一步確定。

三、CADASIL分子機制

Notch3蛋白是Notch受體家族成員之一，由包含34個表皮生長因子樣重復(fù)序列的Notch3ECD和包含跨膜區(qū)域的Notch3ICD通過非共價連接而成。Notch蛋白與Delta/Jagged配體家族相結(jié)合，被解整合素?金屬蛋白酶（ADAM）和γ?分泌酶復(fù)合物裂解，后者釋放Notch3ICD，該結(jié)構(gòu)域位于胞核，與CSL DNA結(jié)合蛋白和MAML蛋白（核轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族成員）形成三聚體形式激活蛋白，將CSL蛋白從轉(zhuǎn)錄阻遏物轉(zhuǎn)化為激活物，激活Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游靶基因。Notch3受體激活導(dǎo)致依賴RBP?J的Notch靶基因（HES1、HELL、HRT1、HRT2等）表達上調(diào)，可能促進管壁細胞生長并調(diào)節(jié)其凋亡。

1.Notch3信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 異 常Peters等［21］發(fā) 現(xiàn)，Notch3基因突變位于配體結(jié)合位點時，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性明顯降低，抑制RBJ?Jκ等轉(zhuǎn)錄因子的激活；而配體結(jié)構(gòu)域以外位點突變時，與配體結(jié)構(gòu)域位點突變相比，Notch3ECD沉積無明顯變化。部分CADASIL突變體不影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Karlstr?m等［22］在R142C突變小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)完成S1裂解的Notch3蛋白減少，Notch3蛋白易在細胞內(nèi)聚集可能是由于分泌增加或傳導(dǎo)減慢，但Delta/Jagged配體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)無明顯異常。因此推測，CADASIL的發(fā)病機制并非僅是Notch3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。但CADASIL相關(guān)基因突變?nèi)绾斡绊慛otch3蛋白活性，目前尚無定論［23］，不同突變位點對Notch3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響不同。

2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和血管平滑肌細胞收縮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集誘發(fā)的細胞反應(yīng)，與心血管病血管功能障礙相關(guān)。除細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和加工外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還調(diào)控鈣離子釋放，促進線粒體代謝和細胞凋亡［24］。Ihalainen等［25］在CADASIL患者中觀察11種差異表達的蛋白質(zhì)，均參與蛋白降解和折疊、血管平滑肌細胞收縮和應(yīng)激。亦有研究顯示，Notch3蛋白錯誤折疊可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），使活性氧（ROS）含量增加，抑制細胞增殖，并上調(diào)錳超氧化物歧化酶（MnSOD）保護性代償，從而導(dǎo)致谷胱甘肽耗竭。由于泛素羧基末端水解酶L1（UCH?L1）無法識別突變的Notch3ECD，后者在血管平滑肌細胞表面進一步聚集，阻礙受體內(nèi)化和再循環(huán)。TgNotch3R169C小鼠模型顯示，CADASIL外周血管功能障礙與鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）/環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有關(guān)，其過程涉及Rho激酶（ROCK）和 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 應(yīng) 激［26］。Neves等［27］發(fā) 現(xiàn)，CADASIL患者血管平滑肌細胞活性氧含量增加，與其他腦小血管病研究結(jié)果相似［28］，認為Notch3蛋白激活誘導(dǎo)Nox5衍生的活性氧生成，誘發(fā)RhoA/Rho激酶與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相互作用，導(dǎo)致小血管內(nèi)皮功能障礙、內(nèi)皮依賴性血管舒張受損，使腦血管反應(yīng)性（CVR）降低，血管平滑肌細胞生長和細胞骨架重組等結(jié)構(gòu)改變亦與之相關(guān)。血管平滑肌細胞和血管損傷動物模型業(yè)已證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以促進Rho激酶激活［29］，小Rho家族GTP酶與多種細胞反應(yīng)有關(guān)，如細胞生長和凋亡。因此，將Notch3?Nox5/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路定義為調(diào)節(jié)CADASIL患者的血管信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的假定上游系統(tǒng)。此外，收縮蛋白水平升高提示血管平滑肌細胞收縮的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，Notch3ECD在細胞表面聚集可上調(diào)血管緊張素Ⅱ調(diào)節(jié)反饋通路，增強細胞對血管緊張素Ⅱ刺激的反應(yīng)，后者通過激活轉(zhuǎn)化生長因子?β（TGF?β）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進Ⅰ型膠原表達，這一過程可以解釋CADASIL腦小血管纖維化。

3.血管平滑肌細胞增殖分化與自噬異常近年研究發(fā)現(xiàn)，CADASIL發(fā)生發(fā)展過程中血管平滑肌細胞增殖速度明顯降低。Dziewulska等［30］通過尸檢發(fā)現(xiàn)，CADASIL患者血管平滑肌細胞有絲分裂呈不穩(wěn)定狀態(tài)，推測Notch3基因突變可能與其有絲分裂時相紊亂、細胞周期停滯、衰老及退化相關(guān)。Panahi等［31］的研究顯示，CADASIL患者血管平滑肌細胞TGF?β水平升高與血管平滑肌細胞增殖減少有關(guān)，并影響周圍其他血管成分增殖。此外，自噬異常也可以影響血管平滑肌細胞增殖、遷移和其他重要功能。Viitanen等［32］認 為，CADASIL患 者 血 管 平 滑 肌細胞線粒體功能減退、數(shù)目增加，增多的線粒體碎片使溶酶體功能超負荷，導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖減慢和細胞活性損害。Gatti等［33］發(fā)現(xiàn)，CADASIL患者腦血管內(nèi)膜含表達成熟平滑肌標(biāo)志物的細胞，究其原因，可能是由于動脈中膜平滑肌細胞（SMC）在血管損傷后成為內(nèi)膜細胞來源之一，平滑肌細胞中膜向內(nèi)膜細胞實現(xiàn)再分布，病理性增厚的內(nèi)膜主要由去分化的平滑肌細胞組成，平滑肌細胞表型從紡錘形向上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變，蛋白合成增加，自中膜向內(nèi)膜遷移［34］；另一可能的解釋是，此類內(nèi)膜細胞起源于多能血管干細胞，血管損傷使后者滲透至血管內(nèi)皮，再進入內(nèi)膜，在生長因子［血小板源性生長因子（PDGF）和細胞外基質(zhì)等］作用下，誘導(dǎo)分化合成平滑肌細胞［35］。相應(yīng)地，在分化的平滑肌細胞還可以觀察到PDGFR?β水平升高和絲狀肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)分 布 異常［36］。Hanemaaijer等［37］推 測，錯 誤 折 疊 的Notch3蛋白可能導(dǎo)致自噬機制失調(diào)：VSMCR133C可見Notch3蛋白表達和積累增加，而在自噬體?溶酶體融合中突變的Notch3基因與自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的共定位信號減弱，表明VSMCR133C自噬過程受限。Takahashi等［38］也得出相似結(jié)論，與野生型相比，突變型Notch3蛋白更易形成聚集體，該聚集體可部分抗降解，進而影響血管平滑肌細胞增殖。此外，VSMCR133C還可能通過改變細胞骨架結(jié)構(gòu)抑制噬溶酶體功能，導(dǎo)致自噬體?溶酶體融合缺陷和延遲［39］。外泌體分泌和自噬體?溶酶體途徑是協(xié)同參與異常蛋白質(zhì)清除的細胞反應(yīng)。Gao等［40］的研究顯示，CADASIL患者血漿外泌體數(shù)目較正常對照者顯著降低，且其降低幅度與腦白質(zhì)病變（WML）嚴(yán)重程度相關(guān)。

4.血流動力學(xué)改變Ling等［41］的研究顯示，廣泛的腦低灌注可能導(dǎo)致CADASIL中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。Dong等［42］在CADASIL患者腦 膜小動脈中觀察到內(nèi)膜增厚，但不影響管徑，平滑肌細胞樣細胞參與該過程，表明管壁增厚可能與管腔狹窄并無直接關(guān)系，因此，CADASIL腦低灌注可能歸因于其他血流動力學(xué)改變，如腦血管反應(yīng)性損害［43］、血?腦屏障破壞 等。de Boer等［44］的 研 究顯 示，CADASIL患 者內(nèi)皮依賴性血管平滑肌細胞舒張功能受損，基線腦血流量（CBF）減少、血管反應(yīng)性下降，影響乙酰唑胺的血管舒張反應(yīng)，提示其血流動力學(xué)儲備受損。Dabertrand等［45］在TgNotch3R169C小鼠模型腦 血 管中觀察到血管平滑肌細胞膜電位去極化和肌源性張力降低，推測與電壓門控性鉀離子通道（VGKC）數(shù)目增加有關(guān)，但是在腸系膜動脈中未見這一改變，提示CADASIL主要表現(xiàn)為腦血管病的可能基礎(chǔ)。外源性表皮生長因子受體激動劑肝素結(jié)合性表皮生長因子（HB?EGF）通過降低電壓門控性鉀離子通道數(shù)目以恢復(fù)肌源性張力，糾正腦血管功能障礙［46］。Capone等［47］認為，腦血管平滑肌細胞電壓門控性鉀離子通道數(shù)目增加是金屬蛋白酶組織抑制因子3（TIMP3）在血管外基質(zhì)中聚集所致，是導(dǎo)致腦血管功能障礙的關(guān)鍵因素，在TgNotch3R169C小鼠模型中加入外源性解整合素?金屬蛋白酶17（exogenous ADAM17）可以恢復(fù)腦動脈張力和血管反應(yīng)性。

綜上所述，Notch3蛋白及其下游靶標(biāo)的異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是CADASIL腦血管損傷和功能障礙的主要分子機制。突變型Notch3蛋白可以促進細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激以及RhoA/Rho激酶活化，抑制血管平滑肌細胞增殖，影響血管平滑肌細胞收縮、遷移等重要功能，導(dǎo)致CADASIL腦血管功能障礙。此外，血管平滑肌細胞自噬機制紊亂、增殖分化異常等表現(xiàn)，進一步解釋CADASIL的血管病理與皮膚活檢結(jié)果。截至目前，Notch3基因突變致CADASIL的分子機制仍是研究重點，不同基因突變類型的分子機制是否各異尚待進一步研究。

利益沖突無