王愛霞 王秀文 秦加陽 謝則平,2 于 波

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003；2 山東國際生物科技園發(fā)展有限公司；3 中國科學(xué)院微生物研究所 北京 100080

ε-聚賴氨酸(ε-Polylysine，ε-PL)是由L-賴氨酸的α-氨基和ε-羧基通過酰胺鍵連接而成的聚合物(圖1)，最早在1977年由日本學(xué)者Shima和Sakai在白色鏈霉菌發(fā)酵液中分離純化得到[1-2]。ε-PL是白色或淡黃色粉末，略有苦味，不穩(wěn)定，吸濕性強(qiáng)，極易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，因此多數(shù)以氫溴酸鹽的形式存在[3]。ε-PL通常是不同聚合度分子組成的混合物，一般由25～35個(gè)L-賴氨酸殘基聚合而成，因此沒有固定的熔點(diǎn)，當(dāng)溫度達(dá)到250℃以上開始軟化分解[3]。ε-PL具有抑菌譜廣、殺菌能力強(qiáng)、安全無毒、水溶性和熱穩(wěn)定性好、耐高溫且在酸和堿性環(huán)境中比較穩(wěn)定，同時(shí)具有生物可降解性和可食用性等優(yōu)良特性，因此，ε-PL已被美國、日本、韓國和中國等國批準(zhǔn)作為食品防腐劑[2-3]。此外，ε-PL還可以用作基因載體、減肥保健品、藥物載體、新型吸水材料、芯片及生物電子包被劑等[2-3]。

目前，ε-PL的主要生產(chǎn)方法是生物合成法，多采用微生物發(fā)酵法，本文將主要針對近五年來國內(nèi)外在ε-PL生物合成方面的研究進(jìn)行綜述，著重探討ε-PL生產(chǎn)菌株的新型育種方法以及ε-PL在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用新進(jìn)展，并對ε-PL研究的發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

1 ε-PL生產(chǎn)菌的篩選以及發(fā)酵策略

迄今最為經(jīng)典的ε-PL生產(chǎn)菌株的篩選方法是2002年日本學(xué)者Nishikawa和Ogawa發(fā)明的利用酸性染料Poly R-478的方法，該染料可與帶正電的ε-PL發(fā)生靜電相互作用從而使菌落周圍出現(xiàn)明顯的濃縮圈[4]。此后，亞甲基藍(lán)[5]、甲基橙[6]等染料相繼用于ε-PL生產(chǎn)菌株的篩選。近年來篩選得到的ε-PL生產(chǎn)菌株有小白鏈霉菌Streptomycesalbulus[7]、淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌Streptomycesdiastatochromogenes[8]、金霉素鏈霉菌Kitasatosporaaureofaciens[9]、地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis[10]和蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus[11-12]等。

為了提高ε-PL的產(chǎn)量，各種培養(yǎng)基優(yōu)化方法和發(fā)酵控制策略相繼得到利用。Ren等[13]利用Streptomycessp. M-Z18采用分階段pH控制的方法發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL，發(fā)酵前期控制pH為5，使菌絲快速生長，然后將pH降至3維持12 h提高菌絲代謝活性，最后將pH控制在4從而有利于ε-PL的積累，最終ε-PL的產(chǎn)量達(dá)到54.7 g/L。此后，Ren等[14]又采用向培養(yǎng)基中添加滑石粉微粒的方法進(jìn)一步將ε-PL的產(chǎn)量提高到62.36 g/L。Xu等[15]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%的正十二烷，控制發(fā)酵過程中溶解氧濃度在32%以上，最終ε-PL的產(chǎn)量達(dá)到30.8 g/L。Pan等[16]利用pH休克策略提高小白鏈霉菌以葡萄糖為底物時(shí)ε-PL的產(chǎn)量，最終的產(chǎn)量和體積生產(chǎn)效率分別達(dá)到32.22 g/L和5.86 g/L/d，比常規(guī)發(fā)酵提高32.3%和36.6%。Bhattacharya等[10]利用中心網(wǎng)絡(luò)模型方法優(yōu)化培養(yǎng)基，使地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的產(chǎn)量提高了196.7%。Guo等[8]以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 6#-7作為研究對象，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的濃度，使ε-PL的產(chǎn)量達(dá)到25.5 g/L，比初始產(chǎn)量提高了56.4%。Yan等[17]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加谷胱甘肽(GSH)，降低菌體內(nèi)活性氧(ROS)水平，使ε-PL最高產(chǎn)量達(dá)到46.5 g/L。

2 ε-PL合成酶和降解酶的研究進(jìn)展

2.1 ε-PL合成酶(Pls) 1983年，Shima等[18]利用同位素技術(shù)證明了L-賴氨酸是ε-PL合成的前體；此后，直到2003年，Kawai等[19]利用無細(xì)胞體系實(shí)現(xiàn)了ε-PL的合成，他們發(fā)現(xiàn)合成活性在細(xì)胞膜上，該酶活性依賴于ATP且不受核糖核激酶、卡那霉素、氯霉素影響，這些研究結(jié)果說明ε-PL合成是一個(gè)膜蛋白催化的反應(yīng)。2008年，Yamanaka等[20]從小白鏈霉菌S.albulusNBRC14147中純化了ε-PL合成酶，發(fā)現(xiàn)該酶分子量為130 kDa，是一個(gè)不尋常的非核糖體肽合成酶，具有腺苷酸化和硫醇化結(jié)構(gòu)域，沒有傳統(tǒng)肽合成酶的縮合或硫酯酶結(jié)構(gòu)域，有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域圍繞三個(gè)串聯(lián)可溶結(jié)構(gòu)域，這些串聯(lián)結(jié)構(gòu)域使用游離L-賴氨酸聚合物(或初始反應(yīng)中的單體)作為受體和Pls結(jié)合的L-賴氨酸作為供體不斷催化L-賴氨酸聚合，直接產(chǎn)生不同長度的鏈。隨后，Geng等[21]在變鉛青鏈霉菌S.lividans中異源表達(dá)了來自S.albulus的Pls并實(shí)現(xiàn)了ε-PL的生產(chǎn)，進(jìn)一步證明了Pls在ε-PL合成中的功能。Hamano等[22]發(fā)現(xiàn)ε-PL肽鏈的長度受到Pls跨膜區(qū)連接DNA序列的影響。

Wang等[23]研究ε-PL生物合成過程中發(fā)現(xiàn)一個(gè)對pH變化非常敏感的σ因子(HrdD)，并利用凝膠遷移實(shí)驗(yàn)證明HrdD能夠與Pls的啟動子序列結(jié)合，因而很可能參與調(diào)控Pls的表達(dá)。Xu等[9]報(bào)道了一株含有特殊Pls的金霉素鏈霉菌，其生產(chǎn)的ε-PL分子量僅為1.3～2.3 kDa，明顯小于25～35個(gè)賴氨酸聚合所得ε-PL的分子量(3.2～4.5 kDa)，他們發(fā)現(xiàn)低分子量的ε-PL對酵母菌的抑菌效果更好，在小白鏈霉菌中異源表達(dá)該P(yáng)ls后，低分子量ε-PL的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了23.6 g/L。

2.2 ε-PL降解酶(Pld) 除了Pls外，另外一個(gè)和ε-PL生物合成直接相關(guān)的酶是ε-PL降解酶。在產(chǎn)生和耐受ε-PL的微生物中均檢測到了Pld活性，因此，Pld在ε-PL降解和ε-PL生產(chǎn)者的自我保護(hù)中起著重要作用。2002年，Kito等[24]從ε-PL生產(chǎn)菌株S.albulus中純化得到了Pld，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白是個(gè)膜蛋白，其降解ε-PL模式是外切型，即從ε-PL的N-端開始一個(gè)一個(gè)的切下賴氨酸。2006年，Hamano等[25]從S.albulus中分離純化得到Pld并對其進(jìn)行分子克隆與功能分析，并構(gòu)建了ε-PL降解酶失活敲除菌株，研究突變菌株降解酶活性、ε-PL敏感性以及產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)ε-PL降解酶基因失活對菌株影響較小，且認(rèn)為該段基因編碼的ε-PL降解酶在避免ε-PL毒性效應(yīng)中起到一定作用。同時(shí)，菌株也存在其它ε-PL降解酶。2010年，Yamanaka等[26]在S.albulusNBRC14147中發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)ε-PL降解酶PldII，敲除該酶的編碼基因后突變株對ε-PL的降解活性大幅降低，說明PldII是主要的ε-PL降解酶。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，降解活性的降低不會影響所產(chǎn)生的ε-PL的鏈的長度，說明ε-PL的聚合度是由Pls決定的。他們還發(fā)現(xiàn)，Pls的催化功能是受胞內(nèi)ATP的水平調(diào)控的，高濃度的ATP是Pls完整酶活性所必需的，酸性pH環(huán)境并非能抑制Pld活性，而是胞內(nèi)積累ATP所必需的。

3 新型育種方法在ε-PL生產(chǎn)中的應(yīng)用

近年來，以核糖體工程、基因組重排、代謝工程為代表的新型育種方法逐漸應(yīng)用于ε-PL生產(chǎn)菌株的改造。

3.1 核糖體工程 核糖體工程是利用各類抗性突變?yōu)楹Y選標(biāo)記，高效獲得次生代謝產(chǎn)物合成能力提高突變株的微生物定向育種新方法[27]。Wang等[28]通過等離子誘變技術(shù)和鏈霉素抗性篩選技術(shù)進(jìn)行育種篩選，獲得一株小白鏈霉菌突變菌株AS3-14，ε-PL的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到41.2 g/L，比出發(fā)菌株提高了68.1%。吳光耀等[29]利用核糖體工程方法選育了小白鏈霉菌鏈霉素和利福平雙重抗性突變株，在搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵ε-PL產(chǎn)量的分別達(dá)到3.7 g/L和53.0 g/L，較出發(fā)菌株分別提高了42.3%和32.5%。Wang等[30]利用物理和化學(xué)方法進(jìn)行誘變，選育了慶大霉素和利福平雙重抗性突變菌株albulusSG-31，ε-PL的產(chǎn)量和體積生產(chǎn)效率分別達(dá)到了59.5 g/L/d和8.21 g/L/d，比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高138%和105%。賴永勤等[31]選育Streptomycessp. XAY6作為出發(fā)菌株，通過利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變育種和核糖體工程技術(shù)，發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到2.096 g/L，比原始菌株提高118.6%。

3.2 基因組重排 基因組重排是在傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過多親本之間的DNA重組和全基因組片段交換，從而獲得優(yōu)良性狀菌株的方法[32]。Li等[33]采用基因組重排和原生質(zhì)體融合技術(shù)，得到一株突變株Streptomycessp. FEEL-1，其發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)24.5 g/L，比野生菌株提高81%。Zhou等[34]利用基因組重排技術(shù)對ε-PL耐受菌進(jìn)行篩選，獲得了一株突變重組菌株Streptomycessp. F4-22，其產(chǎn)量達(dá)到39.96 g/L，比野生菌株提高32.7%。Wang等[35]通過基因組重排和慶大霉素抗性技術(shù)進(jìn)行菌株選育，獲得一株突變菌株S.albulusAG3-28，其ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到56.5 g/L，比出發(fā)菌株提高50%。趙俊杰等[36]利用抗性篩選和基因組重排技術(shù)將小白鏈霉菌在搖瓶中的產(chǎn)量提高了70.63%。

3.3 代謝工程 代謝工程是利用基因重組技術(shù)有目的地對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾和改造，從而使目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最大化的一類方法[37]。Pls是ε-PL合成途徑中的關(guān)鍵酶，過量表達(dá)Pls有望提高ε-PL的產(chǎn)量，然而多次嘗試?yán)媒M成型啟動子過量表達(dá)Pls的研究均告失敗[9,21,38]。本實(shí)驗(yàn)室利用小白鏈霉菌組成型啟動子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了Pls基因的過量表達(dá)，同野生菌株相比，過表達(dá)菌株發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的產(chǎn)量提高了200%以上[39]。

賴氨酸是ε-PL合成的原料，提高胞內(nèi)賴氨酸的濃度是提高ε-PL產(chǎn)量的又一策略。賴氨酸在細(xì)胞內(nèi)合成的途徑是天冬氨酸途徑，這一途徑中有兩個(gè)關(guān)鍵酶：天冬氨酸激酶(Ask)和天冬氨酸半醛脫氫酶(Asd)。其中，Ask負(fù)責(zé)將L-天冬氨酸磷酸化為L-4-磷酸天冬氨酸，Hamano等[40]發(fā)現(xiàn)S.albulus的Ask受到部分反饋抑制調(diào)節(jié)，于是他們構(gòu)建了完全不受反饋抑制調(diào)節(jié)的突變蛋白rAsk(M68V)，在S.albulusCR1中表達(dá)了突變蛋白rAsk，結(jié)果ε-PL的產(chǎn)量由11 g/L提高到15 g/L。

溶氧是影響ε-PL代謝途徑的關(guān)鍵因素之一，Xu等[41]將透明顫血紅蛋白基因(VHb)整合到S.albulusPD-1染色體上，減輕發(fā)酵過程中氧氣的限制，最終ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量從22.7 g/L提升到34.2 g/L。Gu等[42]將透明顫血紅蛋白基因和腺苷蛋氨酸合成酶基因插入到S.albulusNK660染色體上表達(dá)，ε-PL的產(chǎn)量提高了26.67%，生物量提高了14.57%。

氮源是限制ε-PL合成的另一個(gè)關(guān)鍵因素，每分子賴氨酸含有兩個(gè)氮原子，因此，胞內(nèi)賴氨酸的合成需要氮源較大，為了解決這個(gè)問題，Xu等[43]在S.albulusPD-1中過量表達(dá)了其自身的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因amtB，發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳氮比由3提高到了4.71，ε-PL的產(chǎn)量則由22.7 g/L提升到35.7 g/L。

4 ε-PL在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

ε-PL在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括：新型抑菌材料、藥物載體和核酸載體等。

4.1 新型抑菌材料 由于ε-PL具有良好的抑菌能力、食品安全性和生物可降解性，含有ε-PL的新型抑菌材料得到廣泛開發(fā)。在再生醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，竇源東等[44]發(fā)明了一種抗菌性陽離子ε-PL改性的可吸收硬腦脊膜修復(fù)材料，該修復(fù)材料具有優(yōu)異的抑菌特性，可有效預(yù)防術(shù)后顱內(nèi)感染，同時(shí)既可直接貼附又可縫合使用。在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，林前鋒等[45]制備了一種聚賴氨酸復(fù)合水凝膠，該水凝膠通過燈盞花素、聚賴氨酸和氮摻雜石墨烯的有效結(jié)合，可加速創(chuàng)面?zhèn)诘挠?，具有止血、抑菌和從根源上抑制瘢痕形成的特點(diǎn)；徐虹等[46]制備了一種ε-PL-對羥基苯丙酸抗菌水凝膠敷料，該水凝膠敷料抑菌效果好，能有效防止傷口感染，且具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性。此外，ε-PL還被用來制作仿生抑菌膜[47]、口腔潰瘍貼膜[48]、復(fù)合抗菌涂層[49]等。

4.2 藥物載體 臨床上抗腫瘤化療藥物如紫杉醇、長春新堿、阿霉素及喜樹堿等存在著水溶性差、毒副作用大及無靶向性等問題。ε-PL水溶性高、生物相容性好、體內(nèi)可被降解等特點(diǎn)使其在藥物載體領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。申有青等[50]利用ε-PL制備了一種兩親性聚乙二醇—ε-PL/異硫氰酸酯鍵合物納米膠束，該納米膠束載藥率高、粒徑小、體內(nèi)穩(wěn)定、系統(tǒng)毒性小且循環(huán)時(shí)間長，可作為安全高效的疏水性藥物的遞送載體。張靜等[51]發(fā)明了一種具有電荷翻轉(zhuǎn)及靶向功能的ε-PL納米前藥膠束，該納米膠束以疏水性藥物為內(nèi)核，β-羧基酰胺化的ε-PL鏈為殼層，兼具主動、被動靶向等特點(diǎn)以及pH響應(yīng)性能，在腫瘤靶向藥物的制備中有著良好的應(yīng)用潛力。蘇文全等[52]發(fā)明了一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的雙鏈聚核苷酸—ε-PL—硫酸聚糖復(fù)合物，該類復(fù)合物與抗原物組成的免疫原組合物可用于預(yù)防、治療微生物感染、抗腫瘤等用途。此外，在藥物載體制備方面，以ε-PL為原料，張魯中等[53]制備了一種載有治療因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子的納米微球，白鋼等[54]發(fā)明了一種多用途ε-PL熒光自組裝載藥納米微球。

4.3 核酸載體 缺乏高效安全的載體是目前臨床基因治療面臨的最大挑戰(zhàn)之一，非病毒載體—陽離子聚合物是其中很有希望的一類載體。袁曉燕等[55]制備了一種包括葡聚糖、ε-PL和靶向平滑肌細(xì)胞的多肽VAPG的核酸載體，可以保護(hù)核酸藥物靶向進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)63.2%，降低了對其他細(xì)胞的生物毒性，在生物醫(yī)用基因治療領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。楊波等[56]發(fā)明了一種水溶性和穩(wěn)定性極佳、沒有毒副作用的新型ε-PL—聚乙烯亞胺-β-環(huán)糊精聚合物，其中β-環(huán)糊精的空腔可以包裹水溶性差的藥物以增加其水溶性，聚乙烯亞胺可與外源DNA凝聚形成納米粒，該新型聚合物在藥物載體和基因載體領(lǐng)域都有很高的應(yīng)用潛能。此外，以ε-PL為原料，程義云等[57]發(fā)明了一種脂環(huán)化合物修飾的高分子材料，戴箭等[58]制備了一種改性陽離子聚氨基酸，兩者均可用作核酸載體。

5 前景展望和未來研究重點(diǎn)

近五年來，國內(nèi)ε-PL生產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵工藝研究取得了較大的突破，ε-PL的產(chǎn)量和體積生產(chǎn)效率已達(dá)到或超過世界先進(jìn)水平，但除少數(shù)研究外[59]，多數(shù)停留在菌株選育和工藝優(yōu)化階段，對菌株高產(chǎn)機(jī)制的探索不夠深入。因此，非常有必要利用比較基因組、比較轉(zhuǎn)錄組等方法解析菌株高產(chǎn)的機(jī)制，為利用基因工程、代謝工程等方法進(jìn)一步提高菌株的生產(chǎn)能力提供理論支持。

L-賴氨酸是ε-PL合成的前體，ε-PL合成酶是將L-賴氨酸轉(zhuǎn)化為ε-PL的關(guān)鍵酶，因此，如何提高胞內(nèi)L-賴氨酸的濃度、增強(qiáng)ε-PL合成酶的活力是下一步高產(chǎn)菌株構(gòu)建的重點(diǎn)研究方向之一。提高胞內(nèi)L-賴氨酸濃度的方法包括增強(qiáng)L-賴氨酸的合成、減少L-賴氨酸的降解、增加L-賴氨酸從胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、減少L-賴氨酸的外排等[60]。增強(qiáng)ε-PL合成酶活力的方法有基因的過量表達(dá)和酶的定向進(jìn)化，Bai等[61]測試了鏈霉菌中200余種啟動子和200余種核糖體結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)度，不同的排列組合有望得到更高的ε-PL合成酶基因表達(dá)強(qiáng)度。

雖然國內(nèi)浙江新銀象、江蘇一鳴等生物技術(shù)公司相繼建立了ε-PL的工業(yè)生產(chǎn)線，但仍存在產(chǎn)品用途開發(fā)不足、產(chǎn)品同質(zhì)化等問題。目前，ε-PL的主要用途雖然是食品防腐劑，但其在新型抑菌材料、藥物載體和核酸載體等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛能，醫(yī)藥領(lǐng)域極有可能成為未來ε-PL應(yīng)用研究的主要增長點(diǎn)。